DNA extraction of the pearl oyster Pinctada fucata and optimization of RAPD conditions
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摘要:
分别从保存于-70℃和95%乙醇的合浦珠母贝组织提取总DNA。结果表明,乙醇保存标本用双蒸馏水预处理后所提的DNA与-70℃保存的标本所提的DNA质量均较好。用抽提的DNA为模板优化RAPD条件,得到适合于合浦珠母贝的RAPD-PCR反应条件为:20 μL反应体系中包括20 ng DNA模板,1×PCR Buffer,0.1 mmol · L-1 dNTPs,2.5 mmol · L-1 MgCl2,0.2 μmol · L-1引物,1 U Taq DNA聚合酶。最佳退火温度40℃。PCR产物用非变性PAGE-银染和琼脂糖-EB染色检测所得到的主要带型相同,但PAGE能检测到更多的多态带。
Abstract:Total DNA were extracted from the pearl oyster Pinctada fucata tissues preserved at -70℃ and fixed in 95% alcohol, respectively. The results showed that the quality of DNA extracted from alcohol preserved tissue through washing with distilled water was as good as that from frozen tissue. The condition for RAPD analysis was optimized and the appropriate reaction was as follows: a 20 μL reaction includes 20 ng template DNA, 1×PCR buffer, 0.1 mmol · L-1 dNTPs, 2.5 mmol · L-1 MgCl2, 0.2 μmol · L-1 each primer, and 1 U Taq DNA polymerase. The optimal annealing temperature is 40℃. The PCR products were separated using non-denatured polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) with silver staining and agarose electrophoresis with ethidium bromide staining, respectively. Both PAGE and agarose separation presented consistent common bands but PAGE can reveal more polymorphic bands.
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Keywords:
- Pinctada fucata /
- pearl oyster /
- DNA extraction /
- optimization of RAPD condition /
- PAGE
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大亚湾是广东沿海最大的海湾之一,平均水深11 m,最深处21 m,1983年被广东省人民政府列为水产资源保护区[1]。浮游桡足类是浮游动物中数量最多、分布最广、最为重要的一类,也是水域食物链的一个重要环节,在海洋生态学和海洋生物资源调查中都具有重要的意义[2]。同时,浮游桡足类是河口港湾浮游动物中最主要的组成部分[3],在港湾的浮游生物调查中占据重要的地位。
关于我国海洋浮游桡足类的生态研究,许多学者曾作过报道[2-14],涉及种类组成、优势种、数量变动、群落特征及地理分布等方面。而关于大亚湾浮游桡足类的生态研究,以往未见报道。本文对大亚湾(纬度22.617°以北约500 km2的海域)一年四季浮游桡足类的种类、数量及群落特征方面进行研究,根据对大亚湾4季调查所获得的资料,对大亚湾浮游桡足类的数量、群落特征、种类组成和优势种等,从平面分布、季节变化等方面进行了探讨,拟为大亚湾生态系统动力学研究和生物资源利用提供重要的基础资料。
1. 材料与方法
