Sequence analysis on mitochondrial (mtDNA)Cyt b genes in Pseudosciaena crocea, Miichthys miiuy and Sciaenops ocellatus
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摘要:
利用PCR技术对大黄鱼Pseudosciaena crocea、
The complete sequences of cytochrome b (Cyt b)genes in Pseudosciaena crocea and Scioenops ocellatus, and the partial sequence of cytochrome b (Cyt b) gene in Miichthys miiuy were amplified using PCR technology. The PCR products were sequenced directly. 1 140 bp fragments of Cyt b genes in P.crocea and S.ocellatus, and 1 125 bp fragment of Cyt b gene in M.miiuy were obtained. Comparing obtained sequences, the comparability similarity of three sequences was 91.49%. Information of the base composition and the mutation sites were obtained. The difference of three sequences was obvious. The results contributed not only genetic data to economic utilization of three species but also scientific basis to analysis of genetic diversity in China Sea. Moreover, molecular phylogenetic tree of the Cyt b DNA sequences in the three species was reconstructed with the NJ method based on the inherited distance and the result showed that the inherited distance between the M.miiuy and the S.ocellatus was small.
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Keywords:
- Preudosciaena crocea /
- Miichthys miiuy /
- Sciaenops ocellatus /
- mitochondrial DNA(mtDNA) /
- Cyt b gene
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方斑东风螺(Babylonia areolata)，俗称花螺，属软体动物门(Mollosca)，腹足纲(Gastropoda)，前腮亚纲(Prosobranchia)，新腹足目(Neogastropda)，蛾螺科(Buccinidae)，分布于泰国沿海、中国的东南沿海、台湾海峡、以及日本浅海海域[1]。近年来，由于人们对方斑东风螺的过度捕捞，其自然种群数量已大为减少，为了保护自然资源和满足人们的生活需求，已经开展了一定规模的人工养殖。但在养殖过程中因对其所适宜的环境因子(如盐度等)还没有明确认知，所以因外界环境因子的剧变而导致生产中出现了大批死亡的现象经常发生，给生产带来巨大的影响。对海产贝类来说，在一定的温度下，盐度是影响其生长存活的重要环境因子之一，国内外许多学者对这方面进行了研究[2-6]。在东风螺方面，郑怀平等[4]研究了温盐度对波部东风螺(B.formosae)胚胎发育的影响，罗杰等[7]研究了酸碱度、盐度对方斑东风螺孵化率的影响，杨章武等[8]研究了不同环境条件对方斑东风螺幼螺生长、存活的影响，吴进锋等[9]对温度与盐度对方斑东风螺胚胎发育及幼虫生长的影响进行了研究。但有关养殖方斑东风螺对盐度适应性的研究尚未见报道，由于方斑东风螺的人工养殖一般在池塘中进行，这些养殖场地常设在沿岸池塘或海湾滩涂，容易受雨水的影响引起盐度变化而导致大批死亡，特别是在雨水偏多的季节，这种影响则会更加明显。因此，开展不同盐度对方斑东风螺存活及生长影响的研究，可为方斑东风螺养殖生态研究提供科学依据，并对生产实践具有重要的指导意义。
1. 材料与方法
1.1 材料
