在淡水鱼类中，罗非鱼由于其生命力强、营养价值高、适应性广而被全球74个国家引进养殖。罗非鱼除了可被直接烹煮食用外，还被加工成冷冻生鱼片进行出口贸易，有很高的经济效益。但由于罗非鱼体形较扁，鱼片利用率只占整条鱼的46%，而鱼片加工废弃物却占54%，其中鱼头占26.5%，内脏占6.8%，鱼排占16.5%，鱼鳞占2.2%。近年来, 随着罗非鱼鱼片加工业的蓬勃发展，罗非鱼加工废弃物越来越多，所以很有必要开展罗非鱼加工废弃物综合利用的研究，以降低罗非鱼的加工成本，提高罗非鱼的利用价值和经济价值。近年来，我国已有不少采用海产品制作调味品的报道，如利用虾头、牡蛎等原料生产虾酱、蠔油等，但市场上所见到的高档鲜味酱油却很少，多是日本进口的小包装产品，价格昂贵^[1]。本文以罗非鱼加工废弃物为原料，经酶法水解、过滤调配等工序研制开发营养丰富，风味独特，高附加值的新型营养调味料，为罗非鱼加工废弃物的高值化利用开辟一条新路。

1.   材料和方法

1.1   材料

罗非鱼加工废弃物：罗非鱼取鱼片后的加工下脚料(头、鱼排和内脏)，收集后冷冻保存，由鹭业水产广州有限公司提供。

酶制剂：木瓜蛋白酶，实测酶活力60万U ·g^-1，广州酶制剂品厂出品；Alcalase, 实测酶活力0.6万U · g^-1，丹麦诺和诺德公司出品；Neutrase，实测酶活力0.5万U · g^-1，丹麦诺和诺德公司出品；Flavourzyme，实测酶活力0.37万U · g^-1丹麦诺和诺德公司出品。菠萝酶，实测活力6.8万U ·g^-1，茂名高活力菠萝酶有限公司出品。

辅料：食盐、白砂糖、淀粉、老抽酱油、葡萄糖、黄原胶等为市售。

1.2   主要仪器

T25B型均质机、LDZX-40CI高压灭菌器、LXJ-64-01高速离心分离机、HWS24恒温水浴反应器、N-1000V-W旋转蒸发仪、pH83-1型酸度计等、SD1000喷雾干燥器、YG16封口机等。

1.3   分析检测方法^[2-3]

总氮量测定采用半微量凯氏定氮法。

氨基酸态氮(FAN)测定采用甲醛滴定法。

酶活力的测定采用Folin-酚法。

1.4   工艺流程

罗非鱼加工下脚料(头、鱼排、内脏)→清洗、斩碎→捣碎→(蛋白酶)保温酶解→过滤→浓缩→辅料调配→均浆→灌装→灭菌→检验→成品。

1.5   操作要点

1.5.1   原料预处理

将冰冻罗非鱼加工废弃物用流水缓慢解冻, 清除表面异物及变质部分，沥干水分后，将鱼头、鱼排斩碎成小块, 在组织捣碎机上捣碎，成均匀料浆。

1.5.2   保温酶解

据实验要求，加入酶，在一定的温度、pH、时间下在恒温水浴反应装置中进行酶解。最后升温至85℃，加热5 min，使蛋白酶钝化，结束酶解。

1.5.3   过滤浓缩

将水解液用120目双层滤布经离心过滤后，在旋转蒸发仪上浓缩至原体积的一半。

1.5.4   调配、均浆

调配时先将白砂糖放入锅内炒焦, 再将浓缩酶解液倒入并不断搅拌，待焦糖溶解后, 徐徐加入淀粉及其它乳化稳定剂，搅拌均匀后保温8~10 min，然后加入老抽酱油、食盐等调味料, 并在料液温度70~80℃、压力35 MPa条件下均质2次。

