Study on ITS 2 molecular markers of six pearl oyster species in the genus Pinctada
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摘要:
对珠母贝属的大珠母贝、珠母贝、白珠母贝、黑珠母贝、长耳珠母贝、黑珠母贝和合浦珠母贝6个种的内部转录间隔区2(ITS 2)序列及其两侧的5.8S和28S的部分序列进行了比较分析。其中黑珠母贝的序列来自GenBank。PCR扩增片段大小为600 bp左右，测序结果表明，ITS 2长211~254 bp，两端的5.8S和28S分别长84 bp和272 bp(均含引物)。序列比对分析结果表明，5.8S和28S序列高度保守，不适合于种类鉴定，而ITS 2序列高度变异，270个比对位点中有146个位点发生突变，其中72个位点发生插入/缺失突变。除白珠母贝和黑珠母贝之间的遗传距离较小外，其余种类之间的遗传距离远远大于种内遗传距离。基因型分析表明，每个种具有各自特有的基因型。基因型和序列变异分析表明ITS 2序列可作为珍珠贝种类鉴定的分子标记。可用于种间、杂交育种、幼体和珍珠贝肉等材料的种类鉴定与遗传分析。
Abstract:The ITS 2 complete sequences and flanked 5.8S and 28S rDNA partial sequences of six pearl oysters, namely, Pinctada maxima, P.margaritifera, P.albina, P.nigra, P.chemnitzi and P.fucata in the genus Pinctada were analyzed, among which the sequences of P. nigra were obtained from GenBank. The PCR product is about 600 bp, which contains 84 bp of 5.8S and 272 bp of 28S rDNA fragments(both including primer sequence). The full length of ITS 2 ranges from 211 to 254 bp. The sequence variation analysis indicated that 5.8S and 28S rDNA fragments are highly conservative and not suitable for species identification whereas ITS 2 is highly variable with 146 mutation sites (including 72 insertion/deletions) within 270 alignment positions. The interspecific genetic distances are much greater than the intraspecific distances except that between P.albina and P. nigra. The genotype analysis also demonstrated that each species has its own genotypes. These findings suggested that ITS 2 is a high-resolution molecular marker useful in identification of species, hybrids, larvae and tissue samples of the pearl oysters.
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Keywords:
- species identification /
- genotype /
- sequence variation /
- ribosomal DNA
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盐碱水是分布于陆地区域、矿化度在1~50 g·L−1的非海洋性咸水资源，通常因其较高的盐度或碱度导致作物无法灌溉、人畜无法饮用而处于闲置状态[1]。开展盐碱水的渔业利用，可以形成新的生产力，保障内陆水产养殖业可持续发展，近年来已受到政府和学界的关注。除了高盐、高碱等特性，盐碱水还具有水质类型多、主要离子比例失衡等特点。在我国干旱、半干旱的西北地区，如新疆、甘肃、青海等地硫酸钠盐渍土分布广泛[2]。同时与海水相比，西北地区的淡水及盐碱水资源中通常具有硫酸根离子 (${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} $) 比例较高的特点。海水中的${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$ (mg/mg) 通常为0.14，而在我国西北地区的塔里木河、青海湖、大苏干湖和博斯腾湖的${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$ 均值分别为1.46、0.54、0.95和1.66[3-7]。
凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 具有生长速度快、成活率高，盐度适应范围广等优势，是我国盐碱水渔业发展的优良经济品种，目前已在西北地区推广养殖[8-9]。相关报道表明凡纳滨对虾可以在硫酸盐含量较高的水体中开展养殖[10-11]。黄艳青等[12]研究发现，在西北硫酸盐型盐碱水养殖条件下，凡纳滨对虾的呈味氨基酸/总氨基酸与钠含量显著高于低盐度海水养殖条件。当前，关于利用高硫酸盐的水体开展凡纳滨对虾养殖的研究中缺乏对水体离子比的报道，不同浓度硫酸盐对凡纳滨对虾影响的研究仅见于顾晨等[13]以盐度为10‰的水体为基础添加硫酸钠的方式开展的96 h急性毒性实验。国外学者多以水环境和水生生物保护为目的，主要开展硫酸盐对淡水生物如网纹溞 (Ceriodaphnia dubia)、美丽蚌 (Lampsilis abrupta)、胖头鱥 (Pimephales promelas)、钩虾 (Hyalella azteca)、虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 等毒性效应的研究[14-15]。以高硫酸盐含量水资源生产利用为目的的中长期实验仅见于以海水生物拟穴青蟹 (Scylla paramamosain) 和美国红鱼 (Sciaenops ocellatu) 为研究对象的相关报道[16-17]，尚未见硫酸盐慢性胁迫下凡纳滨对虾生长及相关指标的研究。本研究在参照正常海水离子组成的基础上，采用等质量硫酸钠替换氯化钠的方式，在 ${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$为0.140~2.225、盐度为5‰ 条件下，开展为期5周的凡纳滨对虾养殖，同时分析不同${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$ 下对虾的生长、存活、肝胰腺和鳃组织结构及酶活性的变化，以期为凡纳滨对虾在西北内陆高硫酸盐含量水环境下的养殖推广提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 实验用水
采用人工海水素 (江西海鼎科技有限公司) 和经充分曝气的自来水调配盐度为5‰ 的实验用水，其中人工海水素采用等质量的硫酸钠代替氯化钠来改变${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$ 的比例。在每个${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$水平下，除Na+ 外的其他离子的总浓度保持大致恒定 (表1)。根据本实验室早期预实验的结果，在盐度为5‰、10‰、15‰ 和20‰ 时，以水中${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} $浓度为基数，以1.25为倍数公比，$ {\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}}/{\rm{Cl}}^{\text{−}}$ 介于0.140~2.225 (mg/mg)时，凡纳滨对虾72 h内的死亡率均低于5%。基于预实验结果，本研究共设置4个${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}}/ {\rm{Cl}}^{\text{−}}$水平：0.140 (A组，对照组)、0.577 (B组)、1.127 (C组) 和2.225 (D组)。其中对照组离子比与海水相同；B组${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} $浓度为A组的3.05倍，${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$为0.577，接近有凡纳滨对虾养殖报道的里海南部的${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$ (0.62)[11,18]；C组${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} $浓度为A组的4.51倍，${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} $与Cl− 单位电荷摩尔百分比为0.881，接近阿列金分类法中的硫酸盐型水；D组${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} $浓度为A组的5.97倍，为硫酸盐型水中的${\mathrm{S}}_{{\mathrm{II}}}^{\mathrm{Na}} $型水。
表 1 实验各组用水的SO4 2−/Cl− 及离子浓度Table 1. Concentrations of ion and SO4 2−/Cl− ratios of experimental artificial brackish water项目 Item 组别 Group A B C D 硫酸根离子/氯离子
