DNA extraction of the pearl oyster Pinctada fucata and optimization of RAPD conditions
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摘要:
分别从保存于－70℃和95%乙醇的合浦珠母贝组织提取总DNA。结果表明，乙醇保存标本用双蒸馏水预处理后所提的DNA与－70℃保存的标本所提的DNA质量均较好。用抽提的DNA为模板优化RAPD条件，得到适合于合浦珠母贝的RAPD-PCR反应条件为：20 μL反应体系中包括20 ng DNA模板，1×PCR Buffer，0.1 mmol · L-1 dNTPs，2.5 mmol · L-1 MgCl2，0.2 μmol · L-1引物，1 U Taq DNA聚合酶。最佳退火温度40℃。PCR产物用非变性PAGE-银染和琼脂糖-EB染色检测所得到的主要带型相同，但PAGE能检测到更多的多态带。
Abstract:Total DNA were extracted from the pearl oyster Pinctada fucata tissues preserved at －70℃ and fixed in 95% alcohol, respectively. The results showed that the quality of DNA extracted from alcohol preserved tissue through washing with distilled water was as good as that from frozen tissue. The condition for RAPD analysis was optimized and the appropriate reaction was as follows: a 20 μL reaction includes 20 ng template DNA, 1×PCR buffer, 0.1 mmol · L-1 dNTPs, 2.5 mmol · L-1 MgCl2, 0.2 μmol · L-1 each primer, and 1 U Taq DNA polymerase. The optimal annealing temperature is 40℃. The PCR products were separated using non-denatured polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) with silver staining and agarose electrophoresis with ethidium bromide staining, respectively. Both PAGE and agarose separation presented consistent common bands but PAGE can reveal more polymorphic bands.
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Keywords:
- Pinctada fucata /
- pearl oyster /
- DNA extraction /
- optimization of RAPD condition /
- PAGE
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1. 前言
1990年，FAO/IAEA/WHO 3个国际组织的专家委员会把铬(Cr)重新界定为一种人体必需的微量元素。大量的研究表明，铬是人和动物的必需营养物质[1-2]，在糖代谢中发挥重要的作用。许多与糖代谢有关的疾病都需要补充铬[3-5]。因此，铬作为微量元素和生长促进剂的应用，具有很好的市场开发前景。
环境中常见的铬主要是三价铬(Cr Ⅲ)和六价铬(Cr Ⅵ)，它们在水体中的迁移转化有一定的规律性。铬(Ⅲ)因其具有促进糖代谢、提高免疫力等作用而在动物饲料中应用。铬(Ⅵ)因具潜在的致癌性、机能与基因的诱变性而变得倍受关注。目前我国对铬在渔业生产中应用的研究不多，但也取得了一些研究成果。综合目前的研究结果，铬应用在渔业生产中具有双向效应：一方面可作为生长素，如用作饲料添加剂，具有较好的促生长效果，并能提高生物的免疫功能和抗应激能力。另一方面，对养殖生物有一定的毒性，可能会导致发育畸变，对其质量安全有一定的影响；同时，铬也是造成环境污染的重金属之一。本文就铬在渔业生产中的应用研究进展作一综述，并提出今后的研究重点，以期为相关的研究、部门决策提供参考。
