RAPD analysis of genetic difference among five species of grouper
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摘要:
运用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技术对鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)、驼背鲈(Cromileptes altivelis)、棕点石斑鱼(E.fuscoguttatus)、斜带石斑鱼(E.coioides)和鲑点石斑鱼(E.fario)的遗传多样性及系统发生进行了研究。从120个RAPD随机引物中筛选出扩增效果好的引物19个，分别用于5种石斑鱼基因组DNA的扩增。结果显示，5种石斑鱼平均多态性位点比率(P)分别为64.23%，72.61%，60.34%，69.97%，73.94%；个体间平均遗传相似系数(S)分别为0.8238，0.8110，0.8345，0.8277，0.8064；平均遗传距离(D)分别为0.1762，0.1890，0.1655，0.1723，0.1936；平均Nei基因多样性指数(H)分别为0.1189，0.1364，0.1028，0.1439，0.1648；平均Shannon信息指数(Hi)分别为0.1801，0.1992，0.1530，0.2100，0.2434。5个种间的遗传距离(Dxy)在0.3964~0.6085之间。
Abstract:Genetic diversity and molecular evolution of five species of grouper, viz.Epinephelus lanceolatus, Cromileptes altivelis, E.fuscoguttatus, E.coioides and E.fario, were detected using RAPD technique. A total 120 random primers were evaluated for the usefulness. And thereinto, 19 random primers were selected according to the effect of PCR of genomic DNA of 5 species of grouper. The results showed as the followings: the polymorphic loci ratio in E.lanceolatus, C.altivelis, E.fuscoguttatus, E.coioides and E.fario (P) were 64.23%, 72.61%, 60.34%, 69.97% and 73.94%, respectively. The mean genetic similarity index of intra-species (S) were 0.8238, 0.8110, 0.8345, 0.8277, 0.8064, respectively, the mean genetic distances of intra-species (D) were 0.1762, 0.1890, 0.1655, 0.1723 and 0.1936, respectively, Nei′s gene diversity (H) were 0.1189, 0.1364, 0.1028, 0.1439 and 0.1648, respectively, and Shannon′s information index (Hi) were 0.1801, 0.1992, 0.1530, 0.2100, 0.2434, respectively. The mean genetic distances of inter-species (Dxy) were between 0.3964~0.6085.
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Keywords:
- RAPD /
- grouper /
- Epinephelus lanceolatus /
- Cromileptes altivelis /
- E.fuscoguttatus /
- E.coioides /
- E.fario
