大豆异黄酮对鱼类免疫增强作用的初步研究

黄桂菊, 喻达辉, 郭奕惠, 王小玉

黄桂菊, 喻达辉, 郭奕惠, 王小玉. 大豆异黄酮对鱼类免疫增强作用的初步研究[J]. 南方水产科学, 2005, 1(2): 35-40.
引用本文: 黄桂菊, 喻达辉, 郭奕惠, 王小玉. 大豆异黄酮对鱼类免疫增强作用的初步研究[J]. 南方水产科学, 2005, 1(2): 35-40.
HUANG Gui-ju, YU Da-hui, GUO Yi-hui, WANG Xiao-yu. Studies on immune effects of soybean isoflavones on fish[J]. South China Fisheries Science, 2005, 1(2): 35-40.
Citation: HUANG Gui-ju, YU Da-hui, GUO Yi-hui, WANG Xiao-yu. Studies on immune effects of soybean isoflavones on fish[J]. South China Fisheries Science, 2005, 1(2): 35-40.

大豆异黄酮对鱼类免疫增强作用的初步研究

详细信息
    作者简介:

    黄桂菊(1978-),女,硕士,从事海洋生物遗传育种研究。E-mail: charlie-417@tom.com

    通讯作者:

    喻达辉,E-mail: yudh231@21cn.com

  • 中图分类号: S948

Studies on immune effects of soybean isoflavones on fish

  • 摘要:

    研究副溶血弧菌对斑马鱼的感染模式。试验以注射、创伤、浸泡等3种不同的感染方式分2次进行,每组10尾斑马鱼,结果显示注射感染只在高浓度菌液时有死亡,48 h的LC50是5.63×107 CFU · mL-1,而创伤感染偶有死亡,浸泡感染则未见死亡,表明注射感染是斑马鱼副溶血弧菌的重要感染模式。同时注射感染结果也显示低水温的死亡率远远低于高水温的死亡率,表明适宜的温度和弧菌的浓度是其致病的关键。并初步探讨了大豆异黄酮作为饲料添加剂的免疫增强作用,各组试验鱼分别投喂黄酮含量为0.5%、1%、2%的饲料,喂养两周后开始注射3.6×109 CFU · mL-1的副溶血弧菌悬液,以投喂1%的试验组的抗感染效果较好,表明其对减少养殖病害的发生有一定的好处,为养殖生产提供一种新的免疫增强剂。

    Abstract:

    To study the infection mode of Vibrio parahaemolyticus on zebrafish and the immune effects of soybean isoflavones on the Vibrio, two groups of experiments were performed. Ten zebrafish in each group were challenged by intramuscular injecting, surgical injuring and water soaking with different concentration of the Vibrios, respectively. The results show that intramuscular injection could cause death in high concentration of the bacteria. The LC50 is 5.63×107 CFU · mL-1 (48 h).No death was observed in immersion treatment while low mortality occurred in wounding treatments. As a result, intramuscular injection is an important infection mode of Vibrio parahaemolyticus on zebrafish. Moreover, the mortality is much lower at low water temperature (16℃) than that at high water temperature (28℃) in muscular injection treatment, showing that water temperature and the bacterial concentration are important factors for mortality in the injection group. For the immune effect test of soybean isoflavones, the animals were administered feeds with additive of soybean isoflavones at concentration of 0% (as a control), 0.5%, 1% and 2%, respectively for fourteen days. The fishes were subsequently subject to muscular injection of Vibrio at the concentration of 3.6×109 CFU · mL-1. The results indicate that 1% soybean isoflavones can resist infection, suggesting that it is good to reduce diseases and to be a new immunostimulants in aquaculture practice.