$ {\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$0.140 0.577 1.127 2.225 硫酸根离子+氯离子 $ {\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}}{\mathrm{+}}{\rm{Cl}}^{\text{−}}/ ({\mathrm{g}} \cdot {\mathrm{L}}^{{\text{−}}1})$ 3.130 3.210 3.275 3.335 硫酸根离子 $ {\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /$
(g·L−1)0.385 1.175 1.735 2.300 氯离子 Cl−/(g·L−1) 2.745 2.035 1.540 1.035 镁离子 Mg2+/(g·L−1) 0.184 0.184 0.184 0.184 钙离子 Ca2+/(g·L−1) 0.059 0.059 0.059 0.059 钾离子 K+/(g·L−1) 0.057 0.057 0.057 0.057 钠离子 Na+/(g·L−1) 1.532 1.451 1.393 1.335 碳酸氢根离子
${\mathrm{HCO}}_3^{\text{−}} / ({\mathrm{g}} \cdot {\mathrm{L}}^{{\text{−}}1})$0.020 0.020 0.020 0.020 溴离子 Br−/(g·L−1) 0.010 0.010 0.010 0.010 锶离子 Sr2+/(g·L−1) 0.001 0.001 0.001 0.001 硼离子 B3+/(g·L−1) 0.000 65 0.000 65 0.000 65 0.000 65 氟离子 F−/(g·L−1) 0.000 163 0.000 163 0.000 163 0.000 163 1.2 幼虾暂养
实验在中国水产科学研究院南海水产研究所珠海实验基地进行，实验用虾来自海南新正生态种苗有限公司。取一批孵化22 d的虾苗置于5个500 L玻璃钢桶中暂养20 d，水温为 (26±1) ℃，盐度为5‰。每天按体质量的6%分别于8:00、14:00和20:00投喂3次，每天用虹吸管吸掉残饵粪便，每3 d全量换水1次。暂养结束后选取平均湿质量为 (0.9±0.2) g的对虾240尾作为实验用虾。
1.3 生长实验
用12个450 L塑料圆桶进行生长实验，每个塑料圆桶中放养实验虾20尾，每组设3个重复。实验过程中每天8:00、20:00定量投喂饲料 (珠海海明威)，投喂2 h后虹吸出残饵粪便。养殖过程中每3 d换1/3水。溶解氧质量浓度>6 mg·L−1，pH 7.8±0.2，光暗比为14 h∶10 h，水温 (26.0±1.0) ℃。每天观察记录对虾的摄食和死亡情况，第35天实验结束后称量各组对虾的湿质量。
实验期间，依据祝华萍等[19]的方法计算凡纳滨对虾的成活率 (Survival rate, SR)、体质量增长率(Body mass growth rate, WGR)及特定生长率(Specific growth rate, SGR, %·d−1)，计算公式分别为：
$$ \mathrm{SR=} \mathit{N} _{ \mathit{t} } \mathrm{/} \mathit{N} _{ \mathrm{0}} \mathrm{\times 100} {\text{%}}$$ (1) $$ \mathrm{WGR=(} \mathit{W} _{ \mathit{t} } {\text{−}} \mathit{W} _{ \mathrm{0}} \mathrm{)/} \mathit{W} _{ \mathrm{0}} \mathrm{\times 100} {\text{%}}$$ (2) $$ \mathrm{SGR=(ln} \mathit{W} _{ \mathit{t} } {\text{−}}\mathrm{ln} \mathit{W} _{ \mathrm{0}} \mathrm{)/} \mathit{T} \mathrm{\times 100}{\text{%}} $$ (3) 式中：W0为实验初始时凡纳滨对虾湿质量(g)；Wt为实验结束时对虾湿质量(g)；N0为初始对虾尾数；Nt为实验第t天时存活的对虾尾数；T为实验持续时间 (d)。
1.4 肝胰腺、鳃组织结构与酶活测定
每组随机选取3只虾，取出肝胰腺和鳃组织置于多聚甲醛中保存，用乙醇逐级脱水，石蜡包埋后切片，H.E染色，光学显微镜观察并拍照。
每组另选取20尾对虾取肝胰腺和鳃组织放于 −80 ℃冰箱，用于酶活测定。使用南京建成有限公司的试剂盒测定组织中超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、酸性磷酸酶 (ACP)、碱性磷酸酶 (AKP)、钠钾ATP酶 (Na+/K+-ATPase) 活性和丙二醛 (MDA)含量。使用Soalrbio公司试剂盒测定组织中酪氨酸酶 (TYR) 活性。
1.5 数据计算与分析
实验数据使用SPSS 25软件进行单因素方差分析，用LSD法进行多重比较，显著性水平α为0.05[20]。结果利用Origin 2021软件作图。
2. 结果
2.1 不同浓度硫酸盐水体对凡纳滨对虾存活和生长的影响
