Study on extraction of fish oil from wastes of fish surimi
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摘要:
研究以金线鱼和长蛇鲻的混合鱼糜生产下脚料为材料，利用钾法提取鱼油。结果表明，钾法提取鱼油的工艺参数为: 水解pH为7.5，水解温度70℃，水解时间55 min，硝酸钾用量4.5%，盐析时间30 min，在该条件下鱼油的提取率达到64.5%。鱼油的理化性质达到了SC/T3502-2000标准粗鱼油的二级要求。鱼油中饱和脂肪酸的含量较高，占总量的48.59%；单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的含量相当，分别为24.48%和24.49%，多不饱和脂肪酸主要是DHA和EPA，含量分别为11.18%和5.17%。
Abstract:Fish oil was extracted from the wastes of fish surimi by the potassium hydroxide hydrolysis. The results show that the process parameters of extraction of fish oil were as follows: hydrolysis temperature 70℃, hydrolysis pH 7.5, hydrolysis time 55 min, the amount of potassium nitrate 4.5%, the saltout time 30 min. Under these conditions, the extraction rate of fish oil was up to 64.5%.The physics and chemistry indexes accorded with the second crude fish oil demand for SC/T3502-2000 standard. The content of the saturated fatty acid was relatively high in fish oil, which accounted for 48.59% of the total amount. The content of monounsaturated fatty acid was equivalent to the content of the polyunsaturated fatty acid, 24.48% and 24.49%, respectively. The polyunsaturated fatty acids were mainly DHA and EPA, the content 11.18% and 5.17%, respectively.
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Keywords:
- fish surimi /
- waste /
- hydrolysis /
- fish oil
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明胶是胶原的局部水解产物，广泛应用于食品、医药及化妆工业。据报道，2006年全球的明胶总产量为28万t，其中中国的产量为3.1万t，且基本上是以牛、猪的皮骨为原料生产的[1]。近年来，由于疯牛病及口蹄疫对人类健康的影响，哺乳动物胶原蛋白在功能性食品、化妆品及药用产品的应用受到限制，人们开始寻求从水产动物如鱼类组织中提取明胶。然而，鱼类明胶大规模应用于食品工业，一方面要有充足的原料来源以满足明胶的工业化生产，另一方面鱼类明胶必须如同哺乳动物明胶一样，具有良好的流变学性质如凝胶强度、凝胶点及溶点等[2]。据FAO统计，2005年中国罗非鱼总产量达104万t，企业在加工冻罗非鱼片时，出肉率不足40%，每加工1 t罗非鱼片，约产生2 t的下脚料，留下大量的鱼皮、鱼头及鱼骨等废弃物，其中，鱼皮占了相当大的比例，是提取明胶潜在的原料。目前，工业化生产哺乳动物明胶通常使用酸法或碱法[3]，该法耗时长。也有报道利用氢氧化钠浸泡提取明胶[2]，此法用时较短，但仍需2 d以上。此文探讨了采用酸碱二元法提取明胶的工艺条件，旨在缩短罗非鱼皮明胶的提取周期，为工业化制备提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器设备