试验用螺来自遂溪县草潭镇长洪村东风螺养殖户同一池塘同一批种苗养殖而成、活力正常的养殖群体，经室内实验容器暂养1周后随机抽取30个个体进行测量，得出壳高为3.1±0.23 cm，壳宽为1.9±0.15 cm，体重为6.0±0.8 g(注：我国南方池塘养殖的成品螺规格平均为7~10 g · 粒-1，此试验所采用的样品螺处于该螺的大规格幼贝期)。该批螺原生境盐度28.8，温度28.3℃，底质泥沙，生产该批螺苗的亲螺来自北部湾海域，该海域周年盐度变化在28.0~30.1。此试验地点位于遂溪县草潭镇长洪对虾种苗生产基地。
1.2 方法
1.2.1 试验方案
试验在室内自然光下进行。根据预实验结果，在120 h内导致100%死亡的盐度范围内设置15个盐度梯度进行试验，以求出120 h 50%致死临界盐度——即生存临界盐度。盐度设定分别为9.2、12.0、14.8、17.6、20.4、23.2、26.0、28.8、31.6、34.4、37.2、40.0、42.8、45.6和48.4，每个盐度梯度设3个重复组。其中盐度组28.8为原自然海水盐度，作为对照。低盐度梯度是通过向过滤海水中加经曝气的淡水配制；高盐度梯度是通过向过滤海水中加人工海水精配制。方斑东风螺在进入各梯度组之前，均经过±2 · h-1的盐度渐变过程，直到渐变至相应的梯度组，开始试验计时。
1.2.2 日常管理
每天晚上7: 00投饵一次，饵料为波纹巴非蛤肉，投饵量以第2天早晨8: 00有少量残饵为好，保证各组有充足的摄食；每天上午8: 30拣除残饵并全换水一次，同时把沙面冲洗干净；发现死螺及时拣除并做好记录，换水前测氨氮(NH3-N)，化学耗氧量(COD)，pH值；每天上午8: 00和下午3: 00各测水温一次；24 h充气，保证充气均匀一致。试验时间为21 d(6月21~7月11日)，试验过程测得各组理化指标NH3-N＜0.05 mg · L-1，COD＜2 mg · L-1，pH值7.6~8.3，水温为28.2~29.7℃。试验结束时，统计各组螺的存活率和壳高、宽及体重日增长率。
1.3 数据测定与处理
1.3.1 成活率及相对成活率的测定
成活率(RS) = (成活数/总数) ×100%；相对成活率(P) = (实际观察存活率/对照组存活率) ×100%。死亡的界定以针刺腹足无反应为标准。
1.3.2 生存临界盐度及生存最适盐度的界定
此试验在120 h后即试验第6天至第21天期间各组个体都不再出现死亡，因此，采用120 h作为该螺50%出现死亡的考察时间。以120 h时内令该螺50%死亡的盐度(记为120 h LS50)作为生存临界盐度，高低两端生存临界盐度之间的盐度范围则为该螺的生存盐度范围。临界盐度采用二点法计算[2]，公式为120 h LS50=S1+ [(P1-50%) / (P1-P2)] × (S2-S1)，其中S1、S2分别为存活率接近50%的高低端盐度，P1、P2为相应的相对存活率。把经过多重比较无明显差异的存活率最高的几个试验组对应的盐度作为最适生存盐度。
1.3.3 壳高、壳宽及体重日增长率的测定
试验结束时，测定各组的平均壳高(H1)、壳宽(B1)和体重(W1)，并与初始壳高(H0)、壳宽(B0)及体重(W0)相比较。
平均壳高日增长率(RH，mm · d-1)的计算公式为RH=(H1-H0) / (t1-t0)；
平均壳宽日增长率(RB，mm · d-1)的计算公式为RB=(B1-B0) / (t1-t0)；
平均体重日增长率(RW，mg · d-1)的计算公式为RW=(W1-W0) / (t1-t0)。
式中t1和t0分别为实验结束和开始时的时间。壳高、壳宽测量采用游标卡尺，体重测量时用滤纸吸干壳表水分，再用感量为0.1 mg的SHIMADZU AUY120电子天平进行称重。死亡个体的体长、体宽及体重视为与初始数值相等，增长率视为零。
1.3.4 生长临界盐度和生长最适盐度的界定
此研究的生长指标包括壳高、壳宽和体重3个方面，生长适宜及最适盐度是上述3指标适宜及最适增长盐度的重叠部分。生长临界盐度定义为实验期间壳高、壳宽及体重日增长率为最快一组日增长率的30%所对应的盐度，其范围则为壳高、壳宽及体重生长适宜盐度(其求法同样采用二点法)。最适增长盐度定义为经过多重比较无显著差异的生长最好的几个试验组所对应的盐度范围[2]。
1.3.5 数据处理
试验数据采用平均数±标准差(Mean±SD)表示，使用SPSS 13.0分析软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，并结合Duncan法进行多重比较，检验处理间的差异显著性(P < 0.05)。
2. 结果与分析
2.1 生存临界盐度和生存最适盐度
试验结果如表 1、表 2和图 1所示。从表 1、2看出，单因素方差分析结果表明，盐度变化对方斑东风螺的成活产生了显著的影响(P<0.05)，在盐度9.2时96 h内全部死亡，在盐度48.4时120 h内全部死亡；120 h半数致死盐度(120 h LS50)低端在17.6~20.4之间，高端在40~42.8之间，采用二点法计算出120 h LS50低端为19.18，高端为41.39，即方斑东风螺的适宜生存盐度范围为19.18~41.39。