  • 斑马鱼(zebrafish, Danio rerio)是十分重要的实验动物,可用于大规模遗传筛选[1]、基因组学和功能基因组学的研究[2]。同时斑马鱼也是各国际标准组织认可的毒性试验鱼种,斑马鱼胚胎发育技术在毒性评价中得到了广泛的应用[3-7]。但斑马鱼对病原菌的敏感性研究报道较少,目前还没有弧菌对其致病力方面的研究报道。

    世界上引起重要海水养殖动物死亡率的主要病原之一是弧菌。多数致病性弧菌是海水和底质中的常见菌,也是从鱼、虾、贝、蟹等中分离到的主要菌种,副溶血弧菌是常见的致病较强的弧菌, 它对中国对虾、斑节对虾、日本对虾和大黄鱼的致病力已有研究报道[8-10],本文以注射、创伤、浸泡等3种不同的感染方式研究副溶血弧菌对斑马鱼的致病性,探讨斑马鱼副溶血弧菌的感染模式。大豆异黄酮是几种生理作用不尽相同的异黄酮组成的混合物,它具有类雌激素的功能,既可以促进动物生长,增强机体免疫力,提高动物泌乳,增加产蛋量,蛋重及提高繁殖机能等生理作用,又具有抗氧化能力,抗增殖以及抗血管增生效果[11]。因此本试验也初步探讨大豆异黄酮作为饲料添加剂的免疫增强作用,以期为水产生物的病害预防提供一新的免疫增强剂,减少抗生素对环境的污染和生物残留,从而减少环境抗生素对人体的危害。

    斑马鱼:体长3~4 cm,体重0.38~0.44 g。2批斑马鱼分别于2004年11月16日和12月28日于广州花地湾花鸟鱼市场购买,经10 d暂养后开始实验。

    副溶血弧菌(Vibio parahaemolyticus)来自武汉水生生物研究所,由厦门大学彭宣宪博士惠赠。用含3.5%NaCl的LB液体培养基扩大培养,离心收取菌液,平板菌落计数法进行计数。

    实验采用注射、浸泡、创伤3种不同的感染方式进行,重复2次(分别于2004年11月16日和12月28日进行)。将斑马鱼放入8 L的经高锰酸钾消毒的圆形玻璃缸内,每组用鱼10尾,水体容积为5 L,试验在南海水产研究所增养殖和种质资源实验室室内进行,用水为放置3 d充分曝气的自来水,水温28℃左右(11月16日)和16℃左右(12月28日)。试验期间连续24 h足量充气,每天正常投饵,吸污,每隔3 d换水,换水量为30%。

    将培养好的副溶血弧菌分别用生理盐水配制成3.6×108、3.6×107、3.6×106、3.6×105、3.6×104 CFU · mL-15个浓度梯度,用一次性注射器对斑马鱼体侧作肌肉注射,每尾0.1 mL,对照组在相同部位注射等量生理盐水,记录斑马鱼的发病情况及死亡量。

    使水体菌悬液的终浓度分别为3.6×108、3.6×107、3.6×106、3.6×105、3.6×104 CFU · mL-1。将试验鱼放入其中浸泡,对照组不加菌悬液,记录斑马鱼的发病情况及死亡量。

    将实验鱼用消毒过的剪刀剪尾部少许肌肉,其余操作和实验菌悬液浓度同浸泡感染组,对照组不加菌悬液,记录斑马鱼的发病情况及死亡量。

    根据以上记录结果,按改良寇氏法[12],求出该菌对斑马鱼48 h的半致死浓度LC50

    大豆异黄酮, 为华北制药厂产品, 批号: 20040302, 纯度95.38%。其中染料木素甙(Genistin)38.64%, 大豆甙(Daidzin)37.45%, 大豆黄素甙(Glycitin)16.26%, 三羟异黄酮(Genistein)1.31%, 大豆甙元(Daidzein)1.22%, 大豆黄素甙元(Glycitein)0.50%。饲料配方见表 1。实验分3组,每组10尾,重复2次,各组分别投喂黄酮含量为0.5%、1%、2%的饲料,对照组投喂不含黄酮的普通饲料。每天喂1次(16:00),以投喂后2 h内吃完为标准。喂养两星期后开始注射3.6×109 CFU · mL-1的副溶血弧菌悬液,记录鱼的活动情况和死亡情况并进行统计分析[12]