新鲜罗非鱼皮由湛江环球水产有限公司提供，经去鳞、清洗、除杂后冷冻至－18℃，备用。
羟脯氨酸及各种氨基酸标准品，Sigma公司产品；835-50型氨基酸自动分析仪，日本日立公司产品；UV-756MC紫外可见分光光度计，日本岛津公司产品；DK-98数显电热恒温水浴锅，余姚市东方电工仪器厂产品；101A2型电热鼓风干燥机，上海实验仪器有限公司产品；Tms-pro质构仪，Food Technology Corperation(U.S.A)产品；此试验所用试剂均为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 营养成分的测定
参照文献[4]，水分测定采用常压干燥法；灰分测定采用高温灼烧法；粗脂肪测定采用索氏抽提法；粗蛋白测定采用微量凯氏定氮法；总糖测定采用蒽酮比色法。
1.2.2 鱼皮蛋白质的氨基酸组成分析
样品经6 mol · L-1 HCL水解24 h，采用日立835-50型高速氨基酸分析仪分析17种氨基酸，另取样经5 mol ·L-1 NaOH水解后，采用同机测定色氨酸含量。
1.2.3 鱼皮胶原蛋白含量的测定
采用分光光度比色法测定[5]。通过测定鱼皮中羟脯氨酸含量，乘以相应的系数计算胶原蛋白的含量[6]。
胶原蛋白(%) =羟脯氨酸(%) ×14.7[7]
1.2.4 鱼皮明胶提取工艺流程
冻罗非鱼皮→解冻、漂洗→浸NaOH溶液→漂洗至中性→稀盐酸浸泡→漂洗至中性→熬胶→过滤→干燥→成品。操作要点：(1)鱼皮预处理解冻鱼皮，晾干剪碎按一定比例浸泡于NaOH溶液中，期间不时搅拌，然后浸泡于稀HCl溶液中，不断加快搅拌，使黑膜基本脱净，然后漂洗至中性，沥干。(2)鱼皮明胶的提取将经前处理过的鱼皮，按鱼皮重1.3倍加入水，恒温条件下熬胶，然后用200目筛过滤得澄清胶液，置于鼓风干燥箱内干燥，得到成品。
明胶得率(%) =干明胶重量(g) /鱼皮原重(g) ×100%
1.2.5 明胶提取试验方法
试验中以明胶得率及凝胶强度为指标，选择浸碱的浓度(A)、浸碱时间(B)及熬胶温度(C)3个因素，每个因素3个水平，按L9 (33) 正交表进行试验。正交试验因素水平见表 1。
表 1 正交试验因素水平表Table 1. Factors and levels of orthogonal test
NaOH浓度/% NaOH concentration 处理时间/h treatment time 熬胶温度/℃ extraction temperature A B C 1 2.0 3.5 55 2 2.5 4.0 65 3 3.0 4.5 75 1.2.6 鱼皮明胶理化及微生物指标测定
明胶的水分、pH、凝胶强度、菌落总数及大肠菌群等指标测定，参照文献[8]。凝胶强度以勃鲁氏(bloom)表示，在严格规定的条件下，直径为12.7 mm的圆柱，压入含6.67%(W/W)明胶的冻胶表面以下4 mm所施加的力，以g为单位。
2. 结果与讨论
2.1 罗非鱼皮基本成分
罗非鱼皮经去鳞后，清洗、沥干，取样进行基本成分分析，结果见表 2。
表 2 罗非鱼皮的一般营养成分Table 2. Nutrient contents of the skin of tilapia% 水分moisture 灰分ash 粗蛋白crude protein 粗脂肪crude lipid 总糖total sugar 65.01±0.25 1.17±0.01 33.14±0.03 1.56±0.02 0.05±0.01 从表 2可知，罗非鱼皮中粗蛋白含量高达33.14%(以湿基计)，与斑点叉尾NFDAA (Ictalurus punctaus)皮基本持平[9]，均高于淡水鱼鲢(Hypophthalmichthys molitrix)皮(25.9%)、鳙(Aristichthys nobilis)皮(23.6%)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)皮(29.8%)[10]及波罗的海鳕鱼(Gadus marhua)皮(24%)[7]，是较好的蛋白质来源原料。
2.2 罗非鱼皮蛋白质氨基酸组成
对罗非鱼皮进行水解，再用氨基酸自动分析仪测定其氨基酸含量，结果见表 3。
表 3 罗非鱼皮蛋白质氨基酸组成Table 3. Amino acid composition of the skin of tilapia氨基酸
amino acid样品中含量/%
content in sample粗蛋白中含量/mg·g-1
