Isolation and usefulness of codominant markers from AFLPs and modifications of AFLP technique
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摘要:
AFLP作为新一代的分子标记，其应用越来越广泛，技术也越来越成熟。文章综述了AFLP多态带转化为SNPs、SSR等共显性标记的研究现状及AFLP改进技术的应用发展前景。
Abstract:Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) is a new molecular marker technique on the basis of PCR. AFLPs are widely employed in many fields and become more and more popular. Yet AFLPs are dominant markers and have natural limitations. How to convert dominant AFLP markers into codominant markers and the modifications of AFLP technique are the main focus of this review. The applications of the AFLP-derived markers are reviewed as well.
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Keywords:
- AFLP /
- dominant marker /
- codominant marker /
- conversion
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螺旋藻含有丰富、全面和均衡的营养成分，是一类人类优质保健品，被世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)推荐为人类优良食品资源。
钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)是一种由单列细胞组成、不分支、无异形胞的螺旋状卷曲的丝状体原核蓝藻；以形成藻殖段的方式进行繁殖，外界因素的影响容易导致其突变的发生[1-2]。钝顶螺旋藻是当前螺旋藻生产的2个主要种类之一。为了提高螺旋藻的产量、质量，降低生产成本，国内外许多学者采用驯化、自然选择、物理或化学诱变育种方式选育出了许多新的品系[3-8]。本文报道的是采用空间诱变育种技术结合地面选育技术选育钝顶螺旋藻新品系的研究结果。
空间诱变育种(太空育种或航天育种)是指利用太空运载工具如飞船、返回式卫星等将生物材料带到200~400 km太空环境，利用经太空特殊的、地面无法模拟的高真空、空间宇宙射线、高能粒子、宇宙磁场、微重力等强烈环境因素的诱变作用而产生变异，然后从返回地面的生物材料中选育新种质、新材料，培育新品种的作物育种技术。空间诱变育种具有变异频率高、变异辐度大、变异遗传性好、有益变异多、可获得罕见变异类型等特点[9]。
1. 材料与方法
1.1 藻种
ST-6钝顶螺旋藻取之于深圳市农科集团公司螺旋藻养殖场藻种室，经搭载我国第20颗返回式科学与试验卫星升空后返回。
1.2 培养基
实验室培养采用Zarrouk培养基。室外生产采用农科4号培养基(每升地下水分别加入粗海盐0.5 g，尿素0.05 g，NaHCO3 5 g，NaNO3 0.7 g，MgSO4 0.2 g，FeSO4 0.01 g，CaCl2 0.02 g，H3PO4 0.15 g，KCl 0.5 g，Na2SO4 0.25 g)，盐度为8~9。
1.3 实验方法
1.3.1 选育
将经空间诱变返回地面的藻种于实验室(温度24~26℃、光照强度3 200~4 000 lx)恢复培养。30 d后在显微镜下用毛细管法分离藻株，分离出藻丝体粗壮，螺旋个数10个以上的藻株在试管中单株培养。30 d后再分离，反复几次，直至选育出生长饱和期藻丝体均匀、生长速度快、性状稳定的品系。
1.3.2 比较
将选出的品系与未经诱变的出发品系ST-6按相同的浓度(藻浓度用吸光度OD560表示，OD560值用分光光度计测定，测定波长设为560 nm)接种在500 mL锥形瓶中(L：D=8 h：16 h)静止培养，每天定时人工摇动4次；观察它们对新环境的适应情况，测定每天的OD560值；336 h后使用250目的筛绢采收螺旋藻，洗净、烘干、称重，比较不同品系的生长速度。
1.3.3 蛋白质测定
扩培生长速度较快的品系，采集螺旋藻，用凯氏定氮法[10]测定候选品系的蛋白质含量，选出蛋白质含量高的优质品系。
1.3.4 扩大生产
将实验室中选育出的高产、优质品系在深圳市农科基地的螺旋藻养殖场(每个室外水泥池面积为1 143 m2)进行大规模生产性试验，通过形态对比、生产率[生产率=藻粉干重/(养殖天数×养殖面积)，生产率是养殖过程中衡量螺旋藻生长快慢的常用指标]比较和内含营养物测定来进一步检测所选品系的优良性和稳定性。
2. 结果与分析
2.1 稳定品系的选育
