Pharmacokinetics of florfenicol in tilapia at two water temperatures
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摘要:
采用药饵给药，药物剂量为10 mg · kg-1，比较研究了22和28℃水温条件下奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O.aureus)体内氟苯尼考的药物动力学。结果得出，22℃组和28℃组罗非鱼血浆的峰药浓度(Cmax)分别为4.46和3.90 μg · mL-1，达峰时间(Tmax)均为12 h，消除半衰期(T1/2β)分别为10.03和8.12 h，药-时曲线下面积(AUC)分别为86.68和72.44 h · μg · mL-1。相应条件下的肌肉Cmax分别为6.88和4.59 μg · g-1，Tmax均为12 h，T1/2β分别为10.97和8.03 h，AUC分别为112.71和73.66 h · μg · g-1。低温组罗非鱼血浆和肌肉中药物的T1/2β均长于高温组，前者分别比后者长1.91和2.96 h，表明低温组罗非鱼体内药物的消除速度慢于高温组。虽然2个水温组血浆和肌肉中药物的Tmax相同，但低温组血浆、肌肉的Cmax和AUC均明显高于高温组，表明低温组罗非鱼吸收利用药物程度高于高温组。
Abstract:The pharmacokinetics of florfenicol in tilapia (Oreochromis niloticus×O.aureus) was studied in fresh water at 22℃ and 28℃.The tilapia were forced-fed with medicated feed containing a single dose of 10 mg · kg-1 bodyweight of florfenicol. The peak drug concentrations (Cmax), the time to the peak drug concentration (Tmax), the elimination half-lives (T1/2β) and the area under the concentration-time curve (AUC) in plasma were 4.46μg · mL-1, 12 h, 10.03 h and 86.68 h · μg · mL-1, respectively, at 22℃ and 3.90 μg · mL-1, 12 h, 8.12 h and 72.44 h · μg · mL-1, respectively, at 28℃. Corresponding Cmax, Tmax, T1/2β and AUC values in muscle were 6.88 μg · g-1, 12 h, 10.97 h and 112.71 h · μg · g-1, respectively at 22℃ and 4.59 μg · g-1, 12 h, 8.03 h and 73.66 h · μg · g-1, respectively, at 28℃. The elimination half-lives were longer at the lower water temperature than those at the higher water temperature, with the margin of 1.91 h in plasma and 2.96 h in muscle, respectively, which indicated that the drug was eliminated more rapidly at the higher water temperature than those at the lower water temperature. Although the same Tmax in plasma or muscle at both water temperatures were observed, however, the Cmax and AUC were lower in tilapia at the higher water temperature than those at the lower water temperature, indicating the better absorption and availability of florfenicol at the lower water temperature than at the higher water temperature.
