甲醛(CH₂O，formaldehyde)又称蚁醛、亚甲基氧化物，是一种具有强还原性的原生质毒素。甲醛进入人体器官后，对人的神经系统、肺和肝脏均有损害，长期接触低剂量甲醛可引起慢性呼吸道疾病、鼻咽癌、结肠癌和脑瘤等，国家明令规定在食品中禁止使用甲醛。然而，由于用甲醛浸泡水产品和水发食品可提高产品的感官质量和延长保质期，近年来一些不法商贩为了获得较高利润，在水产品中人为添加甲醛，严重危害到消费者的食用安全和身体健康。

在食品分析中，分光光度法因具有操作简便、快速、灵敏度高和重复性好等优点而被较多的应用。对于水产品中甲醛含量的测定，主要的分光光度比色分析法有间苯三酚法^[1]、变色酸法(CTA法)和乙酰丙酮法^[2]，其中乙酰丙酮法是测定甲醛较为理想的分析方法。用乙酰丙酮法测定食品中甲醛含量时，一般采用蒸馏法前处理样品，样品中的甲醛先在磷酸介质中加热蒸馏出来，再与显色液反应，然后比色测定，食品成分、磷酸用量和浓度等对甲醛测定存在较大影响^[3]。文章采用乙酰丙酮法对水产品中的甲醛进行定量分析，与蒸馏法相比，改进和简化了样品前处理条件，并对样品的前处理条件、比色测定参数和检测限进行了研究，比较了此方法和蒸馏法前处理样品的回收率和精密度，同时对方法的可行性进行了分析。

1.   材料与方法

1.1   材料

仪器。SPECTRONIC GENESYS 5紫外分光光度计，DS-1高速组织捣碎机，电子天平，SIGMA-3K30冷冻离心机，雷磁pHS-25 pH计。

试剂：(1)甲醛标准溶液。吸取0.3 mL含量为37.0%~40.0%甲醛溶液于100 mL容量瓶中，用水定容，混匀，为甲醛储备溶液，冷藏保存(此溶液可保存1个月)；用碘量法标定，临用时取适量稀释至5 μg · mL^-1；(2)乙酰丙酮溶液。称取乙酸铵25.0 g，溶于100 mL水中，加冰乙酸3 mL和乙酰丙酮0.4 mL，混匀，贮存于棕色瓶(此溶液置于冰箱冷藏可保存1个月)；(3)100 g · L^-1三氯乙酸溶液。称取固体三氯乙酸100.0 g溶于水中，稀释至1 000 mL；(4)100 g · L^-1氢氧化钾溶液。称取固体氢氧化钾100.0 g溶于水中，稀释至1 000 mL。所用试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

样品。冰鲜龙头鱼(Harpadon nehereus)、冰鲜花斑蛇鲻(Saurida undosquamis)和鲜活罗非鱼(Tilapia mossambica)等水产品，均购于广州市海珠区大江苑市场。

1.2   方法原理

甲醛与乙酰丙酮及氨作用，生成黄色的3，5-二乙酰基-1，4二氢卢剔啶(3，5-diacetyl-1，4-dihydrolutidine)^[4]，根据有色物质颜色的深浅，用分光光度计在412 nm处比色定量。其化学反应式如下：

1.3   样品处理

取水产品肌肉等可食部分，取样量不应少于100 g，样品切为小块，用高速组织捣碎机充分捣碎混匀。称取捣碎混匀的样品5.00 g置于150 mL具塞三角瓶中，按原料质量与水体积比为1 : 10(W/V)加水于三角瓶中，塞上瓶塞，振摇使其混合均匀，立即在冰浴中(防止甲醛挥发)放置10 min，加入100 g · L^-1三氯乙酸10 mL，混匀，于4℃、4 000 r · min^-1离心5 min，过滤，用100 g ·L^-1氢氧化钾溶液调滤液pH值于6左右，将滤液移入100 mL容量瓶中，定容。同时做空白试验。

1.4   样品检测

1.4.1   绘制甲醛标准曲线

分别吸取5 μg ·mL^-1甲醛标准溶液0.00、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00和5.00 mL于10 mL纳氏比色管中，加水至刻度，接着加入1 mL乙酰丙酮溶液，混合均匀，然后在沸水浴中显色3 min(注：试样放入沸水浴后，水需在20 s内复沸腾)，取出用自来水冷却至室温。以空白为参比，于波长412 nm处，以1 cm比色杯进行比色，测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，甲醛含量为横坐标，绘制标准曲线。

1.4.2   样品测定

取处理好的样品浸泡液10 mL于10 mL纳氏比色管中(如果甲醛含量太高可以稀释)，加入乙酰丙酮溶液1 mL，混合均匀。显色方法和比色步骤同1.4.1。记录吸光度值，查标准曲线计算甲醛含量。1.4.3计算样品中甲醛含量按下式计算：