content in crude protein门冬氨酸Asp 2.16 65.3 苏氨酸*Thr 0.93 28.1 丝氨酸Ser 0.93 28.1 谷氨酸Glu 3.35 101.1 脯氨酸Pro 3.74 112.9 甘氨酸Gly 7.21 217.6 丙氨酸Ala 3.15 95.1 胱氨酸Cys 0.30 9.1 缬氨酸*Val 1.13 34.1 甲硫氨酸*Met 0.82 24.7 异亮氨酸*Ile 0.86 26.0 亮氨酸*Leu 1.37 41.3 酪氨酸Tyr 0.34 10.3 苯丙氨酸*Phe 1.04 31.4 赖氨酸*Lys 1.51 45.6 组氨酸His 0.37 11.2 精氨酸Arg 2.72 82.1 色氨酸*Try 0.06 1.8 总量total 34.57 必需氨基酸
essential amino acid7.72 注：*. 必需氨基酸
Note：*. essential amino acid从表 3中可知，在罗非鱼皮蛋白质的氨基酸组成中，必需氨基酸占氨基酸总量的22.33%，显然不是优质蛋白质。但其中的甘氨酸含量极为丰富，约占氨基酸总量的20%，符合胶原蛋白氨基酸组成特点。可见罗非鱼皮的蛋白质组成主要为胶原蛋白。
2.3 罗非鱼皮胶原蛋白含量
据报道，羟脯氨酸(Hyp)和羟赖氨酸(Hyl)是胶原蛋白的特有组成成分[11-12]，在其它非胶原蛋白中很少发现。通过测定鱼皮羟脯氨酸含量，即可计算出其胶原蛋白含量。比色法测定罗非鱼皮羟脯氨酸的含量为1.89%，则胶原蛋白含量为27.8%，占其粗蛋白含量的83.9%，与淡水鱼草鱼(77%)、鲤(Cyprinus carpio)、鲫(Carassius auratus)等鱼皮中的含量相似[13]。因此，利用罗非鱼加工下脚料中的鱼皮提取明胶，是既丰富又经济的原料。
2.4 罗非鱼皮明胶的提取
鱼皮预处理中，浸碱的浓度、时间及熬胶温度对明胶得率及其凝胶强度影响较大。因而选择浸碱的浓度(A)、浸碱时间(B)及熬胶温度(C)3个因素，每个因素3个水平，按L9 (33) 正交表进行试验。试验结果见表 4。
表 4 正交设计及结果Table 4. L9 (33)orthogonal design and resultA B C 得率/% yield 凝胶强度/g gel strength 1 1 1 1 26.2 679 2 1 2 2 24.83 603 3 1 3 3 23.41 558 4 2 1 2 19.07 627 5 2 2 3 23.45 609 6 2 3 1 21.24 669 7 3 1 3 14.06 547 8 3 2 1 16.28 524 9 3 3 2 17.59 474 得率/% yield K1 74.46 59.35 63.74 K2 63.76 64.56 61.49 K3 47.93 62.24 60.92 24.82 19.78 21.25 21.25 21.52 20.50 15.98 20.76 20.31 R 8.84 1.74 0.94 凝胶强度/g gel strength K1 1 840 1 853 1 872 K2 1 905 1 736 1 704 K3 1 845 1 701 1 714 613 618 624 635 579 568 515 567 571 R 120 51 56 注：A. NaOH浓度；B. 浸碱时间；C. 熬胶温度
Note：A. concentration of NaOH；B. treatment time；C. extraction temperature根据表 4极差R的大小判断，各因素对罗非鱼皮明胶得率影响主次关系为A>B>C，即浸碱浓度对得率影响最大，其次是浸碱时间，最适宜条件为A1B2C1；对凝胶强度而言，影响的主次关系为A>C>B，适宜条件为A2B1C1。
表 5 得率的方差分析Table 5. Variance analysis on gel yield变异来源
error sourcesSS DF MS F F0.05 A 118.768 2 59.384 8.554 19.00 B 4.542 2 2.271 < 1 19.00 C 1.482 2 0.741 < 1 19.00 误差error 13.884 2 6.942 总变异
total error138.678 8 注：A. NaOH浓度；B. 浸碱时间；C. 熬胶温度
Note：A. concentration of NaOH；B. treatment time；C. extraction temperature表 6 凝胶强度的方差分析Table 6. Variance analysis on gel strength变异来源
