合浦珠母贝(Pinctada fucata)，也称马氏珠母贝(P. martensii)，在我国广泛分布于广东、广西和海南等沿海，是生产海水珍珠的主要种类^[1]。合浦珠母贝的新鲜组织粘液多，提取DNA较困难。酒精固定标本如果处理不好，DNA的得率也很低。因此有必要对酒精固定标本的DNA提取方法进行改进。目前常用的分子标记技术如随机扩增多态DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、扩增片段长度多态(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、微卫星等都是以DNA为基本材料。因此，高质量DNA的提取至关重要^[2]。RAPD技术是由WILLIAMS和WELSH 2个研究小组在不同实验室同时发展起来的一项DNA多态检测技术^[3-4]。由于该技术具有快速、简便、通用性好等优点，一问世就受到广泛关注，并成功地应用于遗传多样性检测、基因定位、品系鉴定、医学鉴定、遗传图谱构建、系统学研究等许多领域^[5-13]。王爱民等^[14]、阎冰等^[15]和苏天凤等^[16]开展了合浦珠母贝的RAPD研究，但所用反应条件各有不同。由于RAPD反应严谨性较低，不同反应条件所得结果可能不一样，从而影响不同实验室结果的比较。因此有必要优化反应条件，使之标准化，以方便实验室之间的交流。本实验对不同方法保存的合浦珠母贝组织的DNA抽提方法进行比较，对RAPD反应体系的模板浓度、dNTPs浓度、镁离子浓度、引物浓度、Taq酶浓度和PCR产物检测方法进行优化，探讨合浦珠母贝DNA提取和RAPD扩增的最适条件及检测方法，以供参考。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

合浦珠母贝样品于2003年采于深圳大亚湾。取闭壳肌分别保存于－70℃冰箱和95%乙醇。

1.2   实验方法

1.2.1   基因组DNA的提取

取6个1.5 mL离心管(分别标为1、2、3、4、5和6)，1~4号管加酒精保存样品，5~6号管为冷冻保存样品，样品量20 mg左右。1号管加入1.2 mL的双蒸馏水洗涤2次，每次10 min。2号管加入双蒸馏水后放置时间为1 h。3号管的样品用培养皿约100 mL双蒸馏水洗涤2次。4~6号管未洗涤。1~5号管加100 μL抽提缓冲液(Tris · Cl 50 mmol · L^-1，pH 8.0；EDTA 100 mmol · L^-1；NaCl 200 mmol · L^-1，2% SDS)和100 μg蛋白酶K，6号管加100 μL抽提缓冲液但不加蛋白酶K。用眼科剪将组织块剪碎，再加抽提缓冲液至600 μL，6号管再加100 μg蛋白酶K。轻轻混匀，56℃消化至澄清。然后分别用等体积的饱和酚(pH 8.0)、酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)和氯仿：异戊醇(24：1)抽提，直至无蛋白质中间相，取上清液，加入2倍体积无水乙醇和1/10体积NaAc(3 mol · L^-1，pH 5.2)，于－20℃沉淀2 h以上，离心，75%乙醇洗涤2次，干燥后加入200 μL去离子超纯水溶解，4℃存放。提取的基因组DNA样品用1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色检测。用Biometra紫外分光光度计测定OD₂₆₀和OD₂₈₀，检测抽提DNA的质量和计算DNA浓度，然后配成浓度为20 ng · μL^-1的DNA备用。

1.2.2   RAPD-PCR反应条件优化及产物检测比较

PCR buffer、dNTPs、Taq DNA聚合酶均购自上海申能博彩公司。引物由QIAGEN公司合成。PCR反应在eppendorf marstercycle gradient扩增仪上进行。RAPD扩增的基本条件为：反应总体积20 μL，包括：20 ng DNA模板，1×PCR Buffer，0.1 mmol · L^-1 dNTPs，2.5 mmol · L^-1 MgCl₂，0.2 μmol · L^-1引物，1 U Taq DNA聚合酶。PCR循环程序为：94℃变性5 min，然后45个循环，每个循环包括：94℃变性1 min，40℃退火1 min，72℃延伸2 min。最后72℃延伸10 min。在此基础上对DNA模板浓度、dNTP浓度、MgCl₂浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度和退火温度进行优化。参数变化梯度为：DNA模板：10、20、50、100、200 ng，dNTPs：10、20、50、100、200、300、400 μM，MgCl₂：1、1.5、2、2.5、3 mM，引物：0.1、0.2、0.4、1 μM，Taq DNA聚合酶：0.25、0.5、1、2 U。退火温度：34，36，38，40，42℃。每次仅改变1个PCR参数，并保持其它条件不变，逐个研究每个参数对RAPD扩增的影响。

扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，用SYNGENE凝胶成像系统进行观察和拍照。另用4%变性聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳。电泳结束后，取出胶板，小心剥离并置于固定液(10%冰乙酸)固定30 min, 双蒸馏水洗涤2次，用1.5 g · L^-1硝酸银银染30 min，双蒸馏水洗涤1次，时间不超过1 min, 放入显影液(22.5 g · L^-1碳酸钠，1.5‰甲醛，2×10^-4硫代硫酸钠)显影直到出现清晰条带，放入固定液(10%冰乙酸)停止显影10 min，用蒸馏水冲洗干净，晾干。

2.   结果

2.1   样品处理对DNA质量的影响

用6种方法对样品进行处理，所提DNA的电泳结果见图 1。其中3和5号管所抽提到的DNA质量最好，消化时间短，DNA带很亮且无降解，OD₂₆₀与OD₂₈₀比值为1.80左右，数量约为100 μg。1和2号管所抽提的DNA效果较差，3、5和6号管消化时间在2 h以内，而1、2号管均要消化5 h以上，且抽提到的DNA有部分断裂，抽提到的DNA量较3和5号管少很多。OD₂₆₀和OD₂₈₀比值为1.5~1.6之间。而4号管的组织块完全消化需要过夜，有时消化过夜还不能消化完全。抽到的DNA量不稳定且都较少，OD₂₆₀与OD₂₈₀比值均低于1.6。6号管从所抽提DNA中降解十分厉害。另外，通过比较从不同组织提取的DNA的质量和浓度，发现从闭壳肌中较易提取DNA。

图  1  不同处理方法对DNA质量的影响

1~4. 酒精保存样品；5~6. 冷冻保存样品
1. 样品加入1.2 mL的双蒸馏水洗涤2次，每次10 min；
2. 样品加入1.2 mL双蒸馏水后放置时间为1 h；
3. 样品用培养皿约100 mL双蒸馏水洗涤2次；
4. 样品未洗涤；5. 剪碎前加蛋白酶K；
6. 剪碎后加蛋白酶K

Figure  1.  Influences of different treatments of specimens on DNA quality

1~4. alcohol preserved tissue; 5~6. frozen tissue
1. washing twice with 1.2 mL distilled water, 10 minutes each;
2. washing twice with 1.2 mL distilled water, 1 hour each;
3. washing twice with 100 mL distilled water;
4. non-washing; 5. adding proteinase K before cuting;
6. adding proteinase K after cuting

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2.2   RAPD反应条件的优化

2.2.1   dNTPs浓度对RAPD的影响

当dNTPs的量为10和20 μM时，扩增的条带少并且部分条带不清晰，50 μM dNTPs虽然与10和20 μM dNTPs比较扩增出的条带有所增加，但是还是有较强的弥散条带，当dNTPs为100 μM时，扩增出的条带清晰，有较强的多态，而且在实验过程中发现该浓度下的扩增结果稳定(图 2)。

图  2  不同浓度dNTPs对RAPD反应的影响

1. DNA分子量；2. 10 μM；3. 20 μM；4. 50 μM；5. 100 μM

Figure  2.  Effects of dNTPs concentration on RAPD amplification

1. DNA ladder; 2. 10 μM; 3. 20 μM; 4. 50 μM; 5. 100 μM

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2.2.2   Mg²⁺浓度对RAPD的影响

Mg²⁺浓度为1、1.5和2 mM时500 bp以下的片段扩增较弱，而且在约650 bp扩增得到的条带较弥散，2.5与3 mM的扩增片段较清晰和稳定(图 3)，其中2.5 mM的扩增较理想。