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Keywords:
- pharmacokinetics /
- florfenicol /
- tilapia (Oreochromis niloticus×O.aureus) /
- temperature /
- plasma /
- muscle
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酶是活细胞产生的一类具有催化能力的蛋白质，是促进生化反应的高效物质。从20世纪80年代以来酶制剂已成为养殖业应用的热点。现今使用的多为复合酶制剂，对单一酶制剂的研究侧重于植酸酶、木聚糖酶及葡聚糖酶，而对于蛋白酶作为饲用酶制剂的研究甚少[1-2]。蛋白酶的作用是将组成蛋白的大分子多肽水解成寡肽或氨基酸，从而提高饲料蛋白的利用率。金属蛋白酶是从韩国巫婆蜘蛛(Nephila clavata)肠道分离出的微生物产生的高活性蛋白酶，该蛋白酶与饲料中的金属离子具有高度协同作用，对植物蛋白和动物蛋白有很强的分解能力，且安全、无毒，可作为各种饲料的酶制剂[3]。本试验在罗非鱼基础饲料中添加金属蛋白酶制剂，研究其对奥尼罗非鱼生长、消化率及非特异性免疫功能的影响，从营养物质的消化吸收和免疫学角度来探讨酶制剂的作用机理，为其在罗非鱼饲料中的推广应用提供依据。
1. 材料与方法
1.1 试验地点与时间
试验时间: 2006年6月30日~2006年8月24日。
试验地点: 中国水产科学院珠江水产研究所基地。
1.2 试验鱼
奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus × O.aureus)购于珠江水产研究所良种基地。
1.3 试验饲料
试验的基础饲料营养成分为粗蛋白30%、粗纤维15%、粗灰分15%、总磷0.6%、钙0.5%~1.2%、食盐0.2%~0.8%、赖氨酸1.0%、水分12.9%，试验饲料为基础饲料中分别添加0、0.03%、0.05%、0.10%的金属蛋白酶。试验饲料由佛山市金屏饲料有限公司加工。
金属蛋白酶由北京金英赛得科技有限公司提供，含600 000 IU · kg-1的蛋白酶，该蛋白酶是从韩国巫婆蜘蛛肠道分离出的微生物产生的高活性蛋白酶，并且与多数金属离子(Zn2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Co2+、Cu2+)具有高度协同作用，该酶制剂经特殊工艺包埋处理可耐高温，经检测，制粒后仍可保持80%以上的酶活。
1.4 试验设计与日常管理
1.4.1 生长试验
试验鱼暂养1周后，挑选规格较为一致的个体(平均体重8.5 g左右)放于网箱(1 m×1 m×1 m)，网箱置于室外水泥池，每网30尾。试验分4组，即对照、低浓度、中浓度、高浓度，每组各设3个重复。每天定时投饵(8：00, 11：30，17：00)，定时测定水温、溶氧、pH值，日投饵量为鱼体重的4%~6%，并根据鱼体进食情况和天气变化情况及时调整投饵量，试验期间水温为27.6~32.3℃，DO>4.0 mg · L-1，pH值为7.0~8.5。
1.4.2 消化率试验
试验分4组，同上，每组各设3个重复，在规格为69 cm×48 cm×60 cm的塑料箱中进行，每箱放鱼8尾，投喂添加1% Cr2O3的试验饲料，24 h连续充气。每天投饵2次(9：00，16：00)，投喂7 d后，每天喂料2 h后收集粪便，用捞网捞起条状粪便，用镊子选择新鲜、外表带有包膜的，尽可能完整的粪便放入容器中冷冻保存，实验结束后将每天收集到的粪便集中，并在60℃烘箱中烘干备用。
1.4.3 免疫试验
血清制备，生长试验结束次日，从每个网箱中对应取出8尾鱼，用1 mL一次性无菌注射器从鱼侧线下第2个鳞片处深入针头于脊柱正下方血管中取血，去掉针头，将血液注入1.5 mL的灭菌离心管中，放4℃冰箱过夜后，以4 000 rmp · min-1低温离心5 min，吸取上清液，每4尾鱼的上清液混合，置于-20℃冰箱备用。
1.5 测定指标
1.5.1 生长指标
在试验开始及试验结束的前1 d停止投饵，将鱼饥饿1 d。然后用电子天平称鱼体重，精确到0.01 g，计算相对增重率，饲料系数及成活率。有关计算公式如下:
$$ \begin{aligned} & \text { 相对增重率 }(\%)=\frac{\text { 试验末鱼均重-试验初鱼均重 }}{\text { 试验初鱼均重 }} \times 100 \\ & \text { 饵料系数 }=\frac{\text { 总摄食量 }}{\text { 鱼体净增重 }} \\ & \text { 成活率 }(\%)=\frac{\text { 试验末鱼总数-试验初鱼总数 }}{\text { 试验初鱼总数 }} \times 100 \end{aligned} $$ 1.5.2 表观消化率