4组凡纳滨对虾成活率、体质量增长率、养成湿质量和特定生长率均无显著性差异 (表2)。
表 2 不同硫酸盐浓度对凡纳滨对虾35 d生长指标的影响Table 2. Effects of different sulfate concentrations on 35-day growth indexes of L. vannamei指标
Index组别 Group A B C D 成活率 Survival rate/% 77.00±3.30 70.00±2.90 80.00±10.00 75.00±5.00 养成湿质量 Final wet mass/g 4.12±0.14 3.87±0.10 4.20±0.12 4.04±0.14 体质量增长率 Body mass growth rate/% 370.05±0.20 335.76±0.10 380.00±0.35 377.20±0.29 特定生长率 SGR/% 4.41±0.12 4.20±0.11 4.47±0.21 4.46±0.17 2.2 不同硫酸盐浓度对凡纳滨对虾抗氧化酶及免疫酶活性的影响
2.2.1 硫酸盐浓度对Na+/K+-ATPase活性的影响
各组凡纳滨对虾肝胰腺与鳃组织Na+/K+-ATPase活性均无显著性差异 (p>0.05，图1)。
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图 1 不同硫酸盐浓度对凡纳滨对虾钠钾ATP酶活性的影响Figure 1. Effect of different sulfate concentrations on Na+/K+-ATPase activity of L. vannamei2.2.2 不同硫酸盐浓度对SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的影响
由图2可知，肝胰腺和鳃组织的SOD和GSH-Px活性均随硫酸盐浓度的增加先上升再下降。D组凡纳滨对虾GSH-Px活性在肝胰腺和鳃组织中均最低，但与其他组无显著性差异 (p>0.05)。D组肝胰腺SOD活性低于其他3组，为13.43 U·mg−1，与C组差异显著 (p<0.05)。B和C组鳃组织SOD活性显著高于A和D组 (p<0.05)。各组肝胰腺和鳃组织的MDA含量无显著性差异 (p>0.05)。
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图 2 不同硫酸盐浓度对凡纳滨对虾超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性以及丙二醛含量的影响注：标有不同字母者表示组间有显著性差异 (p<0.05)。Figure 2. Effects of different sulfate concentrations on SOD, GSH-Px activity and MDA content of L. vannameiNote: Different letters represent significant differences among the groups (p<0.05).2.2.3 不同硫酸盐浓度对ACP、 AKP和TYR的影响
4组凡纳滨对虾肝胰腺组织的ACP、AKP和TYR活性均无显著性差异 (p>0.05，图3)。鳃ACP和AKP活性均随硫酸盐浓度的增加呈下降趋势，A组最高，D组最低。D组ACP活性为93.70 金氏单位·g−1，显著低于A和B组 (p<0.05)。D组鳃AKP和TYR活均显著低于A组 (p<0.05)。
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图 3 不同硫酸盐浓度对凡纳滨对虾酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和酪氨酸酶活性的影响注：标有不同字母者表示组间有显著性差异 (p<0.05)。Figure 3. Effects of different sulfate concentrations on ACP, AKP and TYR activities of L. vannameiNote: Different letters represent significant differences among the groups (p<0.05).2.3 硫酸盐浓度对凡纳滨对虾鳃和肝胰腺组织结构的影响
各组凡纳滨对虾鳃组织结构完整，鳃丝排列整齐，上皮细胞排列紧密，血细胞分布均匀，角质层形态结构正常，皮下间隙清晰可见，未见明显异常 (图4-a—4-d)。A—C组对虾肝小管管腔呈星型，肝细胞结构正常、分布均匀。D组对虾肝小管内部分B细胞破裂、管腔增大，横切面多呈多边形 (图4-e—4-h)。
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图 4 不同硫酸盐浓度对凡纳滨对虾肝胰腺显微结构的影响注：a—d. A—D组肝胰腺；e—f. A—D组鳃丝。Figure 4. Effect of different sulfate concentrations on hepatopancreas and gill microstructurein of L. vannameiNote: a−d. Hepatopancreas of L. vannamei from Group A to D; e−f. Gills of L. vannamei from Group A to D.3. 讨论