图  3  Mg²⁺浓度对RAPD的影响

1. 空白对照；2. 1 mM；3. 1.5 mM；4. 2 mM；5. 2.5 mM；6. 3 mM；7. DNA分子量

Figure  3.  Effects of Mg²⁺ concentration on RAPD amplification

1. control (no template DNA); 2. 1 mM; 3. 1.5 mM; 4. 2 mM; 5. 2.5 mM; 6. 3 mM; 7. DNA ladder

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2.2.3   引物浓度对RAPD的影响

引物浓度为1 μM时，扩增出的片段多态性较之其他浓度的低。而0.1 μM比0.2和0.4 μM扩增产物的条带弱，而且多态性较差，小片段有丢失，0.2和0.4 μM的扩增结果较一致，条带强，多态性较丰富。从节约成本的角度出发，可以选用浓度为0.2 μM的引物进行合浦珠母贝RAPD扩增实验。

2.2.4   Taq DNA聚合酶对RAPD的影响

当Taq酶的量低于0.5 U时，扩增的产物较少，而当Taq酶的量在1~2 U扩增出的条带强而且清晰，带型稳定(图 4)。

图  4  Taq酶浓度对RAPD的影响

1. 空白对照；2. 0.25 U；3. 0.5 U；4. 1 U；5. 2 U；6. DNA分子量

Figure  4.  Effects of Taq enzyme concentration on RAPD

1. control (no template DNA); 2. 0.25 U; 3. 0.5 U; 4. 1 U; 5. 2 U; 6. DNA ladder

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2.2.5   不同退火温度对RAPD的影响

退火温度为36~40℃均可扩出RAPD条带，但是40℃扩增出的RAPD条带稳定清晰(图 5)。

图  5  优化条件扩增的珍珠贝RAPD琼脂糖电泳图

Figure  5.  Agarose electrophoresis of RAPD products amplified in optimal condition

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2.2.6   不同方法检测PCR产物结果的差异

琼脂糖电泳和非变性PAGE能检测到一致的条带(图 6)，包括L300、L870和L1350带，尤其是300 bp左右的共同条带在2种电泳检测中都很清晰一致。但非变性PAGE能检测到更多的带，尤其是500~750 bp之间和2 000~2 500 bp之间出现较多清晰的带(图 6-a)。但琼脂糖电泳的L900带(图 6-b)在PAGE中未发现。

图  6  合浦珠母贝RAPD电泳图(引物S10)

a. 1.5%琼脂糖-EB染色；b. 4%非变性PAGE-银染1~12. 样品个体编号；M. DNA ladder

Figure  6.  Electrophoretic photo of the RAPD products amplified by primer S10

a. 1.5% Agarose electrophoresis with EB staining; b. 4% non-denatured PAGE with silver staining 1~12. individuals numbering; M. DNA ladder

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3.   讨论

3.1   基因组DNA的提取

对标本的保存，酒精固定是一种简单、安全、快速的方法。乙醇能迅速渗入组织细胞，凝固蛋白质，使多种水解酶失活，从而不损伤DNA，对DNA起固定保存作用。但如何从乙醇固定的标本中抽提到质量较好，符合各实验目的需要的DNA模板，又是科研工作者正在探讨的问题。胡虹和许雅娟^[17]用无水乙醇固定贝类组织，提取贝类DNA，提取出的基因组DNA较完整，质量较好，但其产率较鲜活的样品低。在抽取酒精固定样品DNA的实验过程中发现，若对酒精固定样品中的酒精去除不彻底，会影响DNA的产率及纯度，因为样品中残余的酒精会影响蛋白酶K的活性，使蛋白酶K不能够完全消化组织。因此，需要用足够的蒸馏水充分置换出组织细胞中的酒精。此类预处理方法简单方便，实用效果好。另外，一般在抽提新鲜组织DNA样品时，如果样品数较多，在剪碎组织前，应在抽提缓冲液中先加入蛋白酶K，有利于保护DNA不被DNA酶降解，也省去单独每剪碎一管组织加一次蛋白酶K的麻烦。此外，还可用液氮研磨组织块。但是，用液氮研磨比直接剪碎的成本高，并且液氮为超低温液体，操作时容易溅到身上冻伤皮肤。

