RAPD analysis of genetic difference among five species of grouper
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摘要:
运用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技术对鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)、驼背鲈(Cromileptes altivelis)、棕点石斑鱼(E.fuscoguttatus)、斜带石斑鱼(E.coioides)和鲑点石斑鱼(E.fario)的遗传多样性及系统发生进行了研究。从120个RAPD随机引物中筛选出扩增效果好的引物19个，分别用于5种石斑鱼基因组DNA的扩增。结果显示，5种石斑鱼平均多态性位点比率(P)分别为64.23%，72.61%，60.34%，69.97%，73.94%；个体间平均遗传相似系数(S)分别为0.8238，0.8110，0.8345，0.8277，0.8064；平均遗传距离(D)分别为0.1762，0.1890，0.1655，0.1723，0.1936；平均Nei基因多样性指数(H)分别为0.1189，0.1364，0.1028，0.1439，0.1648；平均Shannon信息指数(Hi)分别为0.1801，0.1992，0.1530，0.2100，0.2434。5个种间的遗传距离(Dxy)在0.3964~0.6085之间。
Abstract:Genetic diversity and molecular evolution of five species of grouper, viz.Epinephelus lanceolatus, Cromileptes altivelis, E.fuscoguttatus, E.coioides and E.fario, were detected using RAPD technique. A total 120 random primers were evaluated for the usefulness. And thereinto, 19 random primers were selected according to the effect of PCR of genomic DNA of 5 species of grouper. The results showed as the followings: the polymorphic loci ratio in E.lanceolatus, C.altivelis, E.fuscoguttatus, E.coioides and E.fario (P) were 64.23%, 72.61%, 60.34%, 69.97% and 73.94%, respectively. The mean genetic similarity index of intra-species (S) were 0.8238, 0.8110, 0.8345, 0.8277, 0.8064, respectively, the mean genetic distances of intra-species (D) were 0.1762, 0.1890, 0.1655, 0.1723 and 0.1936, respectively, Nei′s gene diversity (H) were 0.1189, 0.1364, 0.1028, 0.1439 and 0.1648, respectively, and Shannon′s information index (Hi) were 0.1801, 0.1992, 0.1530, 0.2100, 0.2434, respectively. The mean genetic distances of inter-species (Dxy) were between 0.3964~0.6085.
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Keywords:
- RAPD /
- grouper /
- Epinephelus lanceolatus /
- Cromileptes altivelis /
- E.fuscoguttatus /
- E.coioides /
- E.fario
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石斑鱼作为海水养殖名贵的经济鱼类，具有病害少、生长快等优势，是海水养殖业进行海洋生物高值化技术开发最理想的选择之一。但因石斑鱼个体发育中普遍存在“先雌后雄”的性转变过程，雄性亲鱼均高龄化，使得石斑鱼的人工繁殖成为世界性海水养殖难题之一。世界不少国家和地区都投入大量人力和资金对石斑鱼人工繁殖技术进行攻关研究，希望人工育苗产业化。石斑鱼养殖经济效益巨大，而目前人工繁殖技术尚未完全攻克，自然苗种无法满足日益扩大的养殖规模，必然对石斑鱼的自然资源造成极其严重的破坏。为了使石斑鱼的自然资源得到更好的保护、开发和利用，避免种质退化，需对其遗传背景进行分析，弄清石斑鱼种群的遗传多样性和亲缘关系，建立种质标准和繁育保护体系。
