Analysis on genetic diversity of mtDNA control region sequences of the wild population of Peneanus monodon from Shenzhen′s sea area
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摘要:
采用聚合酶链式反应技术对深圳斑节对虾种群的20个个体进行了分析，通过对mtDNA的控制区基因序列进行扩增，获得了大小约为650 bp的扩增产物。PCR产物经纯化后进行序列测定，得到了526 bp的核苷酸序列。用Clustal _ X排序软件对控制区序列进行了对位排列。通过Mega软件对所得线粒体控制区序列的片段进行比较，共检测出114个碱基存在变异，其中包括84个简约信息位点，5个碱基存在插入/缺失；并用Mega的“Pairwise distance”计算个体间的相对遗传距离。结果表明：其序列差异(转换+颠换)在0.010~0.154之间，得出20个个体有20种单倍型；并构建了UPGMA和NJ系统树。运用DNASP软件计算所得该群体核苷酸多样性(Pi)和平均核苷酸差异数(K)分别为0.05278和27.500。研究结果表明：深圳斑节对虾野生种群控制区序列个体变异程度很大，该种群的遗传多样性水平很高，适合于群体内及群体间不同个体的遗传多样性分析。
Abstract:The PCR technique was used to analyze the mtDNA control region sequences in 20 individuals of P.monodon in Shenzhen′s sea area. A series of nucleotide fragments with about 650 bp were obtained. The PCR products were purified and sequenced. As a result, a series of 526 bp nucleotide sequences of partial control regions were obtained. The 20 sequences were arranged in counterpoint by Clustal _ X software. And then, comparing the control region fragments with each other by Mega software, 114 sites were variable among all the partial mitochondrial control region sequences including 84 parsimonious message sites and five deletion / insertion sites. The relative genetic distances were calculated among individuals by "Pairwise distance" method of Mega. The results indicated that the differentiation of the 20 sequences ranged from 0.010 to 0.054 and showed 20 kinds of haplotypes among 20 individuals. The UPGMA and NJ phylogenetic trees were established by the cluster analysis. The number of polymorphic sites (S) was 114; the nucleotide diversity (Pi) and the average number of nucleotide differences (K) were 0.05278 and 27.500, respectively. It can be concluded that the variation in mtDNA control region sequences of P.monodon in Shenzhen′s sea area was greater relatively. So the genetic diversity of P.monodon in Shenzhen′s sea area was higher relatively. As a result, mtDNA control region sequences can be used to scan genetic diversity of populations.
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Keywords:
- Penaeus monodon /
- mitochondria /
- control region sequence /
- genetic diversity
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斑节对虾(Penaeus monodon)广泛分布于西太平洋和印度洋沿岸的大部分地区，我国的浙江、福建、广东、海南、广西以及台湾省沿岸都有分布，这种虾是对虾科中个体最大的一种，具有生长快、个体大、肉味鲜美、营养丰富、产量高等优点，是我国及东南亚各国对虾养殖的重要对象。由于长期的过度捕捞和养殖活动对斑节对虾资源的影响、种质资源状况的变化开始受到关注。
国外关于斑节对虾野生种群的遗传结构和遗传变异水平的报道较多，如：KLINBUNGA等[1]以mtDNA-RFLP对安德曼海和泰国湾3个斑节对虾种群的遗传结构和遗传分化进行了研究。BENZIE等[2]应用RAPD的方法对澳大利亚不同种群的遗传结构和遗传差异分析。SUGAMA等[3]对印度尼西亚的7个地理野生种群进行了遗传差异分析。TASSANAKAJON等[4]应用RAPD方法对泰国的斑节对虾不同地理种群进行了遗传差异分析。而在国内，只有对斑节对虾养殖群体进行过遗传的相关分析。2002年，邹志华和黎中宝[5]应用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对斑节对虾的养殖群体进行了8种等位酶的电泳检测和谱带遗传分析。沈琪等[6]利用RAPD对凡纳滨对虾、细角对虾和斑节对虾进行了鉴定标记。但是，还未见国内斑节对虾野生种群的遗传结构和遗传差异分析的报道。由于线粒体DNA(mtDNA)具有进化速率快、群体内变异大、分子结构简单、基本序列清楚及严格的母系遗传等特点，已成为种内、种间遗传分化关系研究的有力工具。本研究通过测定斑节对虾mtDNA控制区序列片段，分析了深圳斑节对虾野生种群控制区序列片段的多态性，为研究我国海域的遗传结构和多样性现状提供了科学依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