材料来源于2003年12月~2004年9月在纬度22.617°以北的大亚湾海域进行的海域生态环境监测共监测4个航次,分别为春(2004年3月)、夏(2004年5月)、秋(2004年9月)、冬(2003年12月),设10个站位(图 1),共采获并分析浮游动物样品40号。浮游动物用浅水Ⅰ型浮游生物网采集,每个调查站垂直拖曳1网,现场用5%甲醛溶液固定,带回实验室浓缩并全部进行显微计数。优势度计算公式参见文献[15]。
2. 结果
大亚湾是半封闭性海湾,盐度及温度随季节不同产生一定的变化,这些因素亦反映到浮游生物种类组成和数量的变动上,浮游桡足类的数量变动和种类的季节更替都较显著。
2.1 种类组成的生态类群
陈柏云[5]把南海的浮游桡足类分为4个类群:热带大洋类群、大洋深水类群、近岸低盐类群和广布类群。本次调查,大亚湾没有出现深水类群,这是由大亚湾的水文地理条件决定的,大亚湾是浅水港湾,调查区域内水深不超过30 m,而该类群匿居于高盐偏低温的南海中部深海盆,因此在大亚湾没有出现。
2.1.1 热带大洋类群
高温高盐种类,主要分布于南海暖流海域,能渗入沿岸水与外海水的交汇水域[5]。本次调查大亚湾亦有出现,但种类不多,代表性种有亚强真哲水蚤(Eucalanus subcrassus)和精致真刺水蚤(Euchaeta concinna),说明外海水在一定程度上入侵大亚湾。
2.1.2 近岸低盐类群
这一类群主要分布于河口及沿岸低盐水域[4],本次在大亚湾出现的种类,按其适温范围,又可分为:(1)广温低盐种,代表性种有椭形长足水蚤(Calanopia elliptica)、真刺唇角水蚤(Labidocera euchaeta)、太平洋纺锤水蚤(Acartia pacifica)、钳形歪水蚤(Tortanus forcipatus)和强额拟哲水蚤(Paracalanus crassirostris)等。(2)高温低盐种,代表性种有红纺锤水蚤(Acartia erythraea)、异尾宽水蚤(Temora discaudata)、锥形宽水蚤(T.turbinata)、柱形宽水蚤(T.stylifera)、叉胸刺水蚤(Centropages furcatus)、小唇角水蚤(Labidocera minuta)和尖额唇角水蚤(L.acuta)等。
2.1.3 广布类群
广温广盐种类,能忍受较大幅度的温、盐变化,从河口近岸直至大陆斜坡和大洋区都有分布,该类群广泛分布于南海及我国各海区[5]。大亚湾的代表性种有小拟哲水蚤(Paracalanus parvus)、微刺哲水蚤(Canthocalanus pauper)、针刺拟哲水蚤(P.aculeatus)、微驼隆哲水蚤(Acrocalanus gracilis)和短角长腹剑水蚤(Oithona brevicornis)等。
2.2 种类季节变化及平面分布
4个航次共出现浮游桡足类54种。在4个季度的调查中,就种类数而言,桡足类均为浮游动物的第一大类群。夏季种类最多,达38种,占浮游动物种类数的45.24%,秋季和冬季次之,分别为24(30.38%)和16种(28.07%),春季最少,仅出现13种,占浮游动物种类数的25.49%(图 2)。
春季,各站种数都<10种,平面分布趋势为从湾西南部向东北方向递减(图 2-a);
夏季,湾的北部偏东和南部分别出现>15种的区域,总体呈现由湾中部向东西两侧递减的趋势(图 2-b);
秋季,湾的中间出现一块>15种的区域,种类由两侧向湾中部递增(图 2-c);
冬季,平面分布由湾东南部向西北部递减(图 2-d)。
2.3 丰度季节变化及平面分布
大亚湾浮游桡足类4季平均丰度为52.45 ind · m-3。丰度高峰出现在夏季,达105.00 ind · m-3,次高峰出现在秋季,达86.00 ind · m-3,夏秋2季均以红纺锤水蚤占绝对优势。春季为桡足类数量低谷,丰度仅3.58 ind · m-3,各桡足类的丰度都<1 ind · m-3。冬季桡足类数量也不高,丰度15.22 ind · m-3,除亚强真哲水蚤、微刺哲水蚤和锥形宽水蚤个体数量稍丰外,其他种类的个体数都很少。4季桡足类丰度的变化趋势为夏(105.00 ind · m-3)>秋(86.00 ind · m-3)>冬(15.22 ind · m-3)>春(3.58 ind · m-3),桡足类丰度具明显的季节差异,体现了近岸港湾浮游动物变化幅度大的特征(图 3)。
春季,桡足类数量很低,仅湾西部出现一小块>8 ind · m-3的区域(图 3-a);
夏季,各站桡足类丰度普遍偏高,全海域丰度均>20 ind · m-3,湾的东北部还出现>200 ind · m-3的密集区,平面分布呈现由湾东北部向西南部递减的趋势(图 3-b);
秋季,桡足类丰度仍然较高,湾西部出现>100 ind · m-3的密集区,平面分布趋势由湾西部向东部递减(图 3-c);