表 1 低盐端方斑东风螺死亡情况及存活率Table 1. The mortality and survival rate of B.areolata at different low salinities盐度salinity 9.2 12.0 14.8 17.6 20.4 23.2 26.0 28.8* 1std 8.00±1.00 7.33±0.58 7.67±0.58 4.67±0.58 5.33±1.15 3.67±0.58 0 0 2ndd 9.33±0.58 8.33±0.58 4.33±0.58 5.67±0.58 3.67±1.00 2.67±0.58 0.33±0.58 0 3thd 7.33±0.58 5.00±1.00 6.33±0.58 4.33±0.58 2.67±0.58 1.67±0.58 0 0.33±0.58 4thd 5.33±0.58 4.33±0.58 4.33±0.58 2.67±0.58 0 0 0 0 5thd 0 3.33±0.58 3.33±0.58 2.33±0.58 0 0 0 0 6thd 0 0 0 0 0 0 0 0 7thd 0 0 0 0 0 0 0 0 累计死亡个数/个
the total death30.00 28.67±1.15 26.00±1.73 19.67±0.58 11.67±0.58 8.00±1.00 0.33±0.58 0.33±0.58 平均存活率/%
average survival rate0 5.56±0.58 13.33±1.00 34.44±1.93 61.11±1.92 73.33±3.34 98.89±0.64 98.89±0.64 平均相对存活率/%
average relative survival rate0 5.62f±0.59 13.48e±1.01 34.83d±1.95 61.80c±1.94 74.15b±3.38 100.00a±0.65 100.00a 注：*. 26.0~34.4盐度梯度之间试验组与对照组无差异，表中省略；同行数据右上标有不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，下同
Note：*. When the salinity between 26.0~34.4, there was no difference between the natural seawater group and control group, leave out in the chart; Values in the same line with different superscripts were significantly different from each other(P < 0.05), the same below.表 2 高盐端方斑东风螺死亡情况及存活率Table 2. The mortality and survival rate of B.areolata at high salinities盐度salinity 31.6 34.4 37.2 40 42.8 45.6 48.4 28.8* 1std 0 0 3.67±0.58 5.00±1.00 8.00±1.00 8.00±1.00 7.33±0.58 0 2ndd 0 0.67±0.58 2.33±0.58 3.67±1.15 5.67±0.58 8.00±1.00 8.67±0.58 0 3thd 0.33±0.58 0 1.00 2.33±0.58 5.33±0.58 6.33±0.58 7.33±0.58 0.33±0.58 4thd 0 0 0 0 0 4.33±0.58 4.33±0.58 0 5thd 0 0 0 0 0 5 2.33±0.58 0 6thd 0 0 0 0 0 0 0 0 7thd 0 0 0 0 0 0 0 0 累计死亡个数/个
the total death0.33±0.58 0.67±0.58 7.00±1.00 11.00±1.41 19.00±1.41 26.33±0.58 30.00 0.33±0.58 平均存活率/%
average survival rate98.89±0.64 97.78±1.92 76.67±3.34 63.33±4.70 36.67±4.70 11.11±1.92 0 98.89±0.64 平均相对存活率/%
average relative survival rate100.00a±0.65 98.88a±1.94 77.53b±3.38 64.04c±4.75 37.08d±4.75 11.23e±1.94 0 100.00a ![]()