文章采用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技术对5种石斑鱼进行了研究，分析它们种内和种间遗传多样性、种间亲缘关系和系统分化，并建立分子遗传标记，以期从分子遗传水平为保护、开发、管理和持续利用海洋渔业资源提供一定的基础数据和理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
从2001年3月至2004年10月分批采集了5种石斑鱼的野生种各20尾，鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)和棕点石斑鱼(E.fuscoguttatus)采自中国台湾，驼背鲈(Cromileptes altivelis)采自印度尼西亚，斜带石斑鱼(E.coioides)和鲑点石斑鱼(E.fario)采自深圳，取背部肌肉或尾鳍，95%乙醇溶液保存。
1.2 基因组DNA的提取
称取0.1 g保存于95%乙醇溶液中的组织，加500 μL STE缓冲液，用剪刀剪碎组织，弃液体，加500 μL STE，混匀后加入终浓度分别为1%的SDS和200 μg·mL-1的蛋白酶K，56℃消化过夜。先后用等体积的苯酚(Tris饱和，pH=8.0)，苯酚:氯仿(体积比V/V，1:1)，氯仿:异戊醇(V/V，24:1)各抽提一次以去除蛋白质。最后上清液加2倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA，并用70%乙醇洗涤沉淀2遍，室温干燥后，溶于适量TE(10 mmol·L-1 Tris-HCI，pH=8.0，1 mmol·L-1 EDTA，pH=8.0)或重蒸水中。用紫外分光光度计测定浓度，然后分装并置于4℃或-20℃保存。
1.3 引物筛选
该研究对6个系列120个引物进行筛选，筛选出19个重复性好、谱带清楚、位点数量适中且共同适用于这5种石斑鱼的引物(表 1)。
表 1 筛选出的19个引物的序列Table 1. The sequences of selected 19 primers引物 primer 序列(5′~3′) sequence S61 TTCGAGCCAG S70 TGTCTGGGTG S121 ACGGATCCTG S287 AGAGCCGTCT S321 TCTGTGCCAC S325 GTGCCGTTCA S326 GTGCCGTTCA S327 CCAGGAGGAC S340 ACTTTGGCGG S462 TCGGCACGCA S464 GTGTCTCAGG S468 ACATCGCCCA S469 GTGGTCCGCA S471 AACGCGTCGG S474 CCAGCCGAAC S475 GGAAGCCAAC S477 TGACCCGCCT S478 GGCTTGGCCT S479 GGGAAGGACA 1.4 RAPD反应体系
PCR反应体系为1×PCR Buffer(其中含50 mmol·L-1 KCl、10 mmol·L-1 Tris-HCl、1 g·L-1 Triton x-100)、2.0 mmol·L-1 MgCl2、dNTP各0.2 mmol·L-1、15 ng引物、20 ng DNA、1.5 U TaqDNA聚合酶、加ddH2O至25 μL。RAPD的PCR反应程序:94℃预变性200 s；94℃变性20 s，36℃退火40 s，72℃延伸70 s，40个循环；最后72℃延伸5 min。
1.5 扩增产物检测
RAPD扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶(含0.5 μg·mL-1 EB)中电泳检测，电压5 V·cm-1，电泳结束后用Tanon GIS-2008凝胶成像分析系统观察并拍照。
1.6 数据分析
使用Gel-Pro Analyzer凝胶图像分析软件对扩增片段大小进行计算。按公式[1]计算多态位点比例P=(群体的多态位点数/位点总数)×100%。参照LYNCH[2]的方法，Sxy=2Nxy/(Nx+Ny)计算个体间的遗传相似系数，式中Nxy为2个个体x和y共享RAPD条带数，Nx和Ny分别为x和y拥有的RAPD条带数。用RAPDistance[3]软件计算群体内的遗传相似系数(S)，用公式D=1-S[4]计算群体内的遗传距离。用POPGENE软件计算Nei基因多样性指数H[5]和Shannon信息指数Hi[6]:
$$ H=1-\sum\limits_{i=1}^k p_i^2, \quad H_i=-\sum\limits_{i=1}^k p_i \times \ln p_i $$ 式中k为所统计的总位点数；pi为该种群第i个位点的等位基因频率。
群体间的遗传距离根据Nei的公式[7]，采用POPGENE软件计算，遗传相似系数:
$$ I=\frac{\sum\left[\left(x_i \times y_i\right)\right]}{\sqrt{\sum x_i^2 \times \sum y_i^2}} $$ 其中xi，yi表示第i条带分别在群体x，y中出现的频率。群体间的遗传距离Dxy=-lnI。
聚类分析采用邻近结合法(NJ)和最小进化法(ME)，用遗传距离为参数，使用Mega Ver. 3.0软件构建物种的系统发生树。
2. 结果
2.1 种内遗传多样性