error sourcesSS DF MS F F0.05 A 24 538.89 2 12 269.45 12.16 19.00 B 4 224.23 2 2 112.12 2.09 19.00 C 5 920.89 2 2 960.45 2.93 19.00 误差error 2 017.56 2 1 008.78 总变异
total error36 701.56 8 注：A. NaOH浓度; B. 浸碱时间; C. 熬胶温度
Note：A. concentration of NaOH；B. treatment time；C. extraction temperature熬胶温度影响到胶原分子3股螺旋的次级键及部分肽键的断裂，随着温度的升高，胶原分子的单链、少量聚合体进入溶液，胶原转变为明胶。因此，明胶的提取温度一般要高于胶原纤维的收缩温度。但过高的温度会影响到明胶的性质。从方差分析结果来看，各因素不同水平间对罗非鱼皮明胶得率及凝胶强度影响不显著，即碱液浓度在2%~3%，对明胶得率影响不大；提取得到的明胶外观状态A2优于A1，故选择A2(2.5%)；结合凝胶强度结果，B1优于B2。温度在55~75℃间，对得率指标影响不显著，因此，选择C1水平，即55℃。综合上述分析，最终确定的最佳工艺条件为A2B1C1。即罗非鱼皮在2.5% NaOH浸泡3.5 h，然后用0.02% HCl处理3 h，去尽黑膜，再在55℃下熬胶提取明胶。
验证试验结果与分析一致，罗非鱼皮的明胶提取得率为26.5%，明显高于草鱼皮(19.2%)[14]及鳕鱼皮的明胶得率(12.3%)[7]。
2.5 罗非鱼皮明胶理化及微生物指标
对根据上述确定的提取工艺制得明胶, 对其理化及微生物指标进行测定，结果见表 7、表 8。
表 7 罗非鱼皮明胶理化指标Table 7. Physicochemical properties of fish skin geltin凝胶强度/g
gel strength粗蛋白*/%
crude protein水分/%
moisture灰分/%
ashpH 透明度/mm
transparency631 82.43 8.97 0.63 5.9 355 注：*粗蛋白含量=N×5.51[15]
Note：*The conversion factor for calculating the content of crude protein is 5.51.表 8 罗非鱼皮明胶理化及微生物指标Table 8. Microorganisms in fish skin geltin粘度/mPa·s viscosity 水不溶物/% insoluble solids 菌落总数/CFU·g-1 number of bacteria 大肠菌群coliform group 6.1 0.1 1.34×105 阴性 凝胶强度是衡量明胶质量的一个重要指标，其价格与用途都与此有关。一般来说，鱼类明胶的凝胶强度比哺乳动物明胶低[2]。罗非鱼皮在适宜的条件下提取的明胶，其凝胶强度为631 g，经含水量修正后计算的凝胶强度(含水量为12%)为468 g，优于国家标准GB6783-94皮食用明胶的B型A级，也明显高于黄鳍金枪鱼(Thunnus albacares)皮明胶(426 g)[2]、斑点叉尾NFDAA鱼皮明胶(415 g)[9]、草鱼皮明胶(267 g)[14]、牛皮及猪皮明胶(分别216和295 g)。这是因为明胶来源于胶原，胶原的特征影响其明胶的性质。罗非鱼是热带鱼，其明胶有较高的凝胶强度，与GÓMEZ-GUILLÉN等[16]的报道相一致。
3. 结论
罗非鱼皮中含有丰富的蛋白质，其主要成分为胶原蛋白，约占鱼皮粗蛋白的83.9%，氨基酸组成中甘氨酸含量约占氨基酸总量的20%；罗非鱼皮提取明胶较适宜的工艺条件是: 在2.5% NaOH浸泡3.5 h，然后用0.02% HCl处理3 h，去尽黑膜，并在55℃条件下熬胶，提取得率为26.5%；所得明胶的粗蛋白含量为82.46%，凝胶强度高达468 g，其它各项理化指标均优于B型A级皮食用明胶标准。因此，罗非鱼将是制备明胶的良好来源。
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图 5 硝酸钾用量对鱼油提取率的影响
Figure 5. Effect of the amount of potassium nitrate on the extraction rate of fish oil
表 1 L9(34)因素水平表
Table 1 L9(34)factors and levels
水平
levels温度/℃
temperaturepH 硝酸钾用量/%