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呼吸代谢是生物能量学研究的重要内容之一，对于评估鱼类在水体生态系统中的作用、物质循环、能量流动以及养殖容量等具有十分重要的意义。而鱼体耗氧率的大小及变化在很大程度上反映其代谢水平的高低及变化规律，因而常作为衡量鱼类能量消耗的一个指标。通过了解耗氧率与各种因素的相互关系及变化规律可以了解鱼体的代谢水平和活动规律等，由此可为鱼类的养殖生产、新品种的培育、移植驯化、养殖水体水质的调控和活体运输等奠定理论基础。有关这方面，国内外学者已做过较多研究[1]。
千年笛鲷(Lutjanus seabe)隶属鲈形目，笛鲷科，笛鲷属，又名川纹笛鲷，分布于红海、印度洋、印度尼西亚、菲律宾、澳洲和我国南海[2]。千年笛鲷体色鲜艳美丽，可食用，可观赏；可活鱼销售，也可冰鲜出售，在其产地国被视为非常高质量的食用鱼。该鱼生长快、病害少、肉质鲜美，深受人们喜爱。笔者对千年笛鲷幼鱼的耗氧率进行测定，旨在为该鱼的增养殖提供科学依据。
1. 材料和方法
1.1 实验地点
实验在广东省深圳市盐田南海水产研究所试验基地进行。
1.2 实验用鱼
实验所用的千年笛鲷幼鱼为南海水产研究所深圳试验基地人工繁殖的鱼苗，体重0.6~22.8 g ·尾-1。实验测定前2 d，从室外网箱移入室内60 L的塑料水槽中暂养，进行充气，投喂人工配合饲料。实验用海水为砂滤海水，盐度为29±1，pH为7.9~8.2。按不同要求，加淡水调制成不同盐度。
1.3 耗氧率测定
耗氧率测定试验在流水条件下进行。利用水位差使水流从贮水箱进入水位稳定器，最后流入用有机玻璃加工制成的密闭呼吸室，流量保持基本稳定，流速控制在150 mL · min-1左右。每个呼吸室各放幼鱼10尾，鱼放入呼吸室后，先让其适应2 h，使之处于自然状态，此后每隔1 h测定一次进、出水的溶氧量和水温。
采用美国YSI-581型测氧仪测定水中的溶氧量，测定前根据备测海水盐度，用WINKLER法校定仪器溶氧标准。每小时内鱼苗的耗氧量为进、出水溶解氧量之差与其单位时间内的流量之积，即：F =(C1－C2) V，式中：F为耗氧量(mg · 尾-1)，C1和C2分别为进、出水溶氧量(μL)，V为水的流量(mL · min-1)。试验结束后，用吸水纸吸干鱼体表水份，用感量0.01 g的电子天平精确称量鱼体重量，即可换算出耗氧率G= (C1－C2) V/BW，式中：G为耗氧率[mg · (kg · h)-1]，C1和C2分别为进、出水溶氧量(μL)，V为水的流量(mL ·min-1)，BW为体重(g · 尾-1)。每次试验均设一空白对照组，每组均同时采3个水样，取其平均值。
试验鱼窒息点的测定，系将鱼密封在水样瓶中，完全排除气泡，当鱼开始死亡、半数死亡和全部死亡时立即测定水样瓶中的溶氧量。
1.4 数据处理
实验数据通过SPSS statistica(Ver. 12.0)统计软件(StatSoft，Inc)进行处理分析，利用方差分析(ANOVA)来检验不同因子对千年笛鲷幼鱼耗氧率影响的显著性，并对各变量进行回归统计分析。
2. 结果
2.1 千年笛鲷幼鱼代谢水平与体重的关系
千年笛鲷幼鱼代谢水平与体重的关系见表 1。在水温27.3~28.5℃条件下，千年笛鲷幼鱼的耗氧量和耗氧率与体重有着密切关系，总体趋势是耗氧量随着鱼的生长而上升，耗氧率随着鱼的生长而下降。若以体重(g)为自变量(X)，每小时耗氧量mg · 尾-1为因变量(Y)，则两者相关关系可分别用幂函数回归方程式Y=1.287X0.110(R=0.881，P < 0.01)，或直线方程式Y=0.756+0.513X(R=0.993，P < 0.01)来表示(图 1)。从相关系数R值来看，直线函数型更能切实地反映实际情况。另一方面，每小时耗氧率mg · kg-1与体重的相关关系也可以用幂函数回归方程式Y=1 246.430X-0.036(R=-0.975，P < 0.01)，或直线方程式Y=1 225.280－31.186X (R=-0.928，P < 0.01)来表示(图 2)。根据相关系数R值的大小，表明幂函数回归方程与实测数据的吻合度更高。
表 1 不同体重千年笛鲷幼鱼的耗氧量及耗氧率Table 1. Oxygen consumption in relation to body weight of fry of L.sebae平均体重/g·尾-1 average body weight 测定尾数number 测定次数replication 每小时耗氧量/mg·(ind·h)-1 oxygen consumption 每小时耗氧率/mg·(kg·h)-1 oxygen consumption 0.611 10 3 0.990 1301.021 0.620 10 3 1.011 1250.122 7.408 10 2 4.141 901.125 7.550 10 2 5.332 880.000 19.902 10 2 10.620 628.401 22.821 10 2 12.691 556.092 ![]()