经恢复培养后观察，空间诱变后的钝顶螺旋藻在形态上发生了多极化变异(图 1)，有形态规则、粗壮，藻丝体长度比原来增长2~3倍的藻株；有直线型的藻株和2~3个螺旋的弱小藻株。
螺旋藻易受外界环境因素的影响而发生变异[7]。从笔者以往的生产中发现，在敞开式的培养条件下，螺旋藻常常出现一些负变异，主要表现为藻丝变直、不正常螺旋或藻丝变细、螺旋紧密等。经太空搭载的螺旋藻出现了多种形态的显著变异，表明了空间诱变是螺旋藻诱变育种的有效方法。螺旋藻与其他微生物材料[11]一样，在空间诱变中体现出变异率高和变异幅度大的特点。
通过单株分离和选育，得到7个12~18个螺旋的形态稳定品系，编号为PNK-1至PNK-7。
2.2 高产品系的筛选
每个候选品系接种4瓶(每瓶500 mL)，每次测量时取4瓶的平均OD560值作为该品系当时的OD560值，并对288 h的结果进行单因素方差分析，结果见表 1。
表 1 不同品系螺旋藻OD560值比较Table 1. The comparison of OD560 of different S.platensis strains品系
strain接种时间/h incubation time 0 48 96 144 192 240 288 PNK-1 0.097±0.005 0.178±0.018 0.316±0.011 0.597±0.057 0.815±0.052 1.108±0.143 1.348±0.201b PNK-2 0.097±0.004 0.188±0.021 0.310±0.037 0.633±0.052 0.893±0.063 1.201±0.084 1.457±0.066a PNK-3 0.097±0.011 0.172±0.016 0.288±0.022 0.577±0.028 0.815±0.052 1.056±0.083 1.276±0.100c PNK-4 0.097±0.010 0.177±0.019 0.319±0.022 0.580±0.038 0.801±0.046 1.137±0.110 1.398±0.091a PNK-5 0.097±0.004 0.194±0.026 0.323±0.016 0.611±0.035 0.845±0.038 1.201±0.084 1.421±0.062a PNK-6 0.097±0.013 0.177±0.025 0.288±0.026 0.593±0.057 0.839±0.050 1.108±0.053 1.369±0.048a PNK-7 0.097±0.005 0.174±0.028 0.297±0.025 0.588±0.016 0.815±0.052 1.137±0.146 1.319±0.205b ST-6 0.097±0.007 0.163±0.026 0.271±0.029 0.547±0.037 0.714±0.047 0.921±0.096 1.164±0.137 注：a. 差异极其显著(P < 0.01)；b. 差异显著(0.01 < P < 0.05)；c. 没有显著差异(P>0.05)
Note：a. great significant difference (P < 0.01)；b. significant difference (0.01 < P < 0.05)；c. no significant difference(P>0.05)表 1显示PNK-2、PNK-4、PNK-5和PNK-6与出发品系ST-6差异极其显著(P ﹤0.01，t-test)，PNK-1和PNK-7与出发品系ST-6差异显著(0.01 < P < 0.05，t-test)，而PNK-3与出发品系ST-6没有显著差异(P>0.05，t-test)。结合各品系240 h的OD560值(表 1)和最终采收的生物量(图 2)，选取PNK-2和PNK-5作为下一步优质藻种筛选的候选品系。其中PNK-2的生物量比出发品系增加22.89%，PNK-5的生物量比对照组增加15.66%。
2.3 优质品系的选育
扩培PNK-2和PNK-5，并在螺旋藻对数生长期采集PNK-2和PNK-5螺旋藻2批次，测得PNK-2的蛋白质含量分别为70.3%和68.3%，PNK-5的蛋白质含量为68.7%和64.7%(表 2)，说明PNK-2是比PNK-5更为优质的品系。
表 2 PNK-2和PNK-5的蛋白质含量Table 2. Protein contents of PNK-2 and PNK-5% 品系
strain第一批
the first batch第二批
the second batchPNK-2 70.3 68.3 PNK-5 68.7 64.7 优质的藻种是决定螺旋藻内含营养物的先决条件，当然，外部培养条件的差异和不同的采收时间、采收方法等也都能影响内含物的含量[12]。
2.4 大规模生产试验
2005年5月30日至8月31日，将PNK-2与出发品系ST-6在的螺旋藻养殖场进行了4批次对比养殖试验，结果见表 3。
表 3 螺旋藻室外生产性试验结果Table 3. The records of outdoor production data of S.platensis生产日期
production period品系
strainOD560 藻粉干重/g
quantity of dry powder生产率/g·(m2·d)-1
production rate天气情况
weather接种
at 0 h采收
harvest滤液