蛋白质的测定采用凯氏定氮法，Cr2O3含量的测定采用湿氏灰化定量法。其计算公式为:
$$ \begin{array}{l} 蛋白质表观消化率(\% ) = 100 - 100 \times \frac{{{\rm{ 粪便中粗蛋白含量 }}}}{{{\rm{ 含量饲料中粗蛋白含量 }}}} \times \frac{{{\rm{ 饲料中 C}}{{\rm{r}}_2}{{\rm{O}}_3}{\rm{ 含量 }}}}{{{\rm{ 粪便中C}}{{\rm{r}}_2}{{\rm{O}}_3}{\rm{含量}}}}\\ 干物质表观消化率(\% ) = 100 - 100 \times \frac{{{\rm{ 饲料中 C}}{{\rm{r}}_2}{{\rm{O}}_3}{\rm{ 含量 }}}}{{{\rm{ 粪便中C}}{{\rm{r}}_2}{{\rm{O}}_3}{\rm{含量}}}} \end{array} $$ 1.5.3 溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD)活性
(1) 溶菌酶活力测定。采用溶菌酶试剂盒(购于南京建成生物工程研究所)，其原理为在一定浓度的混浊菌液中，由于溶菌酶能水解细菌细胞壁粘多肽使细菌裂解浓度降低，透光度增强，故可以根据浊度变化来推测溶菌酶含量。具体步骤见试剂盒说明书。
$$ \begin{aligned} &\text { 溶菌酶活力计算公式: 溶菌酶活力 }(\mathtt{μ} \mathrm{g} \text { • }\\ &\begin{aligned} & \left.\mathrm{mL}^{-1}\right)=\frac{\text { 测定管透光度 }- \text { 空白管透光度 }}{\text { 准管透光度 }- \text { 空白管透光度 }} \times \text { 标准管浓 } \\ & \text { 度 }\left(10 \mathtt{μ} \mathrm{~g} \cdot \mathrm{~mL}{ }^{-1}\right) \end{aligned} \end{aligned} $$ (2) SOD活力测定。采用超氧化物歧化酶试剂盒(购于南京建成生物工程研究所)，其原理为通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(O2- ·)，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。
SOD活力定义为，每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位(U)。测定步骤参照说明书进行，取样量为50 μL。SOD活力计算公式: 总SOD活力(U · mL-1) = $\frac{\text { 对照管吸光度 }- \text { 测定管吸光度 }}{\text { 对照管吸光度 }} \div 50 \% \times \frac{\text { 反应液总量 }}{\text { 取样量 }} $
1.6 数据统计处理
实验数据用Microsoft Excel作初步处理，用SPSS(Ver.11.5)进行统计分析。实验各组间的差异采用单因子方差(One-Way Anova)分析，多重比较采用最小显著差数法(LSD)，结果用平均数±标准差表示。
2. 结果与分析
2.1 金属蛋白酶对奥尼罗非鱼生长的影响
由表 1可知，与对照组相比，添加高浓度蛋白酶组的增重率表现显著性差异(P＜0.05)，其增重率提高了25.13%，而低浓度与中浓度组增重率虽有所提高，但差异不显著(P>0.05)。饵料系数各浓度组与对照组相比均有所降低，分别降低了6.98%、4.65%、12.79%，其中高浓度蛋白酶组与对照组相比，差异显著(P＜0.05)。饲料中添加金属蛋白酶对奥尼罗非鱼成活率没有显著性影响(P>0.05)。
表 1 金属蛋白酶对奥尼罗非鱼生长性能的影响Table 1. Effects of metalloprotease on growth performance of tilapia组别
group初均重/g
initial average weight末均重/g
final average weight增重率/%
weight gain rate饵料系数
feed conversation rate成活率/%