图 1 千年笛鲷幼鱼体重与每小时耗氧量的关系曲线Figure 1. Relationship between size and oxygen consumption in L.sebae![]()
图 2 千年笛鲷幼鱼体重与每小时耗氧率的关系曲线Figure 2. Relationship between size and oxygen consumption in L.sebae2.2 光照对千年笛鲷幼鱼代谢水平的影响
为了了解千年笛鲷幼鱼的代谢活动与光照的关系，实验先在自然光照条件下测定幼鱼的耗氧率，再用黑布包裹呼吸室，2 h后测定其在遮光条件下的耗氧率。测定结果见表 2。试验结果表明，在不同体重条件下，幼鱼在遮光条件下的耗氧率比在自然光照条件下要低15.362%~31.675%。将实验所获之数值综合进行χ2测验[χ2=∑(a－t)2/t]，结果得：χ2=335.27＞χ0.012，P < 0.01，表明光照对幼鱼的代谢水平具有非常显著的影响。
表 2 光照对千年笛鲷幼鱼耗氧率的影响Table 2. Effect of light exposure on the oxygen consumption of fry of L.sebae光照条件light exposure 平均体重/g·ind-1 average body weight 测定尾数number 每小时耗氧率/mg·(kg·h)-1 oxygen consumption 相对代谢率/% relative metabolic rate 自然光nature light 0.611 10 1301.021 30.953 遮光dark 993.146 自然光nature light 0.620 10 27.621 1250.122 遮光dark 979.719 自然光nature light 7.408 10 901.125 31.420 遮光dark 685.788 自然光nature light 7.550 10 880.000 31.675 遮光dark 668.693 自然光nature light 19.902 10 628.401 19.204 遮光dark 527.192 自然光nature light 22.821 10 556.092 15.362 遮光dark 482.033 $* 相对代谢率 =\frac{\text { 光照代谢率 }- \text { 遮光代谢率 }}{\text { 遮光代谢率 }} \times 100\\* Relative metabolic rate (\%)=\frac{\text { rate in nature light }- \text { rate under dark }}{\text { rate under dark }} \times 100$ 2.3 盐度对千年笛鲷幼鱼代谢水平的影响
在水温29.8~31.8℃的条件下，千年笛鲷幼鱼在不同盐度水环境中的代谢水平测定结果见表 3。从表 3的数据得知，千年笛鲷幼鱼在低盐度水环境下的耗氧率较高，随着水中盐度的增加，其耗氧率逐渐降低(图 3)。
Table 3. Effect of salinity on the oxygen consumption of fry of L.sebae盐度salinity 平均体重/g·ind-1 average body weight 测定尾数number 测定次数replication 每小时耗氧率/mg·(kg·h)-1 oxygen consumption 10 1.927 10 3 863.520 20 1.949 10 3 858.900 30 2.093 10 3 753.510 ![]()
图 3 盐度与千年笛鲷幼鱼耗氧率的关系Figure 3. Oxygen consumption of fry of L.sebae in relation to salinity2.4 饥饿对千年笛鲷幼鱼代谢水平的影响
千年笛鲷幼鱼在不同饥饿状况(2、4、6 d)下的代谢水平测定结果见表 4。从表 4中数据得知，千年笛鲷幼鱼在水温(27.3~28.5℃)等外界条件基本稳定的情况下，随着饥饿程度的增加其耗氧率显著的降低(图 4)。饥饿第2天，耗氧率大幅度下降了54.77%，而到饥饿第4天和第6天，幼鱼的耗氧率仅分别继续下降了11.735%和5.83%。
表 4 饥饿对千年笛鲷幼鱼耗氧率的影响Table 4. Effect of starvation on the oxygen consumption of fry of L.sebae饥饿程度/d starvation 平均体重/g·尾-1 average body weight 测定尾数number 测定次数replication 每小时耗氧率/mg·(kg·h)-1 oxygen consumption 代谢率变化/%* metabolic rate change 正常投喂feeding 1.031 10 4 934.100 2 0.953 10 2 603.538 -54.77 4 0.904 10 2 542.041 -11.35 6 0.861 10 2 512.202 -5.83 * 代谢率变化(%)=[(后2 d耗氧率－前2 d耗氧率)/前2 d耗氧率]×100