2. 铬在水产养殖中的应用
2.1 铬添加剂对渔业生物的促生长作用
业已发现，在动物饲料中添加铬(Ⅲ)，能加强糖原代谢，提高胰岛素活力、促进动物生长，加快增重，提高存活率[5-14]。使用铬化合物用做鱼类饲料添加剂已有不少报道，多数报道指出，在一定剂量范围内，铬对渔业生物的生长具有促进作用。
在1冬龄(22 g左右)奥尼罗非鱼(Tilapia nilotica×T.aurea)饲料中添加1.7 mg · kg-1的不同铬化合物(三氯化铬、有机酸铬、蛋氨酸铬、甘氨酸铬和烟酸铬)，结果各组间相对增重率大小顺序为：甘氨酸铬、烟酸铬、蛋氨酸铬、三氯化铬、有机酸铬、对照组，试验组比对照组提高了7.3%~37.8%，试验组的饲料消化率比对照组提高了2.8%~18.5%[15]。
给平均体重2.6 g的奥尼罗非鱼投喂添加不同水平(0.2、0.5、1、10.0 mg · kg-1)烟酸铬的饲料，发现添加10.0 mg · kg-1烟酸铬的实验组生长速度最快[16]。而在葡萄糖饲料和淀粉饲料中添加2 mg · kg-1有机铬投喂初始体重约114 g的奥尼罗非鱼鱼种，8周后饲料中添加烟酸铬和吡啶羧酸铬的罗非鱼，葡萄糖组的特定生长率、葡萄糖组和淀粉组的饲料效率均显著高于对照组，表明有机铬能显著促进罗非鱼对葡萄糖的利用[17]。给奥尼罗非鱼幼鱼投喂添加不同水平Cr2O3葡萄糖为糖原的饲料3周，观察到Cr2O3有明显的促生长作用，并能提高饲料利用率和蛋白质效率[18]。
在5 g左右团头鲂(Megalobrama amblycephala)日粮中添加不同水平的吡啶甲酸铬，经过60 d饲喂，发现当基础日粮中添加含铬(Ⅲ)600 μg · kg-1的吡啶甲酸铬时生产性能最好，显著高于对照组[19]。
以0.5 mg · kg-1铬盐(CrCl3 · 6H2O)饲料饲喂1龄鲤(Cyprinus carpio)65 d和3月龄鲤30 d, 相对生长率分别提高13.79%和20.69%, 饲料转化率提高21.83%和26.0%。表明铬盐有促进鱼类生长和提高饲料转化率的效应，但铬盐对鱼体营养成分的作用不明显[20]。
除了铬可用于促生长外，饲料中添加不同水平的铬还能影响鱼类的免疫功能，提高血清中的溶菌酶活力，提高巨噬细胞的吞噬能力。此外，铬也可提高水产动物的抗应激能力[20-21]。
2.2 铬对渔业生物的负作用
铬是鱼类等生物的必需微量元素，但关于各种养殖生物对铬的需求量, 至今尚无准确的科学依据。尽管已证明铬作为饲料添加剂能促进生长、提高产量及改善免疫能力，但也有研究表明，铬添加剂的剂量过大对水产动物的生长具有负作用。
研究发现若对鲤鱼添加过大剂量的铬盐，促生长的效果反而会降低，甚至会出现负作用。用添加铬1 mg · kg-1的饲料饲养3月龄鲤40 d，鱼的体重明显增加。但当添加量增加至2和5 mg · kg-1时，鲤鱼分别在30、20 d内表现出生长缓慢，40、30 d出现负生长的现象；用含铬10 mg · kg-1饲料饲养的鲤会造成生长停止。表明饲料中添加铬饲养鲤的安全浓度应低于2 mg · kg-1[22]。
FARAG等[23]报道了铬暴露对大鳞大麻哈鱼(Oncorhychus tshawytscha)生长和成活率的影响。发现幼鲑暴露于铬浓度24和54 μg · L-1下105 d，生长率和成活率未受影响，但当铬浓度增加至120 μg · L-1以上时生长率和成活率明显降低。
3. 铬对渔业的危害
3.1 铬对渔业生物的毒性研究
高晓莉等[24]研究了铬(Ⅵ)对泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)的急性毒性，表明铬(Ⅵ)对泥鳅24 h LC50为366.6095 mg · L-1、48 h LC50为267.1696 mg · L-1、96 h LC50为209.7854 mg · L-1。胡家会等[25]报道了铬(Ⅵ)对玫瑰无须鲃(Puntius conchonius)的生物毒性，最高存活质量浓度为20 mg · L-1，最低全部死亡质量浓度为200 mg · L-1。ROBERTS等[26]研究了铬(Ⅵ)对虹鳟(O.mykiss)的毒性，通过对金属硫蛋白水平、超氧化歧化酶SOD活性、油脂过氧化反应、细胞形态和鱼的生长等观测，表明鳃组织对铬(Ⅵ)的毒性比较敏感，肝在鱼机体对铬(Ⅵ)毒性的适应有重要的作用。蔺玉华等[27]采用Horm氏水体染毒法，以铬(Ⅵ)浓度0、21.5、46.4、100 mg ·L-1染毒6月龄鲤2周，结果表明铬(Ⅵ)引起染毒鲤的血清渗透压下降，血清Na+、K+、Ca2+浓度升高和Cl-浓度降低，血糖浓度有升高趋势，鲤鱼对铬蓄积量大小依次为肠>鳃>肝>肌肉。而幼鲑暴露于铬(Ⅵ)浓度120 μg · L-1以上时，随着铬浓度的增加，其肾脏中出现DNA损害、脂质过氧化物增加等，从而引起生长和成活率的下降[23]。