1.5.5   灌装、灭菌

采用玻璃瓶装, 灌装温度80~90℃, 灭菌条件80℃下进行巴氏杀菌30 min。

1.6   感官检验

由5位专业人员组成感官评价小组，对产品的色泽、风味、稳定性、形态等进行全面评价，评价标准如下。

稳定性：(1)均一，无沉淀，不分层(25~30分)；(2)均一，无沉淀，静置一段时间后有一些分层(20~25分)；(3)均匀，静置一段时间出现沉淀或明显分层(小于20分)。

形态：(1)粘稠适中，半透明体，呈半流体状，无颗粒(20~15分)；(2)粘稠适中，不透明，呈半流体状，无颗粒(15~10分)；(3)过稀或过稠，不透明，有颗粒感，(小于20分)。

风味：(1)有鱼香味，无苦涩及其它异味，协调，(25~30分)；(2)有鱼鲜风味，细腻适口，无苦涩和异味(20~25分)；(3)有腥味或不良滋味，协调性差，(小于20分)。

色泽：(1)红亮褐色(15~20分)；(2)棕褐色(10~15分)；(3)色泽暗淡或发黑，(小于10分)。

2.   结果与讨论

2.1   不同蛋白酶对罗非鱼加工废弃物的水解效果

本研究中分别选用木瓜蛋白酶，Alcalase, Neutrase，Protamex, Flavourzyme，菠萝酶对罗非鱼加工废弃物进行水解，以游离氨基酸态氮含量和风味为评价指标，固液比(下脚料与去离子水质量比)为1∶ 1，酶的加量为2 000 U · g^-1，在各酶相应的最适作用条件下水解4 h，其最适作用条件根据文献[4]和[5]和初步试验确定，加热灭酶5 min, 4 200 r · min^-1离心15 min，取上清液分别进行氨基酸态氮含量测定和风味评价，结果见表 1。

表  1  几种蛋白酶对罗非鱼加工废弃物的水解效果

Table  1.  The hydrolyze results for different enzymes

酶种 enzyme species	pH	温度/℃ temperature	氨基酸态氮 /mg·mL-2 AN	风味 flavour
Bromelain	6.5	50	453	菠萝风味, 鱼腥味
papain	6.5	50	400	难闻异味
Neutrase	7.0	45	343	鱼腥味
Alcalase	8.0	55	428	淡鱼腥味
Protamex	7.0	55	433	淡鱼腥味
Flavourzyme	6.5	50	420	风味好

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由表 1可知，在同样的水解时间下，菠萝酶的水解液中游离氨基酸的含量最高，效果较好；而从风味来说，木瓜蛋白酶的口感最差，有难闻的木瓜与鱼腥相混合的异味，菠萝酶的口感有菠萝的清香味，伴有淡的鱼腥味，而Flavourzyme酶水解后风味最好。由于菠萝酶易获得，价格适中，综合结果认为，采用单酶水解，以菠萝酶较适宜，但水解风味需改善。

2.2   几种双酶复合水解效果分析

由于Flavourzyme包含有内切肽酶和外切肽酶2种活性，可以脱除低水解度底物苦味蛋白水解液的苦味，根据文献报道，其能改善鸡肉水解物的风味，水解液无苦味，这在单酶水解条件下也得以证实，故将Flavourzyme作为改变酶解液风味和增加水解度考虑，与其它酶混合水解，水解结果见表 2。由菠萝酶与Flavourzyme混合水解的效果比其它酶与Flavourzyme混合水解的效果好, 而菠萝酶先加入水解一段时间再加入Flavourzyme继续水解，结果比这2种酶同时加入水解效果更好, 所以采用先加入菠萝酶，后加入Flavourzyme的混合酶水解效果好。

表  2  几种双酶水解效果比较

Table  2.  Comparison of hydrolysis degrees between different enzymes or mixed enzymes

序号 no	酶种及组合 enzyme species and mixture	氨基酸态氮/ mg·mL-2 AN	风味 flavour
1	Bromelain+Flavourzyme①	733	鲜, 淡鱼腥味
2	Bromelain+Flavourzyme②	720	鲜, 淡鱼腥味
3	Protamex+ Flavourzyme①	598	鲜, 淡鱼腥味
4	Neutrase+ Flavourzyme①	521	鲜, 淡鱼腥味
5	Alcalase+ Flavourzyme①	675	鲜, 淡鱼腥味
注：①先加菠萝酶后加Flavourzyme; ② 2种酶同时加入 Note: ① added one after another; ② added simultameously.