冬季,桡足类丰度比夏、秋2季明显下降,但相比春季还是有一定程度的升高,平面分布从湾东北部向西南部递减(图 3-d)。
2.4 优势种及季节更替
关于达到优势种的标准,有学者以黄、东海为例,认为Y>0.02时即可认定为优势种,但陈清潮等[15]通过对南沙群岛浮游动物多样性的分析研究,认为热带地区浮游动物优势度以Y>0.015定为优势种较适宜。大亚湾是热带海区,本文采用陈清潮的标准,取优势度Y>0.015的种为优势种。在本次调查中,大亚湾桡足类共出现4种优势种,分别为红纺锤水蚤、微刺哲水蚤、亚强真哲水蚤和锥形宽水蚤。其中红纺锤水蚤(Y=0.056)和微刺哲水蚤(Y=0.017)为夏季的优势种,红纺锤水蚤(Y=0.052)为秋季的唯一优势种,微刺哲水蚤(Y=0.035)、亚强真哲水蚤(Y=0.085)和锥形宽水蚤(0.016)为冬季的优势种,春季桡足类无优势种。4季均出现的桡足类有3种,分别为亚强真哲水蚤、异尾宽水蚤和红纺锤水蚤。现将以上几种桡足类的平面分布和季节变化概述如下。
2.4.1 红纺锤水蚤
高温低盐种,属近岸低盐类群[5],主要分布于长江口以南的各河口、近岸水域,夏秋季数量较多,冬春季很少[16]。该种为调查期间数量最多、分布最广的桡足类,4季均有出现,占桡足类总量的1.68%(春)~58.62%(秋)。该水蚤在夏、秋2季都是优势种,栖息密度分别为57.03(夏)和50.41 ind · m-3(秋), 在冬、春2季亦有出现,但数量很少。该水蚤的平面分布,夏季从湾东北部向西南部递减(图 4-a), 与该季桡足类的分布趋势一致(图 3-b);秋季从湾西部向东部递减(图 4-b),亦与桡足类的分布趋势相同(图 3-c)。这表明红纺锤水蚤的丰度在一定程度上影响夏、秋2季桡足类总丰度,是该2季的主要优势桡足类。
2.4.2 亚强真哲水蚤
高温高盐种,属热带大洋类群[5],广泛分布于我国东海、台湾海峡及南海北部海域,夏秋季数量较多,黑潮区,太平洋、印度洋和大西洋热带区均有分布[16]。在4个季度的调查中,亚强真哲水蚤均有出现,其出现频率从春到冬逐渐升高,但数量都不多。该种是冬季的第一优势桡足类,栖息密度为6.39 ind · m-3,在其他3个季度的栖息密度分别为0.05(春)、0.26(夏)和4.91 ind · m-3(秋)。
2.4.3 微刺哲水蚤
广温广盐种,属广布类群[5],在我国东海、台湾海峡和南海很常见,有显著的昼夜垂直移动现象,黑潮区,太平洋、印度洋和大西洋热带区及地中海均有分布[16]。在4个季度的调查中,微刺哲水蚤在夏、秋、冬3季均有出现,并且是夏季(22.29 ind · m-3)和冬季(3.29 ind · m-3)的优势种。该种的平面分布,夏季从湾东北部向西南部递减(图 5-a),与红纺锤水蚤(图 4-a)及桡足类(图 3-b)的分布趋势一致;冬季从湾东部向西部递减(图 5-b),与桡足类(图 3-d)的分布基本一致。
2.4.4 锥形宽水蚤
高温低盐种,属近岸低盐类群[4],在我国东海、台湾海峡和南海很常见[16]。该水蚤是大亚湾冬季的优势种之一,除春季外,该水蚤在其它季节均有出现,但栖息密度很低。
2.4.5 异尾宽水蚤
近岸低盐类群,为暖水沿岸种,一般受控于沿岸水的影响,密集区大多出现于沿岸水和混合水锋面内侧[17],主要分布在盐度较低的沿岸水域和内湾海域,生活水深在60 m以内。该水蚤在大亚湾4个季度的调查均有出现,但数量很少,栖息密度分别为0.17(春)、1.23(夏)、2.26(秋)和0.18 ind · m-3(冬)。
3. 讨论
3.1 大亚湾桡足类群落与其他海湾的比较
桡足类是海洋浮游动物的主要类群,通常从种数和数量上都占优势,在近岸水域尤其如此[16]。本调查大亚湾共鉴定桡足类54种,与柘林湾及三亚湾相比,出现种类数差异不大,但比国外的3个海湾出现种类数要多(表 1)。由表 1可以看出,大亚湾浮游桡足类种类比较丰富,但丰度不高,尤其是在浮游动物丰度中所占比例明显低于国内另外2个海湾。到底是什么原因导致大亚湾的桡足类丰度在浮游动物中的比重偏低,还需进一步的研究。