图 1 不同盐度下方斑东风螺相对存活率的变化Figure 1. Average relative survival rate of B.areolata at different salinities在适宜生存盐度范围内，对各盐度组的平均相对成活率进行多重比较，结果显示，盐度为26.0、28.8、31.6、34.4的4个试验组成活率差异不显著，即盐度在26.0~34.4范围内变化对该螺的成活无显著影响，可以认为该螺的最适生存盐度为26.0~34.4，超出此范围，该螺成活率将随着盐度向两极升降而明显降低。
2.2 适宜生长盐度和最适生长盐度
2.2.1 不同盐度与体重增长的关系
不同盐度下方斑东风螺体重增长情况如表 3、图 2。通过对该螺体重日增长率进行单因素方差分析，结果表明盐度变化对其产生了显著的影响(P < 0.05)。同时可以看出，按此方法，体重增长临界盐度低端位于14.8~17.6之间，高端位于40.0~42.8之间，采用二点法求得低端为15.96，高端为41.58，即方斑东风螺的适宜体重增长盐度范围为15.96~41.58；此外，多重比较得出方斑东风螺最适体重增长盐度为26.0~31.6。
表 3 不同盐度对方斑东风螺体重增长的影响Table 3. Effect of salinity on the growth of body weight of B.areolata盐度
salinity平均日增长率/%
average daily growth rate体重净增长/mg
net growth of body weight9.2 0 0 12.0 0.23f±0.05 4.83f±1.05 14.8 0.24f±0.05 5.04f±1.05 17.6 0.63e±0.03 13.23e±0.63 20.4 0.84d±0.03 17.64d±0.63 23.2 0.97c±0.03 20.37c±0.63 26.0 1.31a±0.05 27.51a±1.05 28.8 1.34a±0.04 28.14a±0.84 31.6 1.33a±0.03 27.93a±0.63 34.4 1.10b±0.03 23.00b±0.63 37.2 0.98c±0.05 20.58c±1.05 40.0 0.65e±0.03 13.65e±0.63 42.8 0.26f±0.03 5.46f±0.63 45.6 0.24f±0.04 5.04f±0.84 48.4 0 0 注：同列数据右上标有不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)
Note：Values in the same column with different superscripts were significantly different from each other(P<0.05).![]()
图 2 不同盐度与方斑东风螺体重净增长的关系Figure 2. Relationship of salinity with net growth of body weight for B.areolata2.2.2 不同盐度梯度与壳高增长的关系
不同盐度梯度对方斑东风螺壳高增长的影响见表 4、图 3。对该螺壳高日增长率进行单因素方差分析，结果表明，不同盐度对其产生了显著的影响(P < 0.05)。同时可以看出，按此方法，壳高增长临界盐度低端位于位于17.6~20.4之间，高端位于40.0~42.8之间，采用二点法求得低端为17.91，高端为42.50，即方斑东风螺适宜壳高增长的盐度界限为17.91~42.50；此外，多重比较得出最适宜方斑东风螺壳高增长的盐度界限为26.0~31.6。
表 4 不同盐度对东风螺壳高增长的影响Table 4. Effect of salinity on shell height growth of B.areolata盐度
salinity平均日增长率/%
average daily growth rate壳高净增长/μm
net growth of shell height9.2 0 0 12.0 3.20f±0.5 67.20f±10.5 14.8 3.40f±0.3 71.40f±6.3 17.6 8.25e±0.5 173.25e±10.5 20.4 9.35d±0.3 196.40d±6.3 23.2 20.50c±0.3 430.50c±6.3 26.0 27.30a±0.5 573.30a±10.5 28.8 27.90a±0.3 585.20a±6.3 31.6 27.50a±0.4 577.50a±8.4 34.4 23.20b±0.6 486.80b±12.6 37.2 20.30c±0.5 426.30c±10.5 40.0 9.73d±0.5 204.30d±10.5 42.8 8.22e±0.3 172.62e±6.3 45.6 3.30f±0.4 69.30f±8.4 48.4 0 0 注：同列数据右上标有不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)