survival rate对照 control 8.70±0.14 45.23±1.54a 420.10±24.34a 1.72±0.04a 98.89±0.02 低浓度(0.03%)
light concentration8.38±0.36 45.88±2.59a 447.06±8.09a 1.60±0.14ab 96.67±0.01 中浓度(0.05%)
medium concentration8.17±0.17 44.18±1.54a 441.09±26.72a 1.64±0.08ab 97.78±0.04 高浓度(0.10%)
high concentration8.55±0.41 53.37±3.38b 525.68±64.05b 1.50±0.07b 97.78±0.04 注: 同一列不同字母表示差异显著(P＜0.05)
Note：Different letters in the same row mean significant difference(P＜0.05).2.2 金属蛋白酶对奥尼罗非鱼表观消化率的影响
由表 2可知，饲料中添加金属蛋白酶可提高奥尼罗非鱼对蛋白质的表观消化率。与对照组相比，添加高浓度蛋白酶组差异显著(P＜0.05)，其蛋白质消化率提高了5.25%。随着饲料中蛋白酶含量的增加干物质表观消化率呈上升趋势，与对照组相比，饲料中添加中浓度、高浓度蛋白酶组差异均显著(P＜0.05)，其干物质消化率分别了16.63%、27.82%，同时，高浓度组与低浓度组相比差异显著(P＜0.05)。
表 2 金属蛋白酶对奥尼罗非鱼营养物质表观消化率的影响Table 2. Effects of metalloprotease on the apparent digestibility of nutrient of tilapia组别
group蛋白质表观消化率
protein apparent digestibility干物质表观消化率
dry matter apparent digestibility对照 control 80.79±0.67a 46.37±1.50a 低浓度 light concentration 83.02±0.88ab 51.32±0.87ab 中浓度 medium concentration 82.91±2.25ab 54.08±5.19bc 高浓度 high concentration 85.03±0.92b 59.27±0.93c 注: 同一列不同字母表示差异显著(P＜0.05)
Note：Different letters in the same mean significant difference(P＜0.05).2.3 金属蛋白酶对奥尼罗非鱼非特异性免疫功能的影响
2.3.1 金属蛋白酶对奥尼罗非鱼血清溶菌酶活力的影响
如图 1可知，饲料中添加金属蛋白酶可提高血清溶菌酶活力，但差异不显著(P>0.05)。
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图 1 金属蛋白酶对奥尼罗非鱼血清溶菌酶活力的影响Figure 1. Effects of metalloprotease on the lysozyme activity in tilapia serum2.3.2 金属蛋白酶对奥尼罗非鱼血清超氧化物歧化酶活力的影响
如图 2可知，与对照组相比，饲料中添加高浓度蛋白酶的实验组差异显著(P＜0.05)，低浓度组、中浓度组SOD活力均有所提高，但差异不显著(P>0.05)。
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图 2 金属蛋白酶对奥尼罗非鱼血清超氧化物歧化酶活力的影响Figure 2. Effects of metalloprotease on the SOD activity in tilapia serum3. 讨论
3.1 金属蛋白酶对奥尼罗非鱼生长的影响
金属蛋白酶之所以促进罗非鱼生长，可能有以下几点原因: (1)该蛋白酶与饲料中的金属离子具有高度协同作用，当豆粕等饲料原料中含有金属离子时可以使金属蛋白酶的活性增加; (2)该蛋白酶对植物蛋白和动物蛋白有很强的分解能力，尤其是对植物蛋白，通过在动、植物原料中添加金属蛋白酶，可以显著提高水解产物中容易被动物吸收利用的必需氨基酸和非必需氨基酸的含量[3-4]; (3)可能会激活内源消化酶的分泌[5-6]，促进内外消化酶共同作用。
在奥尼罗非鱼基础饲料中添加0.10%的金属蛋白酶可以显著提高增重率并降低饵料系数。这与蛋白酶在畜禽上的许多报道相符，如在断奶仔猪日量中添加0.2%的酸性蛋白酶能提高仔猪断奶后日增重1.4%，提高饲料转化率9.0%[7]; 在肉鸡饲料中添加蛋白水解酶能提高饲料转化率[8]。
3.2 金属蛋白酶对饲料养分表观消化率的影响