表 1 大亚湾桡足类群落结构与其他海湾的比较Table 1. Comparison of community structure of Copepods between Daya Bay and other bays海域sea area 桡足类种数Copepods species 桡足类丰度/ind·m-3(占浮游动物总丰度/%)Copepods abundance 优势种dominant species 大亚湾(2003.12~2004.9)Daya Bay 54 52.45(10.38) 红纺锤水蚤、微刺哲水蚤、亚强真哲水蚤、锥形宽水蚤 柘林湾[21] (2000.7~2001.7)Tuolin Bay 57 4 501(66.25) 强额拟哲水蚤、短角长腹剑水蚤 柘林湾[22] (2001.4~2002.4)Tuolin Bay 60 10 558(66.67) 强额拟哲水蚤、短角长腹剑水蚤 三亚湾[23] (1998.10~1999.8)Sanya Bay 55 39.10(32.21) 亚强真哲水蚤、红纺锤水蚤、精致真刺水蚤、微刺哲水蚤、针刺拟哲水蚤 Gulf of Aqaba[24](1994.7~1995.5) 31 - - Bombay Harbor[25](1985.8~1986.10) 46 - - Mediterranean[26](1984.1~1985.12) 30 - - 优势种方面,大亚湾与三亚湾差异不大,但与柘林湾差异明显。柘林湾不仅是一个大规模的增养殖基地,而且是赤潮频发重灾区,这可能是导致出现优势种及丰度差异的主要原因。
3.2 桡足类与浮游动物丰度的关系
本次调查,大亚湾浮游桡足类丰度占浮游动物总丰度的10.38%,次于毛颚类和枝角类。其中冬季所占比例最高,达20.3%,在浮游动物中所占的比例仅次于毛颚类;夏季占浮游动物的10.23%,所占比例次于枝角类和毛颚类;秋季占浮游动物的8.79%,排在第4位,次于被囊类、枝角类和水母类;春季最低,仅占2.19%,比毛颚类、水母类和枝角类所占的比例都低。
3.3 桡足类与饵料浮游动物丰度的关系
本次调查,浮游桡足类数量占饵料浮游动物总量的17.41%,其中,秋季所占比率最高,达30.13%,其次为冬季和夏季,分别为21.75%(冬)和15.31%,,春季最低(2.46%)。在饵料浮游动物中所占的比重次于毛颚类和枝角类。
3.4 区系特征
陈柏云[4]根据我国海域浮游桡足类地理分布特点,认为我国海域浮游桡足类属于印度-西太平洋区系范围[18],并通过与日本及印度尼西亚海区的比较,得出以下结论:渤海浮游桡足类呈现出温带近岸区系特征,东海外海的桡足类属印度-西太平洋热带区系,东海西北部及南黄海是温带区系与热带区系的混合分布区,南海桡足类属于印度-西太平洋热带区系[5],而南海北部海区具有热带边缘区系的特点。另外,BOGOROV[19]和郑执中[20]都认为在浮游动物并没有明显的“亚热带浮游动物区系”存在。根据以上分析,笔者认为,大亚湾属南海北部海区,其浮游桡足类属印度-西太平洋热带边缘区系。
4. 小结
4个航次大亚湾共出现浮游桡足类54种,种类数为浮游动物的第一大类群,季节性更替明显,夏季桡足类种类最多(38种),春季最少(13种)。但丰度却次于毛颚类和枝角类。
桡足类丰度高峰出现在夏季,达105.00 ind ·m-3,春季为桡足类数量低谷,丰度仅3.58 ind ·m-3。夏季与春季的变幅接近30倍,反映了近岸港湾季节因子变化幅度大的特点。其丰度的平面分布,亦随季节不同而异。
本次调查,共出现4种优势桡足类,分别为红纺锤水蚤、微刺哲水蚤、亚强真哲水蚤和锥形宽水蚤。其中红纺锤水蚤为夏(Y=0.056)、秋(Y=0.052)2季的绝对优势种。
大亚湾出现的浮游桡足类可分3大类群:热带大洋类群、近岸低盐类群和广布类群;桡足类种类组成属印度-西太平洋热带边缘区系。
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图 1 不同处理方法对DNA质量的影响
1~4. 酒精保存样品;5~6. 冷冻保存样品
1. 样品加入1.2 mL的双蒸馏水洗涤2次,每次10 min;
2. 样品加入1.2 mL双蒸馏水后放置时间为1 h;
3. 样品用培养皿约100 mL双蒸馏水洗涤2次;
4. 样品未洗涤;5. 剪碎前加蛋白酶K;
6. 剪碎后加蛋白酶K
Figure 1. Influences of different treatments of specimens on DNA quality
1~4. alcohol preserved tissue; 5~6. frozen tissue
1. washing twice with 1.2 mL distilled water, 10 minutes each;
2. washing twice with 1.2 mL distilled water, 1 hour each;
3. washing twice with 100 mL distilled water;
4. non-washing; 5. adding proteinase K before cuting;
6. adding proteinase K after cuting
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