* Metabolic rate change (%)=[(rate in later stage－rate in former stage)/ rate in former stage]×100![]()
图 4 饥饿与千年笛鲷幼鱼耗氧率的关系Figure 4. Oxygen consumption of fry of L.sebae in relation to starvation2.5 千年笛鲷幼鱼窒息的临界氧阈
本试验测定了千年笛鲷幼鱼在盐度20和28条件下的窒息点(表 5)。结果表明：在海水盐度较高时，导致幼鱼窒息的临界氧阈值比较高。
表 5 千年笛鲷幼鱼窒息点测定结果Table 5. Suffocation point of fry of L.sebae盐度salinity 测定尾数number 测定次数replication 平均体重/g·尾-1 average body weight 水中溶氧量/mg·L-1 water dissolved oxygen 死亡1尾LT1 半数死亡LT50 全部死亡LT100 20 8 2 1.443 1.84 1.13 0.93 28 8 2 1.739 2.29 2.09 1.17 3. 讨论
耗氧率是动物体内代谢强度的重要指标，它反映了动物体的生理状况，也反映了动物在外界环境条件影响下的生活状况。耗氧率高则代谢水平高，反之亦然[3]。本研究表明，在适温条件下，以整尾鱼计，个体大的千年笛鲷耗氧量比小鱼的大，若按单位体重计算，则小鱼比大鱼有较高的耗氧率。从而表明小鱼代谢旺盛，生长迅速，生理活性高。耗氧量和耗氧率与鱼体重量的这些相关关系，已见于不少文献[4-5]，可以分别用直线回归方程或幂函数回归方程式来表达，为了更好地与实测数据相吻合，应选择相关系数R值较大的理论方程式。
许多研究表明，光照对代谢率有影响，而且在不同的动物中存在差异。光周期的改变能影响鱼的呼吸率，从而使其耗氧量随之发生变化[5-6]。本实验结果显示，千年笛鲷幼鱼在自然光照条件下的代谢明显高于遮光条件下的代谢率，这表明千年笛鲷幼鱼主要在白天取食或进行其他活动。在遮光安静条件下，外界刺激减少，这时千年笛鲷幼鱼的代谢水平接近于基础维持状态。
对尖吻鲈Lates calcarifer、平鲷Rhabdosargus sarba和鲻Mugil cephalus等种类的研究发现，水中含盐量的变化对鱼类的耗氧率有较大的影响，其主要原因可能是由于水中含盐量发生变化时，鱼类要消耗更多的能量来调节其体内的渗透压[5-8]。本实验结果表明，千年笛鲷幼鱼在早期生长阶段，对水环境含盐量的变化反应比较敏感，在低盐度环境下的耗氧率较高，随着水盐度的增加其耗氧率降低。
饥饿对鱼类的代谢水平也有很大的影响。表 4结果表明：千年笛鲷幼鱼的耗氧率随着饥饿程度的增加而降低，这种降低的趋势在幼鱼开始饥饿的前2 d比较明显，随着鱼体饥饿程度的加深而逐渐变得缓和，这可能是鱼类对饥饿的一种适应表现。在种苗生产中，按常规的做法[9]，在鱼苗运输前1 d要停止投喂饵料，以免在运输途中反胃吐食及排出粪便污染包装水，导致鱼苗缺氧死亡。从代谢角度来看，停食会降低鱼苗的耗氧率，可维持包装水中的溶氧水平，有利于鱼苗存活。
鱼类的窒息点具有种间差异，本文对不同盐度下千年笛鲷幼鱼窒息点的测定结果与其它海水鱼类如黄鳍鲷Sparus latus、真鲷Pagrosomus major等的相关研究表明，海水鱼类的窒息点比淡水鱼类要高[4, 10-13]，这可能表明海水鱼类用于维持生命活动的物质消耗相对较多。
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图 1 NJ法构建5种石斑鱼的分子进化树
Figure 1. Molecular phylogenetic tree of five species of grouper reconstructed by NJ method in Mega
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图 2 ME法构建5种石斑鱼的分子进化树
Figure 2. Molecular phylogenetic tree of five species of grouper reconstructed by ME method in Mega
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图 3 引物S61在5种石斑鱼中的RAPD带谱电泳图