RAPD依靠单一引物在基因组中某些特定的位点退火扩增。这些能扩增的特定序列要求在0.1~3 kb范围内有与引物匹配的方向互补的序列存在，这类区域随机分布于整个染色体基因组中。RAPD的基本假设是用同一引物扩增的片断如果长度相等，则被视为同源。随机引物扩增与所获得的DNA模板的分子量大小有关。如果DNA降解，必然影响随机扩增中条带的多少及有无。因此，RAPD对模板DNA的质量要求较高。因此，提取高质量的DNA对RAPD扩增结果的可靠性和重复性具有重要意义。

3.2   RAPD扩增条件的优化

Mg²⁺是Taq聚合酶实现聚合反应中所必须的。Mg²⁺浓度是个限制因子，浓度太高或太低都不能得到好的RAPD结果。张恒庆等^[18]认为Mg²⁺浓度可能影响到引物的退火温度、扩增产物的特异性、引物二聚体的形成以及DNA聚合酶的活性和准确性。Mg²⁺浓度过低会降低Taq酶活性，过多则容易产生非特异性带。在本实验中，Mg²⁺浓度低于2.5 mM时扩增出的条带较弱，不够稳定。2.5 mM的Mg²⁺浓度扩增比较理想。

和其它PCR反应一样，引物在RAPD反应中是一关键的因素。实验中发现引物浓度最高时反而出现片段缺失的情况。可能是当引物过量时出现随机引物争夺模板DNA的情况，这时只有部分位点可以和随机引物结合，优先结合的那些产生强带，而弱带消失。孙敏等^[19]认为随机引物的量与DNA模板的量之间存在协同作用。可见在RAPD反应中，引物浓度的摸索也是一个关键步骤。

退火温度对PCR的特异性十分关键，迪芬巴赫等^[20]提出退火温度太高，10 bp的随机引物就完全发挥不了它的作用。而退火温度降低，会增加非特异性扩增的机会。实验所摸索出的40℃可以扩增出条带，且条带清晰稳定，多态性也并没有降低，并减少了一些不够清晰的条带。这样，相对于较低的退火温度，减少了非特异性扩增的几率。

3.3   RAPD产物的检测

目前，在国内外报道的RAPD实验中，大多都用琼脂糖-EB染色来检测RAPD产物^[5-16]，很少有用PAGE-银染来检测。本实验结果表明，用非变性PAGE-银染检测比琼脂糖凝胶能获得更多且清晰的条带，条带之间分得很清楚。可能是因为这些带扩增较弱，EB染色不够灵敏而检测不到，而银染要灵敏得多，能检测到极微量的DNA。孟宪红等^[21]对RAPD扩增产物进行了琼脂糖和非变性PAGE-银染比较分析，琼脂糖电泳检测到的谱带不足10条，而PAGE可分辨出15~30条清晰条带。实验在琼脂糖电泳中只能检测到4条带，而在非变性PAGE中可检测到13条带，与孟宪红等^[21]的结果相似。但孟宪红等没有直接对同一产物进行2种电泳分析。本实验结果表明，非变性PAGE-银染可提高RAPD PCR产物的检测效率，对揭示物种真实的遗传多样性是有价值的。

另外，实验也用变性PAGE检测RAPD产物，在同样的电泳条件下，变性PAGE的迁移率比非变性PAGE慢，产物分不开，特别是500 bp以上的条带，在变性胶中迁移非常缓慢，堆积成一片，不清晰。而非变性PAGE可清晰地分辨出约3 000 bp以下条带。RAPD扩增的产物大小一般在0.1~3 kb之间，所以非变性PAGE适合检测RAPD产物。

综合本实验结果，适宜于合浦珠母贝的RAPD最佳反应体系为：20 μL反应体系中包含20 ng DNA模板，1×PCR Buffer，0.1 mmol · L^-1 dNTPs，2.5 mmol · L^-1 MgCl₂，0.2 μmol · L^-1引物，和1 U Taq DNA聚合酶。PCR循环程序为：94℃变性5 min，然后45个循环，每个循环包括：94℃变性1 min，40℃退火1 min，72℃延伸2 min。最后72℃延伸10 min。PAGE-银染检测RAPD产物能更真实地反映物种的遗传多样性。