该试验用虾于2004年采自深圳海域的野生个体，每个个体取新鲜肌肉，于75%酒精中4℃冰箱保存。样品编号依次为：1~20。
1.2 实验方法
1.2.1 总DNA的提取
每尾取约0.1 g肌肉剪碎，使其酒精完全挥发干，加入500 μL TEN9细胞裂解缓冲液(Tris · Cl 50 mmol · L-1，pH 9.0；EDTA 100 mmol · L-1；NaCl 200 mmol · L-1)，终浓度为2%的SDS和1 mg · mL-1的Protein K，混匀后，55℃消化过夜，分别用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶ 24∶ 1)和氯仿抽提(除去蛋白质等杂质)，直至无蛋白质中间相，再用2倍体积的无水乙醇沉淀，70%酒精洗涤后，用100 μL无离子超纯水溶解，－20℃存放。
1.2.2 线粒体DNA控制区基因片段的PCR扩增及序列测定
用于PCR扩增的引物序列为12S(5′-AAGAACCAGCTAGGATAAAACTTT-3′)和PCR-1R(5′-GATCAAAGAACATTCTTTAACTAC-3′)[7]。扩增的反应总体积为50 μL，其中10×Ex Taq Buffer(Takara)5 μL，Ex Taq polymerase(Takara 5 U · μL-1)0.4 μL，dNTP(Takara 2.5 mmol · L-1)4 μL，10 pmol · μL-1引物1.5 μL，2 μL模板DNA，补足灭菌双蒸水至50 μL。扩增条件为94℃预变性3 min，之后进行35个循环(94℃ 15 s，48.5℃ 20 s，72℃ 40 s)，最后72℃延伸5 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收后纯化。纯化后的产物送至博亚公司测序。
1.2.3 数据处理
使用Clustal _ X排定DNA序列并经人工核对、矫正。Mega软件计算个体间的遗传距离，并构建UPGMA和NJ系统树；DNASP软件计算遗传多样性参数。
2. 结果
2.1 控制区片段的序列特征及群体内的序列变异
PCR产物直接测序得到526 bp长度的碱基序列见图 1。
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图 1 深圳斑节对虾的控制区片段的核苷酸序列(单倍型A)Fig. 1 The nucliotide sequence of control region fragment of P.monodon(haplotypes A)20个个体的mtDNA控制区序列，在除去引物及部分端序列后，其碱基序列长度为526 bp。通过Mega软件对所得的序列进行比较，共检测出114个碱基存在变异，其中包括84个简约信息位点，共20种单倍型。其中，缺失/插入位点5个，发生转换突变的核苷酸位点数为30个，发生颠换突变的核苷酸位点数为84个。T、C、A、G 4种碱基在20个个体中的平均含量分别是39.8%(38.7%~41.1%)、9.2%(8.6%~10.0%)、40.8%(40.0%~41.7%)、10.2%(9.0%~11.1%)，AT(80.6%)含量远高于GC含量(19.4%)。这一结果与其他研究者得到的甲壳类、双壳类的16S rRNA和12S rRNA基因得到的碱基组成一致[8-9]。
2.2 群体内遗传多样性分析
通过DNASP软件计算出20个个体的主要遗传多样性参数为：多态性位点数(S)为114，核苷酸多样性(Pi)为0.05278，平均核苷酸差异数(K)为27.500。目前还没有斑节对虾野生种群的线粒体控制区序列片段遗传多样性参数，因此无法比较。
应用Mega软件计算20个个体的遗传距离，得到的遗传距离最大值为0.154，最小值为0.010，即任何2个个体的核苷酸序列不完全相同，故共有20种单倍型。以20个个体的控制区序列构建的UPGMA系统树和NJ系统树分别如图 2和图 3所示。可以看出，2种方法得到的系统树的拓朴结构基本一致, 20个个体明显的形成了2大分支。线粒体DNA属于母系遗传，可推断该群体的20个个体可能来源于2个不同的母系祖先。
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图 2 由部分控制区序列得到的UPGMA系统树Fig. 2 UPGMA phylogenetic tree based on control region sequences3. 讨论
建立在DNA水平上的分子遗传标记技术是近几年发展起来的，主要包括mtDNA序列分析、RFLP技术、AFLP技术、RAPD技术以及SSR技术等。而mtDNA序列分析较其它的分子标记技术更为直接、准确和可靠，可更灵敏的分析个体、群体及种间的遗传变异情况。从遗传学和进化角度看，一个物种的遗传多样性高低与其适应能力、生存能力和进化潜力密切相关。物种的遗传多样性越丰富，其适应能力、生存能力和进化潜力就越大；反之，遗传多样性的降低，可导致其适应能力、生存能力降低，随之就是物种的退化，最后可能威胁到物种的生存。动物mtDNA由于具有分子量小、结构简单、母性遗传、一级结构进化速度快等特征而成为一种优良的分子标记技术，在动物的群体遗传学和遗传变异研究有着广泛的应用。本研究对mtDNA控制区序列分析所得到的群体核苷酸多样性(Pi)比BENZIE等[10]分析的澳大利亚的和非洲东南部的斑节对虾群体核苷酸多样性大的多，而和印尼的斑节对虾群体核苷酸多样性差不多，都为0.05左右。本研究得到的多态性位点比例比TASSANAKAJON等[11]用RAPD方法分析泰国野生斑节对虾的低的多。
本研究从mtDNA控制区序列获得的群体遗传多样性参数和个体间的遗传关系都说明了深圳斑节对虾野生资源群体目前的遗传多样性非常丰富，该研究结果对斑节对虾的遗传育种等相关研究工作可能具有一定的参考价值。
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图 1 深圳斑节对虾的控制区片段的核苷酸序列(单倍型A)
Figure 1. The nucliotide sequence of control region fragment of P.monodon(haplotypes A)
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图 2 由部分控制区序列得到的UPGMA系统树
Figure 2. UPGMA phylogenetic tree based on control region sequences
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