KRUMSCHNABEL等[28]研究了铬(Ⅵ)对金鱼(Carassius auratus)的急性中毒，发现铬(Ⅵ)的毒性是与依赖铬浓度刺激产生活性氧(ROS)有关的，通过氰化物抑制线粒体的呼吸作用能降低40%铬诱导的活性氧形成，而细胞的Ca2+对铬的这一毒性不起调节作用。TRAVACIO等[29]研究表明在动物体内，铬(Ⅵ)还原为铬(Ⅲ)，会引起活性氧的形成和油脂的过氧化反应，导致抗氧化物酶活性的增加，激发氧化胁迫应答的适应性反应。廖国建等[30]应用蛋白质组学技术研究了铬(Ⅵ)的分子毒性，认为铬可能通过氧化胁迫应答、离子通道、氨基酸生物合成等发挥生物毒理作用。
3.2 铬对渔业生物生理活性的影响
陈家长等[20]用5种不同浓度的铬(Ⅵ)分别刺激鲤鱼21和44 d后，测定鲤鱼非特异性免疫指标，发现浓度为1.0和2.0 mg · L-1的铬明显降低鲤鱼的非特异性免疫功能，鲤的溶菌酶活力显著降低，表明一定浓度的铬(Ⅵ)会抑制或降低锂鱼的非特异性免疫的主要指标即吞噬细胞、中性粒细胞、巨噬细胞的数量和吞噬功能及溶菌酶的活力。
蔺玉华等[22]进行了不同铬剂量注射和饲喂高血糖鲤的实验, 结果表明，低剂量铬(2.5 μg · kg-1体重)对高血糖鱼有明显降血糖作用, 说明铬是鱼类胰岛素的协助剂。但高剂量(60 μg · kg-1体重)铬盐无论对高血糖鱼还是正常鱼均会引起血糖值增高。
南旭阳[31]研究了铬离子对鲫鱼(Carassius auratus)的毒性, 结果显示铬离子对鲫鱼外周血红细胞的微核率、核异常率、总核异常率及血红蛋白量、红细胞数和白细胞数均具有一定的影响, 大多数指标都比对照组高, 而且在较高浓度时影响更大; 并发现铬对鲫鱼血红蛋白和血细胞数的影响比对微核率的影响大。
3.3 铬对养殖水体的污染
铬是我国水体中一种普遍存在的污染物。据报道，在全国范围内有20 %以上的受污染土壤、地下水是由含铬(Ⅵ) 废物造成的。我国排放含铬(Ⅵ)废物的企业众多，这些含铬废水排放后，造成了湖泊、江河、河口及海洋的铬残留，进而导致水生生物中有不同程度的铬残留。
倪倩等[32]选择武汉墨水湖为研究对象，通过研究其湖水、底质沉积物以及鱼样中包括铬在内的8种重金属元素的含量特征，发现铬在湖水中的含量为1.71 μg · L-1，鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)中的含量为0.353 μg · g-1，墨水湖沉积物污染严重，铬含量为213 mg · kg-1，高出环境背景值和生态效应临界值(TEL，42 mg · kg-1)，并已超过生态效应必然浓度值(PEL，160 mg · kg-1)。
王金辉等[33]对象山港重点养殖区中重金属含量的调查结果表明，象山港水体中总铬的含量很低，符合一类海水水质标准。但在主港区及其邻近分区含量相对较高，象山港水体中的重金属含量在东海10个重点河口港湾中属于偏高，近5年来含量稳中有升。
江锦花和柯世省[34]对东海隘顽湾海域的4个养殖区水体表层沉积物中重金属含量进行分析，结果表明总铬含量为64.46~105.88 μg · g-1，平均为82.97 μg · g-1，各区含量呈显著差异。
蔡文贵等[35]利用牡蛎(Crassostra rivularis)等海洋双壳类软体动物对铬具有较强的富集能力，采用“贻贝(牡蛎)观察”技术对广东沿海牡蛎体的总铬含量水平、地理分布特点和变化趋势进行了研究，于1989~1997年在广东沿海12个点进行了连续监测，结果表明，1994年以后牡蛎体总铬的平均含量呈上升趋势。
4. 微量铬的检测方法
在铬的应用和监测的研究中，微量铬检测方法的研究是其中的重要内容之一。多年来，科学界陆续建立了许多检测微量铬的方法：
(1) 原子吸收光谱法。检测范围0.08~3.0 mg · L-1，使用方便，精密度和准确率都较高，但对于浓度值小于0.08 mg · L-1的低浓度样品则无法进行检测[36]。