在尼罗罗非鱼O.niloticus[9]、异育银鲫Carassius auratus gibelio[10]、黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco[11]和彭泽鲫Carassius auratus varpengze[12]等的研究中，含蛋白酶的复合酶制剂能提高营养物质消化率，特别是显著提高粗蛋白质和干物质的表观消化率。在虹鳟Oncorhynchus mykiss饲料中添加蛋白水解酶时，能增加粗蛋白的表观消化率[13]。奚刚等[14]也报道了饲料中添加中性蛋白酶能显著提高前期、后期丝毛乌骨鸡Gallus gallus domesticus brisson对粗蛋白的表观消化率。本试验中，饲料中添加0.10%的金属蛋白酶能显著提高奥尼罗非鱼对粗蛋白的表观消化率，添加0.05%和0.10%的金属蛋白酶能显著提高对干物质的表观消化率。这与上述研究报道相似。
3.3 金属蛋白酶对非特异性免疫功能的影响
水产动物体内的溶菌酶是一种重要的非特异性防御因子，特别是鱼生理防御水平的一个重要标志，也可以体现病原菌及其它环境因素对鱼体健康的影响[15]。溶菌酶活性提高，表明吞噬细胞活性增加，促进机体的免疫保护[16]。
超氧化物歧化酶广泛存在于各种需氧生物体内，具有清除机体在新陈代谢过程中产生的超氧阴离子自由基(O2+ ·)的能力，属于生物体内的防御系统酶类[17]。已有研究发现，SOD活性与生物的免疫水平密切相关，因此，可作为机体非特异性免疫评价指标[18]。
近年来，有关鱼类非特异性免疫功能的研究多数是关于低聚果糖、β-葡聚糖、低聚木糖、中草药、维生素C和维生素E的研究[19-23]，而对于酶制剂的研究很少。本研究结果表明，金属蛋白酶可提高罗非鱼血清SOD活力，且添加量为0.10%时与对照组相比差异显著(P＜0.05)。这与钟国防等[24]的报道，饲料中添加木聚糖酶和含蛋白酶的复合酶制剂能提高罗非鱼SOD活力(P＜0.01)相符，钟国防等认为添加酶制剂能提高非特异性免疫能力，主要是养分利用率对免疫应答有间接作用，其作用机制是添加酶制剂后，提高了罗非鱼的消化吸收能力，特别是提高了鱼体对蛋白质及其它营养成分的利用率，从而促进了相关免疫因子的合成。这与本研究的结果，即金属蛋白酶能提高奥尼罗非鱼蛋白质表观消化率和干物质表观消化率相符。另外，本研究显示，金属蛋白酶可以提高血清溶菌酶活力，但与对照组相比差异不显著。其原因可能是罗非鱼血清中溶菌酶含量比较低，微量酶制剂在短时间内对其发挥作用不明显。
致谢: 李刘冬副研究员在该研究检测方法方面给予了技术指导，谨此致谢！ -
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图 1 22和28℃水温下罗非鱼血浆内的药-时曲线
Figure 1. Curves of drug concentrations versus time in the plasma of tilapia at 22℃ and 28℃
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图 2 22和28℃水温下罗非鱼肌肉内的药-时曲线
Figure 2. Curves of drug concentrations versus time in the muscle of tilapia at 22℃ and 28℃
表 1 2种水温条件下罗非鱼体内氟苯尼考的药物动力学参数
Table 1 Pharmacokinetic parameters calculated for florfenicol in tilapia at two temperatures
组织tissue 水温/℃ water temperature 剂量/mg·kg-1 dose 药-时曲线下面积/h·μg·mL-1 (h·μg·g-1) AUC 峰药物浓度/μg·mL-1 (μg·g-1) Cmax 达峰时间/h Tmax 消除速率常数/h-1 β 消除半衰期/h T1/2β AUC与时间的乘积/h·μg·mL-1 (h·μg·g-1) AUMC 平均滞留时间/h MRT 血浆plasma 22 10 86.68 4.46 12 0.0691 10.03 1 864.34 21.51 28 10 72.44 3.90 12 0.0854 8.12 1 566.99 21.63 肌肉muscle 22 10 112.71 6.88 12 0.0632 10.97 2 234.85 19.83 28 10 73.66 4.59 12 0.0863 8.03 1 586.33 21.53 
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