式中X为样品中甲醛含量，单位为毫克每千克(mg · kg^-1)；A为样品管中甲醛含量(μg ·mL^-1)；v为样品浸泡液总体积(mL)；m为样品质量(g)。

2.   结果与分析

2.1   最大吸收波长的选择及其线性关系

经甲醛标准溶液显色后的吸收波长光谱扫描实验，发现该溶液在波长412 nm处有最大吸收峰(图 1)，这与吴鑫德和刘勋钢^[5]报道的结果吻合。

图  1  甲醛标准溶液紫外-可见分光光度计吸收波谱扫描图

Figure  1.  Absorbency spectrum scan of the formaldehyde standard solution

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2.2   显色时间的确定

甲醛标准曲线见图 2。甲醛含量在0~2.5 μg · mL^-1范围内，此方法具有很好的线性关系。

图  2  甲醛标准曲线

Figure  2.  The standard curve relation between absorbency and formaldehyde content

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甲醛溶液浓度分别为1、2和3 μg · mL^-1时，其与乙酰丙酮在沸水浴中的显色时间与吸光度的关系见图 3-a~c。甲醛与乙酰丙酮在沸水浴中反应生成显色产物的速度很快，在显色2~3 min内，各浓度甲醛溶液中显色产物3，5-二乙酰基-1，4二氢卢剔啶的吸光度值均达到最大值，即表示显色已完全，实验表明室温下此显色液的吸光度值在10 h内基本不变；随着在沸水浴中显色时间的延长，各浓度甲醛溶液中显色产物的吸光度值均有不同程度的下降，但下降幅度较小，吸光度值的变化范围均在0.00~0.030以内，因此，基本上可看作是稳定的。实验选择3 min作为沸水浴中的显色时间。

图  3  甲醛-乙酰丙酮溶液沸水浴中显色时间与吸光度的关系

Figure  3.  Relationships between reaction time of formaldehyde-acetyle acetone solution in boiling water incubation and absorbency

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2.3   样液pH值对吸光度值的影响

像龙头鱼、罗非鱼、蛇鲻等白色肌肉的鱼浸泡液若不使用蛋白质沉淀剂而直接离心、过滤，则滤液略显乳白色，而且在沸水浴中显色后，会产生细小的白色颗粒或絮状沉淀，影响比色结果。由于三氯乙酸既可作为蛋白质沉淀剂，又可作为甲醛萃取剂^[6]，所以采用三氯乙酸作为蛋白质沉淀剂。但三氯乙酸的酸性比较强，能明显改变样品浸泡液的pH值，从而对比色结果会造成一定影响，因此，需加入碱性物质使样品浸泡液pH值满足显色要求。此实验采用100 g · L^-1的氢氧化钾调节相同质量的同一海水鱼浸泡液pH值分别为1.2、1.3、1.45、3、4、5、6、7和8，比色测定，记录吸光度值。每一pH值做3个重复，各吸光度值取其平均值，结果见图 4。

图  4  样品浸泡液pH值对吸光度的影响

Figure  4.  Effects of soaking solution pH value on the absorbency of reaction solution

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在样品前处理过程中，当加入100 g · L^-1三氯乙酸10 mL时，样品浸泡液的pH值降至1.3左右，所测得的吸光度值偏小；调节样液pH值至6.0时，吸光度值达到最大值。当样品浸泡液的pH值调节至3~8之间时，每10 mL样液中分别加入1mL乙酰丙酮液后，混合液的pH值均在5.4~5.5之间，各样液吸光度值的变化幅度比较小；采用蒸馏法前处理样品，样品蒸馏液的pH值呈弱酸性，一般不需要调节pH值。在此方法中，由于三氯乙酸的酸性比较强，样液不调节pH值所测得的吸光度值会偏小致使结果偏低，所以样品前处理过程中将样液pH值用100 g · L^-1氢氧化钾调至6，使之介于吸光度值的变化幅度较小的范围之内。

2.4   显色剂用量的确定

当样品中甲醛含量太高时，显色剂乙酰丙酮用量不足，会致使测定结果偏低；反之，当甲醛含量一定时，显色剂用量太多，也会使测定结果偏低。此实验结果表明，当样液中甲醛含量大于12 μg ·mL^-1时，加显色剂乙酰丙酮溶液2 mL与加1 mL相比，样液稀释10倍后的吸光度值明显要大一些(图 5)。在实际检测过程中，当乙酰丙酮用量确定为1 mL时，可根据样品中甲醛含量的多少，选择合适的取样量或稀释倍数。

图  5  乙酰丙酮用量对吸光度的影响

Figure  5.  Effects of acetyle acetone dosage on the absorbency of reaction solution