(2) 分光光度法。是一种常用方法，检测范围0.004~1.0 mg · L-1。目前已经发展成快速、简便的流动注射光度分析的新方法[37-38]，该法选择性好、灵敏度高、分析速度快。
(3) 共振散射光谱法。贺冬秀等[39]研究了在磷酸介质中铬Ⅵ-碘化钾-吖啶橙(AO)体系的共振散射光谱体系，确定了散射光强度与溶液中铬(Ⅵ)浓度的关系，线性范围为0.008~0.48 mg · L-1铬(Ⅵ)，检出限为3.8 μg · L-1。衷明华[30]研究了在磷酸介质中铬(Ⅵ)-碘化钾-罗丹明B体系的共振散射光谱体系，确定了铬(Ⅵ)的质量浓度在0.03~0.08 mg · L-1范围内与散射光强度呈良好线性关系，检出限2.44 μg · L-1。
(4) 荧光猝灭法。马红燕等[40]用5-溴水杨基荧光酮(5-BrSAF)、黄莉莉[41]用吡咯红Y等，利用铬(Ⅵ)与有机试剂形成络合物或铬(Ⅵ)的氧化性，使体系荧光物质失去或增强荧光，从而建立测量铬(Ⅵ)的新方法。WANG等[42]研究了一种新型的有机纳米材料蒽/聚丙烯酰胺(anthracene/poly-acrylamide，AN/PAM)与铬(Ⅵ)反应发生荧光猝灭，建立了一种检测废水中铬(Ⅵ)含量的新方法，其线性范围为0.04~2.00 μg · mL-1，检出限为0.02 μg · mL-1。
(5) 催化动力学光度法。由于灵敏度高、简便实用而受到重视，近年来又有一些新的研究进展，如添加表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB) 等[43]增敏。余萍等[44]研究了在微乳液介质中，痕量铬(Ⅵ)催化过氧化氢氧化茜素红的褪色反应，建立了测定痕量铬的催化动力学新方法。在微乳液体系中，灵敏度比在表面活性剂CTMAB体系中提高了72.5%，在80℃反应温度下，线性范围为2.4~75 μg · L-1，检出限达4.27×10-10 g · mL-1。
(6) 极谱法。李艳霞等[45]研究发现在0.01 mol · L-1H2SO4介质中，铬Ⅵ对溴酸钾氧化甲基橙的反应具有强烈的催化作用，产生一灵敏的导数极谱波，从而建立了测定痕量铬Ⅵ的新方法。其线性范围为8.0×10-4~3.6×10-2 mg · L-1，检出限为1.25×10-7 mg · L-1。
还有其他一些方法，但实质上是上述方法的重新组合，都是为了寻找更精确、简便地检测微量铬的方法。
5. 研究展望
目前国内对铬作为动物微量元素及其促进生长、加强免疫等方面的应用研究较少，大多集中在禽畜类品种养殖上，在渔业中的应用研究不多。我国是世界第一大水产品生产国，铬在渔业生产中的应用具有很好的市场开发前景。笔者认为，今后很有必要在以下方面进一步深入开展研究。
5.1 有关机理的研究
目前对铬在渔业生产中的应用大多是实物的对照实验，而在有关机理上未有太大的进展，因此，需加强这方面的研究，包括：促进生长的机理、提高免疫功能的机理、提高抗应激能力的机理以及毒性效应等方面的基础理论研究。由于某些有机铬有可能导致畸变，因此铬分子的毒理作用是需要深入研究的重点之一。
5.2 有关铬有机化合物的研究
根据有关研究表明在养殖饲料中添加铬有机化合物是很好的使用途径，而不同的铬化合物及其不同的使用浓度对养殖水产生物的生长有不同的效果，因此一方面要加强现有三氯化铬、有机酸铬、蛋氨酸铬、甘氨酸铬和烟酸铬等化合物不同添加浓度、不同添加方法的研究，另一方面要探索更多、更高效的化合物。
5.3 扩展研究范围和研究种类
目前已有研究的水产品只有鲤、罗非鱼、团头鲂、虹鳟等少数几个种类，无论从养殖业发展的角度还是从市场经济的角度来说，今后的研究对象要扩大到更多的品种，经济价值高的海水养殖品种应是其中的重点。
5.4 安全浓度的研究
铬作为饲料添加剂使用时将存在2个必须引起充分重视的关键性问题：(1)残饵对水体的污染问题。目前水产养殖业中，残饵造成养殖水体富营养化的情况比较严重，铬作为饲料添加剂使用，同样会出现残饵造成养殖水体重金属残留的问题；(2)养殖水产品体内的铬残留问题。含铬饲料的使用，可能会引起水产品铬残留，造成重金属超标，影响质量安全。目前国外有关国家对我国出口水产品的技术壁垒主要是质量安全标准，准入门坎将会不断提高，重金属含量是其中的一项重要内容。因此，从可持续发展，加强国际市场的竞争力方面考虑，铬安全浓度的研究应是今后的主要研究方向之一。