Note：Values in the same column with different superscripts were significantly different from each other(P < 0.05).![]()
图 3 不同盐度对方斑东风螺壳高净增长的影响Figure 3. Relationship of salinity with net growth of shell height of B.areolata2.2.3 不同盐度梯度与壳宽增长的关系
不同盐度梯度对方斑东风螺壳宽增长的影响见表 5、图 4，通过对该螺壳宽日增长率进行单因素方差分析，结果表明，不同盐度对其产生了显著的影响(P < 0.05)。同时可以看出，按此方法，壳宽增长临界盐度低端位于17.6~20.4之间，高端位于37.2~40.0之间，采用二点法求得低端为19.28，高端为39.96，即方斑东风螺适宜壳宽增长的盐度界限为19.28~39.96；此外，多重比较得出最适宜方斑东风螺壳宽增长的盐度界限为26.0~31.6。
表 5 不同盐度对方斑东风螺壳宽增长的影响Table 5. Effect of salinity on the growth of shell width of B.areolata盐度
salinity平均日增长率/%
average daily growth rate壳宽净增长/μm
net growth of shell broad9.2 0 0 12.0 0.22e±0.05 4.62e±1.05 14.8 0.23e±0.03 4.83e±0.63 17.6 0.57d±0.05 11.97d±1.05 20.4 0.60d±0.05 12.60d±1.05 23.2 1.58b±0.05 33.18b±1.05 26.0 1.91a±0.04 40.11a±0.84 28.8 1.96a±0.05 41.09a±1.05 31.6 1.93a±0.04 40.46a±0.84 34.4 1.62b±0.05 34.02b±1.05 37.2 1.18c±0.03 24.78c±0.63 40.0 0.58d±0.05 12.18d±1.05 42.8 0.24e±0.03 5.04e±0.63 45.6 0.23e±0.04 4.83e±0.84 48.4 0 0 注：同列数据右上标有不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)
Note: Values in the same column with different superscripts were significantly different from each other(P < 0.05).![]()
图 4 不同盐度对方斑东风螺壳宽净增长的影响Figure 4. Effect of salinity on the net growth of shell width of B.areolata2.2.4 3个生长指标盐度适应性对比
从表 6可以看出，3个生长指标的最适生长盐度范围相同，均为26.0~31.6，由此可以确定方斑东风螺的最适生长盐度为26.0~31.6；体重和壳高2个生长指标的适宜盐度范围较为宽广，分别为15.96~41.58，17.91~42.50，适宜壳宽生长的盐度范围较为狭窄为19.28~39.96，按此研究方法，方斑东风螺适宜生长盐度为19.28~39.96。
表 6 方斑东风螺3个生长指标盐度适应性对比Table 6. Comparison of the three growth indexes for B.areolata at different salinities项目
item最适增长盐度
in optimal salinities适宜增长盐度
in suitable salinities体重增重/mg
body weight growth26.0~31.6 15.96~41.58 壳高增长/μm
shell height growth26.0~31.6 17.91~42.50 壳宽增长/μm
shell width growth26.0~31.6 19.28~39.96 3. 讨论
适宜的生境条件是生物生长发育的先决条件，在对海洋生物的研究领域中，温度和盐度是2个特别重要的生态因子，并且因其特别容易测量和调节而引起生态学家的广泛关注。许多学者十分重视这2个因素的相互作用，CASTAGNA[10]认为在多数情况下，温度主要影响实验生物对盐度的反应速率，并不改变生物对盐度的耐受限度。有学者认为，只有温度和盐度或其中之一接近极限范围时，温度和盐度相结合才显示出明显的相互关系；反之，当温度或盐度处于安全范围时，没有明显的关系。如将温度或盐度控制在适宜条件下，单一因子的实验结果亦能反映出其范围。此研究中的试验温度保持在28.2~29.7℃之间，池塘养殖实践证明，在该温度范围内方斑东风螺生长迅速。因此，研究结果基本上能反映养殖方斑东风螺(大规格幼贝期)的适盐范围。