19个引物用于鞍带石斑鱼、驼背鲈、棕点石斑鱼、斜带石斑鱼和鲑点石斑鱼的扩增，依据电泳图谱计算得出遗传多样性结果如表 2所示。
表 2 5种石斑鱼的分子遗传分析Table 2. Molecular genetic analysis among 5 species of grouper鞍带石斑鱼
E.lanceolatus驼背鲈
C.altivelis棕点石斑鱼
E.fuscoguttatus斜带石斑鱼
E.coioides鲑点石斑鱼
E.fario多态性位点比率(P)/%
polymorphic loci64.23 72.61 60.34 69.97 73.94 平均遗传相似系数(S)
mean genetic similarity index0.8238 0.8110 0.8345 0.8277 0.8064 平均遗传距离(D)
mean genetic distances0.1762 0.1890 0.1655 0.1723 0.1936 平均Nei基因多样性指数(H)
mean Nei′s gene diversity0.1189 0.1364 0.1028 0.1439 0.1648 平均Shannon信息指数(Hi)
Shannon′s information index0.1801 0.1992 0.1530 0.2100， 0.2434 2.2 种间遗传多样性
参照Nei的方法，利用POPGENE软件计算出5种石斑鱼在19个引物中各种间的遗传相似系数(Ixy)和遗传距离(Dxy)。计算结果，鞍带石斑鱼与棕点石斑鱼之间的遗传距离值最大(0.6085)，驼背鲈与鲑点石斑鱼之间的遗传距离最小(0.3964)。
为了更直观方便地看出5个种之间的相互关系，将Nei′s平均遗传相似系数和平均遗传距离列为表 3。
表 3 5种石斑鱼的Nei′s遗传相似系数和遗传距离值Table 3. Nei′s genetic identity and genetic distance among 5 species of grouper鞍带石斑鱼
E.lanceolatus驼背鲈
C.altivelis棕点石斑鱼
E.fuscoguttatus斜带石斑鱼
E.coioides鲑点石斑鱼
E.fario鞍带石斑鱼 - 0.6184 0.5577 0.6188 0.5973 驼背鲈 0.4980 - 0.5930 0.6537 0.6781 棕点石斑鱼 0.6085 0.5517 - 0.6433 0.6045 斜带石斑鱼 0.5103 0.4446 0.4565 - 0.6439 鲑点石斑鱼 0.5315 0.3964 0.5228 0.4691 - 注:对角线以上为Nei′s遗传相似系数，对角线以下为遗传距离
Note:Nei′s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal).以种间的遗传距离(Dxy)作为参数，采用NJ法和ME法，对5种石斑鱼构建物种的系统发生树(图 1和图 2)。可以看出，NJ法和ME法得到的聚类图一致，5种石斑鱼分为2支，驼背鲈和鲑点石斑鱼首先聚为一支，然后和鞍带石斑鱼聚类，棕点石斑鱼和斜带石斑鱼聚为一支。结果表明，驼背鲈和鲑点石斑鱼，棕点石斑鱼和斜带石斑鱼两两亲缘关系最近。
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图 1 NJ法构建5种石斑鱼的分子进化树Figure 1. Molecular phylogenetic tree of five species of grouper reconstructed by NJ method in Mega![]()
图 2 ME法构建5种石斑鱼的分子进化树Figure 2. Molecular phylogenetic tree of five species of grouper reconstructed by ME method in Mega2.3 种间特异性标记
在某引物的扩增图谱中，某个种的所有个体都拥有，但其它种的个体不具备的片段，称为某个种的特征片段或特异性片断，这些特征片断可以用来协助石斑鱼的种类鉴别。在所选出的19个引物的扩增产物中，大都能找到1~2种鱼的特征谱带。
在引物S61的扩增产物中(图 3)，鞍带石斑鱼的特征片断为966 bp，驼背鲈的特征片断为867 bp，棕点石斑鱼特征片断有2个，分别为697和434 bp。这些特征片断可用作区别于其它石斑鱼种类的特征标记。
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图 3 引物S61在5种石斑鱼中的RAPD带谱电泳图M. PCR markers；1~6. 鞍带石斑鱼的6个个体；7~12. 驼背鲈的6个个体；13~18. 棕点石斑鱼的6个个体；19~24. 斜带石斑鱼的6个个体；25~30. 鲑点石斑鱼的6个个体；箭头所指谱带分别为鞍带石斑鱼、驼背鲈和棕点石斑鱼(2个)的特异性谱带，从左到右依次为966，867，697，434 bpFigure 3. RAPD bands generated by primer S61 in five species of grouperM. molecular size marker (DL1543);1~6. E.lanceolatus; 7~12. C.altivelis; 13~18. E.fuscoguttatus; 19~24. E.coioides; 25~30. E.fario; Arrow species-specific markers in E.lanceolatus, C.altivelis and E.fuscoguttatus (two), respectively, molecular weight from left to right, 966, 867, 697, 434 bp.3. 讨论