filter liquor5.30~6.11 ST-6 0.155 1.097 0.092 103 000 8.19 雨天：1 d；降雨量20 mm PNK-2 0.155 1.187 0.046 125 000 9.94 7.5~7.16 ST-6 0.167 1.125 0.108 105 000 8.35 阴雨天：1 d；雨量15 mm PNK-2 0.167 1.222 0.056 126 000 10.02 8.4~8.15 ST-6 0.187 1.119 0.125 95 000 7.56 阴雨天：2 d，降雨量35 mm PNK-2 0.187 1.208 0.071 121 000 9.62 8.19~8.31 ST-6 0.180 1.131 0.143 98 000 7.14 雨天：2 d，降雨量50 mm PNK-2 0.180 1.268 0.086 131 000 9.55 4批次对比实验PNK-2的生产率分别比出发品系提高21.38%、20.00%、27.25%和33.75%。
螺旋藻属专营光合自养生物，以光作为能源还原CO2同化为碳水化合物。影响螺旋藻生长的环境因素主要是营养条件、温度、光照和pH，它们对螺旋藻的干物产量、化学组成及其含量均有影响。在光合自养生长过程中，当营养和温度不限制其生长时，光就成为影响其生长的主要因素。由于阴雨天气的阳光不充足，使得螺旋藻的光合作用减弱，导致产量降低；连续的下雨天气可造成螺旋藻大幅减产，甚至不能生产和收获[12]。在本实验的室外生产比较中，即使出现了2 d降雨量为50 mm的雨天和2 d降雨量为35 mm的阴雨天，PNK-2的生产率仍分别达到9.55和9.62 g·(m2·d)-1；当天气只出现1 d阴天和1d 15 mm的阴雨天时，其生产率就达到了10.02 g·(m2·d)-1。从表 3可见，在相同条件下，生长环境越恶劣，PNK-2与出发品系的生产率差距越大，显示出PNK-2具有更强的环境适应能力。
2.5 PNK-2形态特征
在对数生长期，PNK-2与出发品系ST-6在形态上有较大的差异(图 3、图 4)。与出发品系相比，PNK-2的螺旋个数为12~18个，藻丝体平均长度增长了166.52%，螺距平均长度增长了5.88%，螺宽平均长度增长了8.19%；藻丝宽平均长度增长了12.31%(表 4)。
表 4 出发品系与PNK-2主要形态特征比较Table 4. Comparison of morphology between PNK-2 and ST-6μm 特征
characterST-6 PNK-2 长度范围
length range平均长度
average length长度范围
length range平均长度
average length藻体长
length of algae body233.34~400.78 286.77±52.78 629.82~852.58 764.31±83.33 螺距
thread pitch48.28~52.11 50.04±1.38 50.93~59.00 52.98±2.71 螺宽
helix width15.70~18.92 17.33±1.07 17.46~20.44 18.75±0.90 藻丝宽
diameter of trichome5.07~5.66 5.36±0.20 5.83~6.42 6.02±0.18 螺旋个数
helix number5~8 12~18 2.6 PNK-2生化特征
从室外同批次生产的藻粉中各取样200 g，进行主要内含营养物的测定，结果见表 5。从结果可知PNK-2的藻粉蛋白质含量达到69.57%，较出发品系ST-6相比提高了8.31%；叶绿素含量为1.01%，提高了8.60%；β-胡萝卜素含量0.16%，提高了6.67%；藻蓝蛋白含量14.70%，提高了6.68%；γ-亚麻酸含量0.63%，减少了3.08%。
表 5 出发品系与PNK-2主要内含营养物含量比较Table 5. Comparison of nutrition contents between PNK-2 and ST-6% 品系
strain蛋白质
protein叶绿素
Chlorophyllβ-胡萝卜素
β-carotene藻蓝蛋白
phycocyaninγ-亚麻酸
γ-linolenic acidST-6 64.23 0.93 0.15 13.78 0.65 PNK-2 69.57 1.01 0.16 14.70 0.63 3. 结语
钝顶螺旋藻通过卫星搭载，在空间环境因素的综合作用下产生了较大幅度的变异。从变异材料中选育出来的新品系PNK-2生产率提高22.89%，室外大规模生产生产率提高20%以上。藻粉蛋白质、叶绿素、β-胡萝卜素、藻蓝蛋白等的含量均有较大幅度的增加，其中室外大规模生产的蛋白质含量达69.57%。表明了PNK-2是一株适合于室外大规模生产的优质高产的钝顶螺旋藻品系。
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图 2 采用磁珠富集法从AFLP片段中分离微卫星标记
Figure 2. Schematic representation of SSR isolation by magnetic beads from AFLP fragments
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