M. PCR markers；1~6. 鞍带石斑鱼的6个个体；7~12. 驼背鲈的6个个体；13~18. 棕点石斑鱼的6个个体；19~24. 斜带石斑鱼的6个个体；25~30. 鲑点石斑鱼的6个个体；箭头所指谱带分别为鞍带石斑鱼、驼背鲈和棕点石斑鱼(2个)的特异性谱带，从左到右依次为966，867，697，434 bp
Figure 3. RAPD bands generated by primer S61 in five species of grouper
M. molecular size marker (DL1543);1~6. E.lanceolatus; 7~12. C.altivelis; 13~18. E.fuscoguttatus; 19~24. E.coioides; 25~30. E.fario; Arrow species-specific markers in E.lanceolatus, C.altivelis and E.fuscoguttatus (two), respectively, molecular weight from left to right, 966, 867, 697, 434 bp.
表 1 筛选出的19个引物的序列
Table 1 The sequences of selected 19 primers
引物 primer 序列(5′~3′) sequence S61 TTCGAGCCAG S70 TGTCTGGGTG S121 ACGGATCCTG S287 AGAGCCGTCT S321 TCTGTGCCAC S325 GTGCCGTTCA S326 GTGCCGTTCA S327 CCAGGAGGAC S340 ACTTTGGCGG S462 TCGGCACGCA S464 GTGTCTCAGG S468 ACATCGCCCA S469 GTGGTCCGCA S471 AACGCGTCGG S474 CCAGCCGAAC S475 GGAAGCCAAC S477 TGACCCGCCT S478 GGCTTGGCCT S479 GGGAAGGACA 
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表 2 5种石斑鱼的分子遗传分析
Table 2 Molecular genetic analysis among 5 species of grouper
鞍带石斑鱼
E.lanceolatus驼背鲈
C.altivelis棕点石斑鱼
E.fuscoguttatus斜带石斑鱼
E.coioides鲑点石斑鱼
E.fario多态性位点比率(P)/%
polymorphic loci64.23 72.61 60.34 69.97 73.94 平均遗传相似系数(S)
mean genetic similarity index0.8238 0.8110 0.8345 0.8277 0.8064 平均遗传距离(D)
mean genetic distances0.1762 0.1890 0.1655 0.1723 0.1936 平均Nei基因多样性指数(H)
mean Nei′s gene diversity0.1189 0.1364 0.1028 0.1439 0.1648 平均Shannon信息指数(Hi)
Shannon′s information index0.1801 0.1992 0.1530 0.2100， 0.2434
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表 3 5种石斑鱼的Nei′s遗传相似系数和遗传距离值
Table 3 Nei′s genetic identity and genetic distance among 5 species of grouper
鞍带石斑鱼
E.lanceolatus驼背鲈
C.altivelis棕点石斑鱼
E.fuscoguttatus斜带石斑鱼
E.coioides鲑点石斑鱼
E.fario鞍带石斑鱼 - 0.6184 0.5577 0.6188 0.5973 驼背鲈 0.4980 - 0.5930 0.6537 0.6781 棕点石斑鱼 0.6085 0.5517 - 0.6433 0.6045 斜带石斑鱼 0.5103 0.4446 0.4565 - 0.6439 鲑点石斑鱼 0.5315 0.3964 0.5228 0.4691 - 注:对角线以上为Nei′s遗传相似系数，对角线以下为遗传距离
Note:Nei′s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal).
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