在RAPD分析中，多态性位点比例(P)和Nei基因多样性指数(H)以及Shannon信息指数(Hi)都是衡量群体内遗传多样性水平高低的重要指标，种群的遗传多样性水平越高，适应环境的能力就越强，反之，适应环境的能力就越弱，在长期的进化中被淘汰的可能性就增大。该研究对5种石斑鱼的遗传多样性研究结果显示，从多态性位点比率(P)的数值来看，鲑点石斑鱼的遗传多样性最丰富，达73.94%，驼背鲈次之(72.61%)，然后是斜带石斑鱼(69.97%)，鞍带石斑鱼(64.23%)，最低是棕点石斑鱼(60.34%)；从Nei基因多样性指数(H)来看，也是鲑点石斑鱼最高(0.1648)，斜带石斑鱼次之(0.1439)，然后是驼背鲈(0.1364)，鞍带石斑鱼(0.1189)，最低仍是棕点石斑鱼(0.1028)；5种石斑鱼的Shannon信息指数(Hi)与Nei基因多样性指数(H)排序一致，分别为0.2434、0.2100、0.1992、0.1801、以及0.1530。3个指标所显示的5种石斑鱼的遗传多样性大小顺序基本一致。
郑莲与刘楚吾[8]、尹绍武等[9]和GOVINDARAJU与JAYASANKAR[10]分别利用RAPD对不同石斑鱼遗传多样性进行分析，结果表明，在野生群体中，中国南海石斑鱼的多态性位点比率为55.56%~86.75%，印度洋的为25.42%~49.15%，表明中国南海石斑鱼的遗传多样性较为丰富，种质资源比较良好，明显优于印度洋石斑鱼的遗传多样性水平。从另一方面说明了我国对海洋渔业资源保护所做出的努力。另外，养殖群体与野生群体比较，其遗传多样性指标下降明显，显示在人工繁殖过程中，由于有效繁殖群体小，近亲繁殖、遗传渐渗等原因造成石斑鱼养殖群体遗传多样性下降，应引起足够重视。
刘楚吾等[11]用RAPD技术对湛江近海军曹鱼(Rachycentron canadum)进行了分析，其中多态位点比例P为80.85%，Shannon信息指数Hi为0.4498，结果表明军曹鱼的遗传多样性比较丰富。丁少雄等[12]采用RAPD技术对
该研究采用NJ法和ME法2种聚类方法，得到的聚类图一致。2种方法所得结果，均是5种石斑鱼先分为了2支，驼背鲈和鲑点石斑鱼首先聚为一支，然后和鞍带石斑鱼聚类，棕点石斑鱼和斜带石斑鱼聚为一支。其中，驼背鲈和鲑点石斑鱼，棕点石斑鱼和斜带石斑鱼两两首先聚为一支，说明驼背鲈和鲑点石斑鱼，棕点石斑鱼和斜带石斑鱼遗传分化程度最小，它们的亲缘关系最近。
郑莲与刘楚吾[8]和尹绍武等[9]分别对不同石斑鱼的亲缘关系进行了RAPD分析，结果均表明鲑点石斑鱼和蜂巢石斑鱼(E.merra)的亲缘关系较近。从形态特征来看，2种石斑鱼在体形、体长，前鳃盖骨具棘和鳍条有色斑等特征也极为相似[13-15]。其它的研究报道[16-18]也证实RAPD方法可以应用于种间和属间亲缘关系的研究。
该研究聚类分析与传统分类学方法并不完全一致，在鲑点石斑鱼上有一定差异。聚类分析显示鲑点石斑鱼和驼背鲈亲缘关系最近，鞍带石斑鱼和驼背鲈跟石斑鱼属有较近的亲缘关系。而传统分类学是把鲑点石斑鱼、棕点石斑鱼、斜带石斑鱼归入石斑鱼属，驼背鲈单列为驼背鲈属，鞍带石斑鱼为宽额鲈属[13-15]。这种差异可能是由于方法本身的特点所造成的，传统分类学主要是从形态学或表型性状上来检测遗传变异，但是遗传表达有时不太稳定，易受环境及基因显隐性的影响，所以得到的信息和结论不够准确、完善，很难建立饱和的遗传图谱。RAPD方法是随机引物的扩增，理论上是对整个基因组的扩增，只要使用足够多的引物，就可以较为客观地评估种群间的遗传分化。因此，在研究工作中，应结合实际情况对研究对象进行综合分析，找出最合适的方法或几种方法结合使用，互相印证，以期得到正确的结论。
大部分石斑鱼属鱼类外部形态特征相似，体色随环境变化，而且仔稚鱼和幼鱼与成鱼之间的形态和体色差异明显，这些均给石斑鱼的种类鉴别带来一定困难。该研究在RAPD研究中发现的一些种类特征性片断(图 3)，可以用来协助这些种类的鉴别，为石斑鱼种类鉴定和人工繁育及遗传育种提供科学依据。此外，每个引物在每种鱼中扩增的图谱均不相同，可称之为“RAPD的指纹图谱”，结合特征片断可对石斑鱼种类进行鉴别。
生物群体遗传多样性水平是评估生物资源的重要指标，与生物对环境的适应能力、生长速度、抗病能力、物种的进化速度等密切相关。石斑鱼是名贵海产经济鱼类，也是南方沿海重要的海水网箱养殖种类，因此，研究评估石斑鱼群体遗传多样性对今后的石斑鱼渔业资源的合理利用、开发、保护和遗传育种都有着重要的意义。
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图 1 NJ法构建5种石斑鱼的分子进化树
Figure 1. Molecular phylogenetic tree of five species of grouper reconstructed by NJ method in Mega