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2.3   双酶复合水解最适条件的确定

在确定的双酶水解条件下，在其它水解条件相同时，改变底物浓度，固液比分别以2∶ 1，1∶ 1，1∶ 2进行实验，测得水解液中的游离氨基酸含量分别为699、756、578 mg · mL^-2，结果表明底物浓度以固液比1∶ 1效果最好。在此底物浓度下, 采用正交试验L₉ (3)⁴，安排了菠萝酶与Flavourzyme复合酶的处理方案，考察了加酶量(菠萝酶/Flavourzyme)(A)、温度(B)、水解时间(C)和pH值(D)4个因素对下脚料水解的影响，试验中，先加入菠萝酶进行水解, 后加入Flavourzyme进行水解, 以水解过程产生的游离氨基氮为指标，正交试验的结果见表 3、表 4。

表  3  双酶复合水解的因素水平表

Table  3.  Factors and levels in the experiment of compound hydrolyze by enzymes

水平 level	因素factor
	加酶量/ U·g-1 added enzyme dosage A	酶解温度/℃ temperature B	时间/h time C	pH D
1	1 500/500	45	2/2	6.0
2	2 250/750	50	3/2	7.0
3	3 000/1 000	55	4/2	自然pH

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表  4  双酶复合水解正交试验结果

Table  4.  The L₉(3)⁴orthogonal design and results of compound hydrolyze by enzymes

编号 no	A	B	C	D	氨基酸态氮/% α-amino nitrigen
1	1	1	1	1	1.18
2	1	2	2	2	1.23
3	1	3	3	3	1.20
4	2	1	3	2	1.39
5	2	2	1	3	1.42
6	2	3	2	1	1.29
7	3	1	2	3	1.15
8	3	2	3	1	1.27
9	3	3	1	2	1.13
K1/3	1.20	1.24	1.25	1.25
K2/3	1.37	1.31	1.22	1.25
K3/3	1.18	1.20	1.29	1.26
R	0.19	0.11	0.07	0.01

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由表 3、表 4可见，加酶量是影响酶水解效果的主要因素，其次是温度、水解时间，而pH的影响最小。L₉(3)⁴正交试验结果显示复合酶水解的最佳工艺条件是A₂B₂C₃D₃，即在水解底物的自然pH，50℃下，菠萝酶加入量为2 250 U · g^-1，水解4 h，再加入Flavourzyme 750 U · g^-1，在同样条件下继续水解2 h。由于水解时间不是主要影响因素，而水解时间太短, 酶解不充分，水解时间太长，影响水解液风味，综合考虑之后，总的水解时间确定为5 h。以确定的优化条件进行重复实验，其中水解时间以菠萝酶水解3 h，Flavourzyme水解2 h，结果水解液游离氨基酸态氮达到1.42%，水解度为80%，水解效果好。

2.4   调味液的调配试验^[6-7]

将浓缩酶解液与辅料(食盐、老抽酱油、白砂糖、料酒、乳化制、姜和甘草汁等)进行调配，实验显示酶解液添加量、乳化制和酱油对产品的风味、色泽、形态影响较大，其中黄原胶与淀粉比例合适时能显著改变制品的粘稠度。对酶解液添加量(A)、淀粉(B)、老抽酱油(C)和黄原胶(D)4因素各先取3水平进行L₉(3)⁴正交试验，以色泽、风味、稳定性、形态进行感官评价，得出综合评分，试验结果见表 5。