此研究结果表明，养殖方斑东风螺(大规格幼贝期)适宜生存盐度是19.18~41.39(比重1.012~1.029)，最适生存盐度是26.0~34.4(1.017~1.024)；适宜生长盐度为19.28~39.96(1.012~1.028)，最适生长盐度为26.0~31.6(1.017~1.022)，上述2组数字较为接近，且适宜生长盐度范围在适宜生存盐度范围内，说明了此研究方法在生存及生长临界盐度的界定上有一定的合理性。对比方斑东风螺3个生长指标盐度适应性(表 6)，可以看出，3个生长指标的最适生长盐度范围相同，均为26.0~31.6；体重和壳高2个生长指标的适宜盐度范围较为宽广，分别为15.96~41.58，17.91~42.50，适宜壳宽生长的范围较为狭窄，为19.28~39.96，说明该螺壳宽生长比体重和壳高2个指标的生长对盐度的变化更为敏感。
刘建勇和卓健辉[11]研究方斑东风螺胚胎发育的盐度适应性，分别得出该螺胚胎发育的最低和最高临界盐度为14和32，最适盐度范围为20~28，其最高和最低临界盐度值的界定均以胚胎孵化出卵囊膜为准；罗杰等[7]研究了方斑东风螺卵囊孵化的适宜盐度范围为30.3~37.0。这些研究结果之间与此试验的结果均有一定的差异，这可能与选用的试验螺生长阶段(胚胎期和大规格幼贝期)、实验条件、尤其是对临界盐度、适宜盐度及最适盐度的界定标准不同有关；另外，试验材料的亲贝产地不同也可能导致子代的适盐性差异(生活背景及遗传差异)，但这些试验结果均表明方斑东风螺对盐度变化非常敏感，属狭盐性贝类。
该研究结果表明，在盐度变化超出各指标的最适生长范围时，养殖方斑东风螺表现出一定的耐高盐的特性(表 3~表 5、图 2~图 4)，即在最适生长范围外同时下降相同的盐度梯度，高盐端3个生长指标平均日增长率均高于低盐端，如盐度变化对体重的影响，在盐度超出其最适增长范围后，两端同时下降一个盐度梯度，高盐端平均日增长率为1.10，低盐端为0.97；同时下降2个梯度，高盐端为0.98，低盐端为0.84，壳高和壳宽的变化亦是如此。这与罗杰等[7]研究得出方斑东风螺在盐度40.9时仍有67.0%的孵化率，当盐度低于27.6孵化率明显下降，体现了一定的耐高盐性结论一致。这就要求养殖场地应建在盐度相对比较高的海域附近才能取得较好的养殖效果，在高温多雨的南方海域，应避免在易受淡水冲击的河口、海湾区域养殖方斑东风螺。
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图 1 大黄鱼、
Figure 1. Mutation sites of Cyt b genes in P.crocea, M.miiuy and S.ocellata
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图 2 基于Cyt b基因序列构建的NJ分子系统树
Figure 2. NJ molecular phylogenetic trees based on Cyt b sequences
表 1 大黄鱼、
Table 1 Base compositions of Cyt b genes in P.crocea, M.miiuy and S.ocellatus
% A C G T A+T A1/A2/A3 C1/C2/C3 G1/G2/G3 T1/T2/T3 大黄鱼
P.crocea23.1 33.2 15.4 28.4 51.5 23.7/20.5/25.1 27.6/24.7/47.0 25.8/13.7/6.6 22.9/41.1/21.4
M.miiuy23.3 35.8 14.6 26.3 49.9 23.0/20.3/26.7 28.9//24.8/53.6 25.4/13.3//5.1 22.7/41.6/14.7 美国红鱼
S.ocellatus23.2 33.6 15.3 28.0 51.2 21.8/20.3/27.4 27.6//25.0/48.0 26.3/13.7/5.8 24.2/41.1//18.7 注：表中数字1、2、3分别代表密码子的第1、2、3位
Note：No. 1, 2 and 3 denote the 1st, 2nd and 3rdcodon position, respectively.
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表 2 3种序列的距离
Table 2 Distances for three Cyt b sequences
大黄鱼
P.crocea
M.miiuy美国红鱼
S.ocellatus大黄鱼 0.1786 美国红鱼 0.1755 0.1559
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