    表  1  试验组饲料配方
    Table  1.  Components of the feed  %
    组别
    group
    粉碎料
    shiver feed
    黄酮
    isoflavone
    葡萄糖
    glucose
    α-淀粉
    amylum
    褐藻酸钠
    sodium algin
    维生素C(35%)
    vitamin C
    一组(0.5%黄酮) 82.4 0.5 5 10 2 0.1
    二组(1%黄酮) 81.9 1 5 10 2 0.1
    三组(2%黄酮) 80.9 2 5 10 2 0.1
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    表  2  3种感染方式的死亡情况(Ⅰ)
    Table  2.  Results of artificial infection experiments (Ⅰ)
    试验组
    gronp
    菌液浓度
    concentration of bacteria
    试验鱼数
    number of zebrafish
    死亡数 number of death 总死亡数
    total
    死亡率/%  mortality
    4 h 8 h 12 h 16 h 24 h 36 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h
    注射
    injection
    3.6×108 10 1 1 7 9 20 90 90
    3.6×107 10 1 1 1 3 20 30 30
    3.6×106 10 1 1 2 0 20 20
    3.6×105 10 0 0 0 0
    3.6×104 10 0 0 0 0
    对照
    control
    生理盐水
    sodium chloride
    10 0 0 0 0
    创伤
    wounding
    3.6×108 10 0 0 0 0
    3.6×107 10 0 0 0 0
    3.6×106 10 1 1 0 10 10
    3.6×105 10 1 1 0 10 10
    3.6×104 100 0 0 0 0
    对照
    control
    生理盐水
    sodium chloride
    10 0 0 0 0
    浸泡
    immersion
    3.6×108 10 0 0 0 0
    3.6×107 10 0 0 0 0
    3.6×106 10 0 0 0 0
    3.6×105 10 0 0 0 0
    3.6×104 10 0 0 0 0
    对照
    control
    生理盐水
    sodium chloride
    10 0 0 0 0
    注:2004.11.16, 水温28℃
    Note: Nov.16, 2004, water temperature 28℃
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    在11月16日和12月28日分别进行的试验中,由于试验水温相差较大,因此2组数据未按常规方法合并计算而是分别处理。11月16日所进行的注射感染中,注射的鱼都表现出活力下降的现象,表现为游泳缓慢,无力,严重者侧卧在缸底,但几小时后逐渐恢复,表明人工注射操作过程对鱼有一定的应激影响。注射后12 h即开始死亡,但不同菌液浓度的死亡情况差别较大。当菌液浓度为3.6×108 CFU · mL-1时,36 h时死亡率就达到90%,死亡后的鱼体注射处肌肉泛白、有的有出血斑点。当菌液浓度为3.6×107 CFU · mL-1时,36 h时死亡率仅为30%。而当菌液浓度低于3.6×106 CFU · mL-1时全部成活。而在12月28日所进行的注射感染中,当菌液浓度为3.6×108时,只有部分注射的鱼表现出活力下降的现象,并且在注射后24 h才开始死亡,36 h死亡率为20%。而当菌液浓度低于3.6×107 CFU · mL-1时,注射鱼均不见死亡。

    创伤感染试验中,2次试验都只有个别鱼死亡,死亡鱼的伤口处肌肉发白,表明创伤对鱼体有一定的影响,会引起机体的免疫力和抵抗力的下降,使机体易受环境病原菌的感染。

    浸泡感染试验中,无异常现象,未发现鱼的死亡。进一步说明伤口是弧菌感染的重要途径。

    根据以上结果,11月16日所进行的注射感染中,斑马鱼48 h的半致死浓度为5.63×107 CFU · mL-1。而12月28日所进行的注射感染中,斑马鱼的死亡率太低,未达到半致死浓度的统计要求。