表  5  调味液主要成分L₉(3)⁴正交试验结果

Table  5.  The L₉(3)⁴ orthogonal design and results of basis condiment

编号 no	A %	B %	C %	D %	综合评分 synthesis grade
1	20	4.5	4	0.10	80
2	20	5.5	6	0.15	82
3	20	6.5	8	0.20	92
4	30	4.5	6	0.20	84
5	30	5.5	8	0.10	81
6	30	6.5	4	0.15	90
7	50	4.5	8	0.15	85
8	50	5.5	4	0.20	79
9	50	6.5	6	0.10	80
K1/3	84.6	83	83	80.3
K2/3	85	80.6	82	85.7
K3/3	81.3	87.3	86	85.0
R	3.7	6.7	4	5.2

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实验结果表明，以淀粉和黄原胶为主要因素，最佳组合水平为A₂B₂C₃D₂，即酶解液30%，淀粉6.5%，黄原胶0.2%，老抽酱油8%。按此比例添加，产品具有鱼香味，稠度适中，不易分层，老抽酱油的加入可不用添加焦糖色素，产品红亮褐色。抽提型调味料如鸡精的成本就要8元· kg^-1，相比之下，采用罗非鱼加工废弃物为原料，价格低廉，酶水解浓缩之后，制成酶解型调味料。浓缩酶解液添加量为30%时，产品具有多层次、圆润的味道，后味甘香，而传统的味精等的化学调味料虽然味道强烈，但味道单调，不圆滑，后味较差，有的会引起口干等不适症。

2.5   调味料的氨基酸分析

水产调味料的营养价值，和呈风味的含氮营养物质密不可分，例如氨基酸、肽和核苷酸等营养物质。罗非鱼加工废弃物经过酶解后，蛋白质水解为小肽和游离氨基酸，对调味料进行氨基酸分析，由表 6结果可知，调味料营养丰富均衡，含有18种氨基酸，种类齐全。氨基酸总量为2.73%, 必需氨基酸占39.6 %, 氨基酸组成与FAO/WHO推荐的氨基酸组成较接近，这些氨基酸对人体有重要的营养价值。各种氨基酸中，谷氨酸含量最高，是主要的呈鲜味氨基酸，与核苷酸相辅相成，使产品鲜味更佳。另外，脯氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、精氨酸和甘氨酸这些呈味氨基酸的含量也较高，并且含有少量牛磺酸, 它们的存在使调味料呈现圆润柔和的甜味及鲜味，水产调味料的独特风味正源于此。

表  6  调味料氨基酸成分含量

Table  6.  Amino acid composition of the condiment

氨基酸 amino acids	调味料中含量/% content		氨基酸 amino acids	调味料中含量/% content
Gly	0.24		Asp	0.27
Ala	0.21		Glu	0.38
Val	0.16		Tyr	0.06
Leu	0.22		Phe	0.12
Ile	0.14		Pro	0.14
Ser	0.07		Trp	0.02
Thr	0.10		Arg	0.18
Met	0.08		Lys	0.23
Cys	0.002		His	0.06
Tau	0.05

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3.   结论

(1) 罗非鱼加工过程产生大量的废弃物，为了解决这部分废弃物的出路，研究了木瓜蛋白酶，Alcalase, Neutrase，Protamex, Flavourzyme，菠萝酶以及它们的各种组合水解罗非鱼加工废弃物中的蛋白质，结果表明不同酶的组合和添加顺序对水解效果有影响，采用菠萝酶与Flavourzyme双酶进行了水解，可大大提高水解液的氨基酸态氮的含量，并改善水解液的风味。

(2) 通过酶技术的应用，将罗非鱼加工废弃物酶解后，以酶解液为主原料，添加其它辅料调制成天然调味料，产品生产工艺简单，反应容易控制，生产周期短。利用水产加工中废弃物生产天然调味料，既充分挖掘资源潜力，降低成本费用，增加花色品种，又能大幅度节减三废治理的投资^[8]，经济效益高。

(3) 酶解型天然调味料是国际市场上风行的新型天然调味料，其主要成分为可溶性蛋白质、美味多肽、氨基酸、呈味核苷酸等，具有食品天然味感和香味，能最大限度地保持原有天然食品的味道和香气，在食品加工时赋予食品良好的风味，因而产品深受大众喜欢，具有广阔的发展前景。