3.1 不同浓度硫酸盐对凡纳滨对虾生长存活和组织结构的影响
以往多以在水中添加硫酸钠的方式研究水生生物的硫酸盐耐受性，实验生物在硫酸盐浓度增加的同时也受硫酸钠添加带来的盐度变化的影响。在此基础上，学者们普遍认为在水中主要离子中，${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} $对淡水动物的毒性最小，其毒理学效应主要体现在渗透胁迫而非离子本身的毒性[21]。在低盐水体中，由硫酸钠添加带来的盐度上升往往对于广盐性生物是利好的，同时也表明了硫酸钠对广盐生物的毒性较低。Hu等[16]通过在盐度为1‰ 的人工海水中添加不同浓度硫酸钠的方式研究硫酸盐浓度对拟穴青蟹的影响，结果表明添加2 g·L−1的硫酸钠组 (${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$=2.78 mg/mg) 拟穴青蟹28 d成活率为62.5%，较无添加的对照组成活率 (37.5%) 更高，并认为硫酸钠添加引起的较高盐度更适宜拟穴青蟹的存活。研究表明，在盐度为3‰ 的水体中添加1和2 g·L−1的硫酸钠可使美国红鱼30 d的成活率达100%，但1 g·L−1组的日增长率显著低于盐度为6‰ 的人工海水组，而添加2 g·L−1硫酸钠组 (${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$=1.27 mg/mg) 的日增长率与人工海水组无显著性差异[17]。Wang等[15]研究发现，在井水中添加0~4.8 g·L−1硫酸钠的条件下，虹鳟经过55 d的养殖后成活率均大于82%，且干质量无显著性差异。本研究采用人工海水素的方式，在盐度不变的条件下开展${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}} $对凡纳滨对虾的胁迫实验，结果显示${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$ 介于0.140~2.225时对虾成活率均超过70%，且无显著性差异 (p>0.05)，表明凡纳滨对虾对水中的${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} $有较强耐受性。顾晨等[13]在盐度为10‰ 的水体中添加硫酸钠，测得硫酸盐对凡纳滨对虾96 h LC50为54.71 mmol·L–1，即${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$=0.89，远低于本研究结果。苏家齐等[22]研究表明，Na+/K+、盐度与凡纳滨对虾幼虾第72 小时的成活率存在显著交互作用，在盐度大于8‰ 的条件下，对虾的成活率随Na+/K+ 的降低而升高。在顾晨等[13]的研究中，由于硫酸钠的添加使矿化度上升至约16.35 mg·L−1、Na+/K+上升至58.47，同时还引起了一价/二价阳离子等离子比的变化，降低了凡纳滨对虾对硫酸盐的耐受性。
本研究中，${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$范围为0.140~2.225的各组凡纳滨对虾生长未见显著性差异。对组织切片的对比发现，各组鳃组织亦无明显差异，但D组肝胰腺出现肝小管管腔增大变形，部分B细胞破裂的现象。B细胞不仅具有分泌功能，还具有消化吸收营养物质的作用[23]。本研究中凡纳滨对虾可能通过高能量代谢以应对硫酸盐的胁迫，进而加重了肝胰腺的消化负担，在SO42−/Cl− 为2.225的高${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} $胁迫条件下引起了B细胞的损伤。研究表明，在高盐度下印度对虾 (Penaeus indicus) 及凡纳滨对虾肝胰腺组织中B细胞体积增加，利于对虾从食物中获得更多能量以提高代谢水平，从而适应高盐度胁迫[24-25]。当饲料中蛋白含量过低时也会导致凡纳滨对虾肝胰腺管腔增大变形，B细胞破裂[26]。顾晨等[13]研究发现，凡纳滨对虾在60 mmol·L−1的${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} $胁迫下，72 h后肝小管体积扩大、部分肝小管星形管状结构消失，管腔与B细胞均显著增大，并认为B细胞体积增大可加速小管中营养物质的动员，帮助对虾适应硫酸盐胁迫。这些发现与本研究结果类似。
3.2 不同浓度硫酸盐对凡纳滨对虾肝胰腺和鳃组织酶活性的影响