    在攻毒前2周饲养过程中,斑马鱼活动正常,无死亡现象。11月16日注射副溶血弧菌后,尽管注射量比致病性实验的注射量(3.6×108 CFU · mL-1)高一个数量级,但各试验组的死亡率都有所下降(表 45)。投喂含1%黄酮饲料的试验组死亡率最低,而且投喂黄酮饲料的鱼死亡时间比对照组晚。12月28日的结果与上述结果类似,只是鱼的死亡时间更迟,死亡率有所下降。2次结果均显示投喂黄酮有一定的效果,其中投喂1%的试验组的抗感染效果较好。

    表  3  3种感染方式的死亡情况(Ⅱ)
    Table  3.  Results of artificial infection experiments (Ⅱ)
    试验组
    group
    菌液浓度
    concentration of bacteria
    试验鱼数
    number of zebrafish
    死亡数 number of death 总死亡数
    total
    死亡率/%  mortality
    4 h 8 h 12 h 16 h 24 h 36 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h
    注射
    injection
    3.6×108 10 1 1 2 10 20 20
    3.6×107 10 0 0 0 0
    3.6×106 10 0 0 0 0
    3.6×105 10 0 0 0 0
    3.6×104 10 0 0 0 0
    对照
    control
    生理盐水
    sodium chloride
    10 0 0 0 0
    创伤
    wounding
    3.6×108 10 0 0 0 0
    3.6×107 10 0 0 0 0
    3.6×106 10 0 0 0 0
    3.6×105 10 0 0 0 0
    3.6×104 10 1 1 10 10 10
    对照
    control
    生理盐水
    sodium chloride
    10 0 10 10 10
    浸泡
    immersion
    3.6×108 10 0 0 0 0
    3.6×107 10 0 0 0 0
    3.6×106 10 0 0 0 0
    3.6×105 10 0 0 0 0
    3.6×104 10 0 0 0 0
    对照
    control
    生理盐水
    sodium chloride
    10 0 0 0 0
    注:2004.12.28, 水温16℃
    Note: Dec.28, 2004, water temperature 16℃
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    表  4  添加黄酮对弧菌的抗感染作用(Ⅰ)
    Table  4.  Antibacterial activities of soybean isoflavone against Vibrio parahaemolyticus(Ⅰ)
    试验组
    group
    试验鱼数
    number of zebafish
    死亡数 number of death 存活数 number of living
    4 h 8 h 12 h 16 h 24 h 36 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h
    0.5%黄酮 10 8 2 2 2
    1%黄酮 10 4 1 1 4 4 4
    2%黄酮 10 7 1 1 2 2 2
    对照 10 2 1 6 1 1 1
    注:2004.11.16, 水温28℃
    Note: Nov.16, 2004, water temperature 28℃
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    表  5  添加黄酮对弧菌的抗感染作用(Ⅱ)
    Table  5.  Antibacterial activities of soybean isoflavone against Vibrio parahaemolyticus(Ⅱ)
    试验组
    group
    试验鱼数
    number of zebrafish
    死亡数 number of death 存活数 number of living
    4 h 8 h 12 h 16 h 24 h 36 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h
    0.5%黄酮 10 2 2 1 1 6 4 4
    1%黄酮 10 1 2 1 9 6 6
    2%黄酮 10 4 2 1 4 3 3
    对照 10 3 1 1 1 1 4 3 3
    注:2004.12.28, 水温16℃
    Note: Dec.28, 2004, water temperature 16℃
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    在对条件致病菌的毒力及其侵入途径的研究中,感染方法是非常关键的。弧菌是条件致病菌[13],在海水养殖环境中广泛存在,其发病有其复杂的内部和外部条件,当水质恶化、养殖对象体力减弱时危害十分严重,往往造成暴发性流行病[14, 15]。因此感染模式的确定对其引起的疾病预防具有重要实践意义。本试验表明,肌肉注射能使健康斑马鱼致病,死亡率较高。对照组注射生理盐水后表现活力下降的现象经一段时间恢复后均能正常生长,说明肌肉注射操作对实验鱼的影响较小。此外,创伤组也有个别鱼死亡。但浸泡感染中,试验水体的含菌量为3.6×104~3.6×108 CFU · mL-1,远远高于正常养殖水体的含菌量,但试验组仍无一试验鱼被感染死亡。究其原因,可能是副溶血弧菌是海水株,而本试验是在淡水条件下进行,注射感染无大影响,浸泡感染时弧菌活力会受到抑制。有关鱼虾类等的研究也表明,注射有发病,浸泡没有发病[8-10],甚至在投喂感染中也没有死亡发生[8, 10]。因此表明肌肉注射感染是副溶血弧菌致病的重要感染途径。