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图 1 不同处理方法对DNA质量的影响
1~4. 酒精保存样品；5~6. 冷冻保存样品
1. 样品加入1.2 mL的双蒸馏水洗涤2次，每次10 min；
2. 样品加入1.2 mL双蒸馏水后放置时间为1 h；
3. 样品用培养皿约100 mL双蒸馏水洗涤2次；
4. 样品未洗涤；5. 剪碎前加蛋白酶K；
6. 剪碎后加蛋白酶K
Figure 1. Influences of different treatments of specimens on DNA quality
1~4. alcohol preserved tissue; 5~6. frozen tissue
1. washing twice with 1.2 mL distilled water, 10 minutes each;
2. washing twice with 1.2 mL distilled water, 1 hour each;
3. washing twice with 100 mL distilled water;
4. non-washing; 5. adding proteinase K before cuting;
6. adding proteinase K after cuting
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图 2 不同浓度dNTPs对RAPD反应的影响
1. DNA分子量；2. 10 μM；3. 20 μM；4. 50 μM；5. 100 μM
Figure 2. Effects of dNTPs concentration on RAPD amplification
1. DNA ladder; 2. 10 μM; 3. 20 μM; 4. 50 μM; 5. 100 μM
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图 3 Mg2+浓度对RAPD的影响
1. 空白对照；2. 1 mM；3. 1.5 mM；4. 2 mM；5. 2.5 mM；6. 3 mM；7. DNA分子量
Figure 3. Effects of Mg2+ concentration on RAPD amplification
1. control (no template DNA); 2. 1 mM; 3. 1.5 mM; 4. 2 mM; 5. 2.5 mM; 6. 3 mM; 7. DNA ladder
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图 4 Taq酶浓度对RAPD的影响
1. 空白对照；2. 0.25 U；3. 0.5 U；4. 1 U；5. 2 U；6. DNA分子量
Figure 4. Effects of Taq enzyme concentration on RAPD
1. control (no template DNA); 2. 0.25 U; 3. 0.5 U; 4. 1 U; 5. 2 U; 6. DNA ladder
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图 5 优化条件扩增的珍珠贝RAPD琼脂糖电泳图
Figure 5. Agarose electrophoresis of RAPD products amplified in optimal condition
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图 6 合浦珠母贝RAPD电泳图(引物S10)
a. 1.5%琼脂糖-EB染色；b. 4%非变性PAGE-银染1~12. 样品个体编号；M. DNA ladder
Figure 6. Electrophoretic photo of the RAPD products amplified by primer S10
a. 1.5% Agarose electrophoresis with EB staining; b. 4% non-denatured PAGE with silver staining 1~12. individuals numbering; M. DNA ladder
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