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图 2 ME法构建5种石斑鱼的分子进化树
Figure 2. Molecular phylogenetic tree of five species of grouper reconstructed by ME method in Mega
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图 3 引物S61在5种石斑鱼中的RAPD带谱电泳图
M. PCR markers；1~6. 鞍带石斑鱼的6个个体；7~12. 驼背鲈的6个个体；13~18. 棕点石斑鱼的6个个体；19~24. 斜带石斑鱼的6个个体；25~30. 鲑点石斑鱼的6个个体；箭头所指谱带分别为鞍带石斑鱼、驼背鲈和棕点石斑鱼(2个)的特异性谱带，从左到右依次为966，867，697，434 bp
Figure 3. RAPD bands generated by primer S61 in five species of grouper
M. molecular size marker (DL1543);1~6. E.lanceolatus; 7~12. C.altivelis; 13~18. E.fuscoguttatus; 19~24. E.coioides; 25~30. E.fario; Arrow species-specific markers in E.lanceolatus, C.altivelis and E.fuscoguttatus (two), respectively, molecular weight from left to right, 966, 867, 697, 434 bp.
表 1 筛选出的19个引物的序列
Table 1 The sequences of selected 19 primers
引物 primer 序列(5′~3′) sequence S61 TTCGAGCCAG S70 TGTCTGGGTG S121 ACGGATCCTG S287 AGAGCCGTCT S321 TCTGTGCCAC S325 GTGCCGTTCA S326 GTGCCGTTCA S327 CCAGGAGGAC S340 ACTTTGGCGG S462 TCGGCACGCA S464 GTGTCTCAGG S468 ACATCGCCCA S469 GTGGTCCGCA S471 AACGCGTCGG S474 CCAGCCGAAC S475 GGAAGCCAAC S477 TGACCCGCCT S478 GGCTTGGCCT S479 GGGAAGGACA 
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表 2 5种石斑鱼的分子遗传分析
Table 2 Molecular genetic analysis among 5 species of grouper
鞍带石斑鱼
E.lanceolatus驼背鲈
C.altivelis棕点石斑鱼
E.fuscoguttatus斜带石斑鱼
E.coioides鲑点石斑鱼
E.fario多态性位点比率(P)/%
polymorphic loci64.23 72.61 60.34 69.97 73.94 平均遗传相似系数(S)
mean genetic similarity index0.8238 0.8110 0.8345 0.8277 0.8064 平均遗传距离(D)
mean genetic distances0.1762 0.1890 0.1655 0.1723 0.1936 平均Nei基因多样性指数(H)
mean Nei′s gene diversity0.1189 0.1364 0.1028 0.1439 0.1648 平均Shannon信息指数(Hi)
Shannon′s information index0.1801 0.1992 0.1530 0.2100， 0.2434
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表 3 5种石斑鱼的Nei′s遗传相似系数和遗传距离值
Table 3 Nei′s genetic identity and genetic distance among 5 species of grouper
鞍带石斑鱼
E.lanceolatus驼背鲈
C.altivelis棕点石斑鱼
E.fuscoguttatus斜带石斑鱼
E.coioides鲑点石斑鱼
E.fario鞍带石斑鱼 - 0.6184 0.5577 0.6188 0.5973 驼背鲈 0.4980 - 0.5930 0.6537 0.6781 棕点石斑鱼 0.6085 0.5517 - 0.6433 0.6045 斜带石斑鱼 0.5103 0.4446 0.4565 - 0.6439 鲑点石斑鱼 0.5315 0.3964 0.5228 0.4691 - 注:对角线以上为Nei′s遗传相似系数，对角线以下为遗传距离
Note:Nei′s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal).
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