    本试验还发现,水温对弧菌的致病力影响很大。在2004年11月16日的试验中,水温28℃左右,菌液浓度为3.6×108~3.6×106 CFU · mL-1时注射感染的鱼即有死亡,而12月28日所进行的注射感染中,水温16℃左右,只有当菌液浓度高达3.6×108 CFU · mL-1时才有鱼死亡,并且死亡率明显下降。究其原因,可能是斑马鱼属于变温动物,而弧菌适宜的生长温度是25~37℃,当水温低于弧菌适宜的生长温度时,体内感染的弧菌处于不活跃状态,导致对斑马鱼的致病力不强,这充分体现了其条件致病性的特点。因此,温度是副溶血弧菌致病的重要因子。在水产动物的养殖过程中,尤其在高温期,增强机体的体质和免疫能力是预防弧菌病害暴发流行的关键。

    由于抗生素的滥用,造成环境污染和生物残留,对人体健康产生危害。在水产养殖中抗生素的大量使用已引起全世界的关注。因此寻找、开发能预防疾病、增强机体抗病力的免疫增强剂成为近年来的研究热点。生物黄酮(Bioflavonoid)包括芦丁、茶多酚、大豆异黄酮、橙皮苷和槲皮素等,种类众多。是常见于植物的一种天然抗氧化成分,具有提高免疫力增强体力的作用,许多对昆虫抗病力强的植物,黄酮含量也高。大豆异黄酮作为饲料添加剂具有剂量小、见效快、毒性小的特点,能促进动物体内养分重新分配、提高蛋白质合成效率、提高动物的繁殖能力和增强动物免疫力。本试验将大豆异黄酮作为饲料添加剂,在注射副溶血弧菌后(尽管注射剂量最高)发现投喂黄酮的试验组鱼的死亡率低于毒性实验组的死亡率,其中以含黄酮1%的保护率较好。但黄酮的配方、用量和用法还有待深入研究。本试验只进行了攻毒试验比较,没有检测其它免疫指标可以进一步说明哪一种喂含量是最佳,希望在以后的试验研究中进一步完善这方面的要求。随着研究的深入,黄酮等生物活性物质在养殖生产中的应用将越来越广泛。

  • 表  1   试验组饲料配方

    Table  1   Components of the feed  %

    组别
    group
    粉碎料
    shiver feed
    黄酮
    isoflavone
    葡萄糖
    glucose
    α-淀粉
    amylum
    褐藻酸钠
    sodium algin
    维生素C(35%)
    vitamin C
    一组(0.5%黄酮) 82.4 0.5 5 10 2 0.1
    二组(1%黄酮) 81.9 1 5 10 2 0.1
    三组(2%黄酮) 80.9 2 5 10 2 0.1
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    表  2   3种感染方式的死亡情况(Ⅰ)

    Table  2   Results of artificial infection experiments (Ⅰ)