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2.5   浸泡时间对吸光度的影响

取市售冰鲜龙头鱼和鲜活罗非鱼肌肉样品(鲜活罗非鱼肌肉中不含甲醛或者含量甚微，在罗非鱼肌肉样品中均添加20 μg · g^-1甲醛进行测定)，分别于冰浴中浸泡5、10、20和30 min后测定。实验结果表明，浸泡时间为10 min时样品吸光度值最高(图 6)。当浸泡时间达到10 min后，随着浸泡时间的延长，甲醛含量不升反而略有下降。这很可能与甲醛性质有关，当浸泡时间延长，样品中游离出来的甲醛会与浸泡液中逐渐增多的水溶性的蛋白质、胺类化合物中的游离氨基酸作用，结合到蛋白质等分子上，沉淀蛋白质后过滤时随蛋白质等杂质一起滤去而有一定损失。此外，随着浸泡时间的延长，甲醛也会有一定的挥发。

图  6  浸泡时间对吸光度的影响

Figure  6.  Effects of soaking time on the absorbency of reaction solution

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2.6   回收率

向已知甲醛含量的样品中加入一定量甲醛标准溶液，测定结果之差与加入甲醛量之比即为回收率。取同一海水鱼肌肉样品，分别采用浸泡法和蒸馏法前处理样品做回收率实验，每一加标量做3个平行，结果见表 1。采用此方法即浸泡法前处理样品的回收率明显高于蒸馏法前处理样品的回收率，浸泡法处理样品的回收率在89.50%~94.25%之间，蒸馏法前处理样品的回收率在64.17%~76.92%之间。

表  1  甲醛测定回收率实验

Table  1.  Results of the recovery experiment in formaldehyde determination

添加甲醛量/μg·g-1	FA added	4	10	20
浸泡法/μg·g-1 soaking method	X1	23.58	27.94	37.51
	X2	23.94	28.82	37.10
	X3	23.28	29.58	38.93
平均值 average	23.60	28.78	37.85
本底含量/μg·g-1  intrinsic FA amount			19.83
回收率/%  recovery		94.25	89.50	90.10
蒸馏法/μg·g-1 distillation method	X1	22.63	28.03	31.85
	X2	23.30	26.87	32.78
	X3	22.47	27.54	33.25
平均值 average	22.80	27.48	32.62
本底含量/μg·g-1  intrinsic FA amount			19.79
回收率/%  recovery		75.31	76.92	64.17

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2.7   精密度

称取6份5 g(精确到0.01 g)同一海水鱼肌肉样品，采用浸泡法前处理样品作精密度实验，结果见表 2。6次测定的标准偏差(S)为0.58，相对标准偏差(RSD，%)为2.93%，其方法的精密度符合分析的要求。

表  2  甲醛测定精密度实验

Table  2.  Results of precision tests in formaldehyde determination

测定次数 testing times	1	2	3	4	5	6	S	相对标准偏差/% RSD
本底含量/mg·kg-1 intrinsic FA amount	20.12	19.70	18.93	20.42	19.13	19.96	0.58	2.93
平均值/mg·kg-1 average				19.71

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2.8   检测限

用分光光度法检测样品，以扣除空白值后的吸光度为0.01相对应的浓度值为检测限，即检出限L＝ (标准质量×0.01) / (标准吸光度－空白吸光度)^[1]。此方法样品中甲醛的最低检出浓度为0.9 mg · kg^-1。

3.   讨论

近年来国内外学者的研究表明，甲醛是细胞代谢的中间产物，因此，各种食物中均含有一定量的“天然甲醛”^[7]。李绮等^[8]报道中国一些香菇品种中的甲醛本底含量可高达45 mg · kg^-1；马敬军等^[9]也报道在对虾、鳕鱼、鳗鲡及很多水产品中都检测到甲醛，且甲醛量多在0.1~31.8 mg ·kg^-1之间，其中冻鳕鱼甲醛含量最高可达200 mg ·kg^-1。

水产品中的甲醛存在方式可分为3类，即以游离状态、可逆结合状态和不可逆结合状态存在^[9]。然而，水产品中各种存在状态的甲醛的含量以及比例目前还不清楚。采用蒸馏法前处理样品测定甲醛时，由于是在磷酸酸性介质中提取，而且又经高温处理，样品中的一些成分会发生一系列的化学变化，产生醛、酮类物质，会干扰比色测定结果；范荻等^[3]的研究也表明，用蒸馏法前处理样品测定食品中甲醛含量时，食品的成分、磷酸的用量和浓度对甲醛测定存在比较大的影响。

在此实验中发现，同一海水鱼样品用浸泡法前处理时所测得的结果与用蒸馏法前处理是一致的；回收率实验表明，随着甲醛添加量的增加，浸泡法的回收率明显高于蒸馏法(表 1)。蒸馏法的回收率相对较低，很有可能是因为甲醛在高温条件下有一定程度的挥发所致；而浸泡法由于是在冰浴之中前处理样品，温度较低，条件相对温和，甲醛不易挥发，食品中的各种化学成分也不容易发生太大的变化，干扰物质较少，所以浸泡法所测结果精密度好，回收率相对要高一些。

由于蒸馏法前处理样品需特殊蒸馏装置，反应条件剧烈，操作繁琐，耗时较长；而浸泡法前处理样品反应条件温和，操作相对简单、快速，回收率和精密度都比较高，适合大批量样品的处理和检测，在实际工作中更便于推广。