the amount of potassium nitrate盐析时间/min
saltout timeA B C D 1 60 7.5 4.5 20 2 65 8.0 5.0 25 3 70 8.5 5.5 30 
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表 2 L9(34)正交试验方案与结果
Table 2 L9(34)orthogonal experiment design and result
试验号
no.温度/℃
temperaturepH 硝酸钾用量/%
the amount of potassium nitrate盐析时间/min
saltout time鱼油提取率/%
extraction rate of fish oilA B C D 1 60 7.5 4.5 20 61.3 2 60 8.0 5.0 25 60.8 3 60 8.5 5.5 30 60.7 4 65 7.5 5.0 30 60.9 5 65 8.0 5.5 20 55.3 6 65 8.5 4.5 25 58.2 7 70 7.5 5.5 25 63.8 8 70 8.0 4.5 30 62.7 9 70 8.5 5.0 20 59.3 K1 60.93 62.00 60.73 58.63 K2 58.13 59.60 60.33 60.93 K3 61.93 59.40 59.93 61.43 R 3.80 2.60 0.80 2.80
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表 3 鱼油的理化性质
Table 3 Physics and chemistry indexes of fish oil
指标
index测定值
measured value一级标准
primary standard二级标准
secondary standard外观appearance 浅黄色，稍有混浊 浅黄色或红棕色，稍有浑浊或分层 气味smell 具有鱼腥味，稍有鱼油的酸败味 具有鱼油的腥味，稍有鱼油酸败味 酸值/mg·g-1 acid value 1.8 ≤8 ≤15 过氧化值/mmol·kg-1 peroxide value 8.7 ≤6 ≤10 水分及挥发物/% water and volatile matter 0.42 ≤0.3 ≤0.5 不溶性杂质/% insoluble impurities 0.45 ≤0.3 ≤0.5 碘值/I2 g·100 g-1 iodine value 125.7 ≥120 不皂化物/% nonsaponifiable matter 1.3 - - 皂化值/mg·kg-1 saponification value 161.88 - -
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表 4 鱼油的脂肪酸组成
Table 4 Fatty acids composition of fish oil
序号
no.保留时间/min
retention time脂肪酸
fatty acid含量/%
relative content1 3.64 14：0 4.26 2 4.72 15：0 1.47 3 6.25 16：0 30.90 4 6.76 16：1 7.58 5 8.13 16：2 1.26 6 8.38 17：0 1.65 7 11.42 18：0 9.22 8 12.16 18：1 15.24 9 13.97 18：2 0.79 10 16.71 18：3 0.56 11 19.26 20：0 0.58 12 19.81 20：1 1.66 13 21.16 20：2 0.43 14 22.44 20：3 1.68 15 22.84 20：4 0.31 16 24.12 20：5(EPA) 5.17 17 24.74 22：0 0.51 18 28.58 22：3 0.67 19 29.64 22：4 0.64 20 31.20 22：5 1.80 21 32.51 22：6(DHA) 11.18 22 其他others 2.44 饱和脂肪酸saturated fatty acid 48.59 单不饱和脂肪酸monounsaturated fatty acid 24.48 多不饱和脂肪酸polyunsaturated fatty acid 24.49 DHA+EPA 16.35
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