    试验组
    gronp
    菌液浓度
    concentration of bacteria
    试验鱼数
    number of zebrafish
    死亡数 number of death 总死亡数
    total
    死亡率/%  mortality
    4 h 8 h 12 h 16 h 24 h 36 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h
    注射
    injection
    3.6×108 10 1 1 7 9 20 90 90
    3.6×107 10 1 1 1 3 20 30 30
    3.6×106 10 1 1 2 0 20 20
    3.6×105 10 0 0 0 0
    3.6×104 10 0 0 0 0
    对照
    control
    生理盐水
    sodium chloride
    10 0 0 0 0
    创伤
    wounding
    3.6×108 10 0 0 0 0
    3.6×107 10 0 0 0 0
    3.6×106 10 1 1 0 10 10
    3.6×105 10 1 1 0 10 10
    3.6×104 100 0 0 0 0
    对照
    control
    生理盐水
    sodium chloride
    10 0 0 0 0
    浸泡
    immersion
    3.6×108 10 0 0 0 0
    3.6×107 10 0 0 0 0
    3.6×106 10 0 0 0 0
    3.6×105 10 0 0 0 0
    3.6×104 10 0 0 0 0
    对照
    control
    生理盐水
    sodium chloride
    10 0 0 0 0
    注:2004.11.16, 水温28℃
    Note: Nov.16, 2004, water temperature 28℃
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    表  3   3种感染方式的死亡情况(Ⅱ)

    Table  3   Results of artificial infection experiments (Ⅱ)

    试验组
    group
    菌液浓度
    concentration of bacteria
    试验鱼数
    number of zebrafish
    死亡数 number of death 总死亡数
    total
    死亡率/%  mortality
    4 h 8 h 12 h 16 h 24 h 36 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h
    注射
    injection
    3.6×108 10 1 1 2 10 20 20
    3.6×107 10 0 0 0 0
    3.6×106 10 0 0 0 0
    3.6×105 10 0 0 0 0
    3.6×104 10 0 0 0 0
    对照
    control
    生理盐水
    sodium chloride
    10 0 0 0 0
    创伤
    wounding
    3.6×108 10 0 0 0 0
    3.6×107 10 0 0 0 0
    3.6×106 10 0 0 0 0
    3.6×105 10 0 0 0 0
    3.6×104 10 1 1 10 10 10
    对照
    control
    生理盐水
    sodium chloride
    10 0 10 10 10
    浸泡
    immersion
    3.6×108 10 0 0 0 0
    3.6×107 10 0 0 0 0
    3.6×106 10 0 0 0 0
    3.6×105 10 0 0 0 0
    3.6×104 10 0 0 0 0
    对照
    control
    生理盐水
    sodium chloride
    10 0 0 0 0
    注:2004.12.28, 水温16℃
    Note: Dec.28, 2004, water temperature 16℃
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    表  4   添加黄酮对弧菌的抗感染作用(Ⅰ)

    Table  4   Antibacterial activities of soybean isoflavone against Vibrio parahaemolyticus(Ⅰ)

    试验组
    group
    试验鱼数
    number of zebafish
    死亡数 number of death 存活数 number of living
    4 h 8 h 12 h 16 h 24 h 36 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h
    0.5%黄酮 10 8 2 2 2
    1%黄酮 10 4 1 1 4 4 4
    2%黄酮 10 7 1 1 2 2 2
    对照 10 2 1 6 1 1 1
    注:2004.11.16, 水温28℃
    Note: Nov.16, 2004, water temperature 28℃
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    表  5   添加黄酮对弧菌的抗感染作用(Ⅱ)

    Table  5   Antibacterial activities of soybean isoflavone against Vibrio parahaemolyticus(Ⅱ)

    试验组
    group
    试验鱼数
    number of zebrafish
    死亡数 number of death 存活数 number of living
    4 h 8 h 12 h 16 h 24 h 36 h 48 h 96 h 24 h 48 h 96 h
    0.5%黄酮 10 2 2 1 1 6 4 4
    1%黄酮 10 1 2 1 9 6 6
    2%黄酮 10 4 2 1 4 3 3
    对照 10 3 1 1 1 1 4 3 3
    注:2004.12.28, 水温16℃
    Note: Dec.28, 2004, water temperature 16℃
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表(5)
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出版历程
  • 收稿日期:  2005-03-10
  • 刊出日期:  2005-05-19

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