在细胞中，SOD是抵御活性氧 (ROS) 的第一道防线，可去除ROS形成的前体O2−，将O2− 转换成氧气 (O2) 和过氧化氢 (H2O2)[27-28]。GSH-Px也是一种抗氧化酶，可还原H2O2和多种有机过氧化物以防止氧化损伤[29]。MDA作为脂质过氧化产物，是评价生物体氧化损伤的重要指标[30]。本研究中各组对虾肝胰腺和鳃组织MDA含量均无显著性差异 (p>0.05)，表明在实验范围内SO4 2−/Cl− 未对肝胰腺和鳃组织造成明显的氧化损伤。顾晨等[13]研究表明，在高于凡纳滨对虾96 h LC50的硫酸钠胁迫条件下，对虾肝胰腺中MDA含量在第96小时达到最低且显著低于第0小时，证实了凡纳滨对虾肝胰腺在应对高浓度硫酸盐胁迫时具有有效的抗氧化能力。本研究中，凡纳滨对虾肝胰腺和鳃的SOD和GSH-Px活性随硫酸盐浓度的增大先呈升高趋势，B与C组SOD和GSH-Px活性均高于对照组，表明凡纳滨对虾通过提升抗氧化酶活性来应对硫酸盐胁迫带来的应激。Shivangi等[31]探究了缺钾水体中添加硫酸盐对尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 肝脏抗氧化能力的影响，结果表明，在不同的钾离子浓度下，硫酸盐水体中的尼罗罗非鱼的SOD和GSH-Px活性均高于无硫酸盐组。Hu等[16]研究发现，拟穴青蟹的血液SOD活性也随硫酸盐浓度的升高呈先上升后下降的趋势，并认为SOD活性的降低可能是由于盐度变化减弱了盐度胁迫的压力。以上研究中SOD和GSH-Px活性随硫酸盐浓度升高而上升或呈现初期上升的现象均与本研究结果相一致。本研究中，D组凡纳滨对虾肝胰腺和鳃的SOD和GSH-Px活性低于B、C组，展现出高${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} $浓度下活性下降的趋势，同时组织中MDA含量低于对照组，可能是由于在高${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} $浓度胁迫下其他抗氧化酶或抗氧化因子升高导致了对虾氧化应激缓解，继而导致SOD和GSH-Px活性下降，有待于结合总抗氧化能力、过氧化氢酶等相关指标开展进一步研究。
ACP和AKP是调控信号转导、代谢和环境适应的重要酶[16]；还是溶酶体酶的重要组成部分，可作为评价凡纳滨对虾免疫状态的重要指标[32]。TYR又称酚氧化酶，由TYR参与的酚氧化酶原激活系统在活化过程中产生一系列具有生理活性的物质，通过多种方式参与宿主防御体系[33]。本研究中，随着${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$ 的上升，凡纳滨对虾鳃组织ACP、AKP、TYR活性均呈下降趋势，且D组与A组相比均差异显著 (p<0.05)。对虾鳃组织是呼吸和渗透调节的重要器官，参与消除病原体的免疫反应，同时也是血淋巴与外界接触的主要场所[34]。相关研究表明，在一些毒性较低的化合物或离子如非离子氨、低钾等胁迫下，凡纳滨对虾血淋巴的免疫酶也受到抑制[35-36]。本研究中${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$未对对虾存活造成显著性影响 (p>0.05)，但对鳃组织免疫酶活性表现出明显的抑制效应，与上述研究结果相似。本研究发现，对虾肝胰腺组织中的TYR活性随${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$的升高而降低，但与ACP、AKP一样，在各组间无显著性差异 (p>0.05)，这种变化趋势与鳃组织中的表现存在差异。对虾鳃组织直接与水生环境接触，能更快地响应环境中有害物质的影响[37]，因此鳃组织中的免疫相关酶可能比肝胰腺更易受到水中硫酸盐含量变化的影响。
Na+/K+-ATPase在细胞的渗透调节中起着重要作用[38]。在龙虾 (Homarus americanus) 和大西洋鲑 (Salmo salar) 中，Na+/K+-ATPase分别通过提供电位梯度或参与渗透调节的方式，在肝胰腺和肾组织的氯-硫酸盐转运蛋白介导的硫酸盐排泄过程中起重要作用[39-40]。本研究中，各组盐度保持不变，不同组对虾鳃和肝胰腺组织中的Na+/K+-ATPase活性差异均不显著，表明凡纳滨对虾对硫酸盐的转运机制可能与龙虾和大西洋鲑不同，这有待于进一步研究。
综上，在盐度为5‰、对应的${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$ 范围为0.140~2.225的环境下，凡纳滨对虾成活率和特定生长率均无显著性差异 (p>0.05)。在${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$ 为2.225的环境条件下，凡纳滨对虾肝胰腺B细胞破裂，鳃组织ACP、AKP、TYR活性显著降低。因此，在开发利用高硫酸盐含量的盐碱水进行凡纳滨对虾养殖时，应重点关注水中硫酸盐的浓度。在盐度为5‰ 的条件下，水中${\mathrm{SO}}_4^{2{\text{−}}} /{\rm{Cl}}^{\text{−}}$ 范围以0.140~1.127为宜。
致谢: 本研究承蒙澳大利亚的Dr. Wayne O′Connor提供澳大利亚的珍珠贝样品，广西海洋研究所阎冰先生提供广西北海的样品，广东省珍珠养殖场黄碧光场长提供广东大亚湾的样品，谨此致谢！ -
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图 1 种间ITS 2序列比对分析结果(显示单核苷酸多态(SNP)位点)
Figure 1. The alignment of six species ITS 2 sequences(showing the single nucleotide polymorphic sites).
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图 2 6种珠母贝的UPGMA无根系统发育树
注：图中数字为bootstrap检测值，小于50%的未给出
Figure 2. Unrooted UPGMA tree showing the genetic relationships of the six Pinctada species
Note: The number near the branch is bootstrap test value, value less than 50% are not shown.
表 1 样品种类、采集地点以及ITS 2的扩增片段长度、基因型及其序列号
Table 1 Species, sampling localities as well as amplified fragment length, genotype and accession numbers of ITS 2
种类及采样地点
species and locality代码
code基因型
genotypeITS 2(bp) 总长(bp)
length(bp)GenBank序列号
accession number大珠母贝P.maxima
(海南三亚/ Sanya, Hainan)pmax pmax1 211 525 AY877505 pmax2 211 525 AY883851 pmax3 211 525 AY877504 珠母贝P.margaritifera
(海南三亚/ Sanya, Hainan)pmar pmar1 215 529 AY877507 pmar2 214 528 AY883850 pmar3 215 529 AY877506 白珠母贝P.albina
(澳大利亚/ Port Stephens)palb palb1 251 565 AY877508 palb2 251 565 AY883846 长耳珠母贝P.chemnitzi
(海南三亚/ Sanya, Hainan)pche pche1 251 564 AY877511 pche2 251 564 AY883848 pche3 251 564 AY877510 pche4 252 565 AY877509 pche5 252 565 AY883847 黑珠母贝P.nigra pnig pnig0 254 - AY192714 pnig1 254 - AY282728 pnig2 254 - AY282729 pnig3 254 - AY282730 合浦珠母贝P.fucata
(海南三亚/ Sanya, Hainan(hn)，广东大亚湾/ Daya Bay (db), Guangdong和广西北海/Beihai (bh), Guangxi)db db1 235 548 AY877581 db2 231 544 AY877604 bh bh1 233 546 AY877583 bh2 231 544 AY877605 hn hn1 237 550 AY877592 hn2 230 543 AY877597 
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表 2 种间单核苷酸突变
Table 2 Interspecific single nucleotide mutation
种类
species大珠母贝 珠母贝 白珠母贝 黑珠母贝 长耳珠母贝 合浦珠母贝 大珠母贝 P.maxima - 8 21 21 23 20 珠母贝 P.margaritifera 6 - 25 26 23 20 白珠母贝 P.albina 31 26 - 1 19 18 黑珠母贝 P.nigra 33 31 4 - 19 17 长耳珠母贝 P.chemnitzi 22 22 34 34 - 14 合浦珠母贝 P.fucata 21 19 31 32 24 - 注：对角线下为颠换突变，对角线上为转换突变
Note：transiversion-lower diagonal, transition-upper diagonal
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表 3 珠母贝属种内与种间的遗传距离
Table 3 Intraspecific and interspecific genetic divergences of pearl oysters in Pinctada
种类species 1 2 3 4 5 6 1max 0.010 2mar 0.088 0.011 3alb 0.271 0.280 0.004 4nig 0.287 0.301 0.034 0.014 5che 0.318 0.313 0.096 0.115 0.006 6pfuc 0.268 0.280 0.233 0.238 0.223 0.014 注：对角线为种内遗传距离，对角线下为种间遗传距离
Note：intraspecific-diagonal, interspecific-belon diagonal
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