Fermentation technology of probiotic strain D-1
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摘要:
为提高菌体的得率和芽孢转化率, 进行了菌株D-1最佳培养条件参数和培养基优化的研究及测定此条件下的生长曲线。通过研究发酵温度、接种量、培养基初始pH、溶解氧等因素对菌株D-1生长的影响,确定最佳培养条件为:培养温度30℃,培养基初始pH 7.0,接种量5%(相对摇瓶装液量),装液量100 mL/500 mL。在发酵基础培养基成分保持不变的情况下改变氮源、碳源、生长因子、无机盐单因子进行单因子试验,采用L9(3)4正交表设计实验,进行培养基优化,确定最佳培养基配比为玉米淀粉2%,蛋白胨2.5%,NaH2PO4 0.8%,玉米浆1.5%, MgSO4 · 7H2O0.05%,3.08%MnSO4水溶液0.1%。在最佳培养条件下,用最优培养基测定了菌株D-1的生长曲线,并确定了菌株D-1的最佳种龄为18~20 h,生产收获时间为26 h。
Abstract:In order to increase bacteria production and ratio of spore formation, experiments were conducted to obtain the best fermentation condition and media, and to determine the growth curve under the most favourable culture. The most favourable fermantation for strain D-1 was 30℃ in temperature, 6.5~6.8 in initial of media pH, 5% inoculum size, and 100 mL media per 500 mL flask in volume. Suitable culture medium was obtained through testing the single effect of medium elements on growth of D-1, including carbon sources, nitrogen sources, inorganic salt and growth factor.The optimal prescription for D-1 fermentation, as determined by orthogonal testing, was composed of 2% maize starch, 2.5% peptone, 0.8% NaH2PO4, 1.5% maize syrup, 0.05% MgSO4 · 7H2O and 0.1%MnSO4(3.08%). To obtain the best inoculate and culture time, the growth curve of D-1 was determined under the most favourable medium and culture conditions. As determined from the growth curve, the best inoculate time should be 18~20 h, and culture time should be 26 h.
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Keywords:
- probiotic /
- liquid fermentation /
- culture condition /
- culture medium
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珊瑚是热带、亚热带海洋生物,隶属于腔肠动物门珊瑚虫纲,广泛分布于太平洋、印度洋和大西洋。在有珊瑚分布的区域,吸引了各种各样的海洋生物在此栖息,形成了一个庞大的生态系统,成为生物多样性最高的海域。由于珊瑚礁区域海洋生物的多样性极高,早在20世纪70年代,一些先进国家就十分重视珊瑚礁的保护工作。国家海洋局1996年编制的《中国海洋21世纪议程行动计划》,提出“中国南海珊瑚礁生态系恢复及生物多样性保护与管理”规划,说明我国已开始重视对珊瑚礁生态系统的保护、管理和利用工作,以确保珊瑚礁使其处于一个可持续状态。造礁石珊瑚,也称浅水石珊瑚或硬珊瑚,关于广东沿岸造礁石珊瑚的研究,香港[1-9]、惠州大亚湾[10]和湛江灯楼角[11-14]曾有报道,而珠江口海岛造礁石珊瑚的群落结构及分布的研究尚未见过报道。
1. 材料与方法
断面调查采用国际通用的珊瑚礁普查方法(Coral Reefs Check),此法适合普通性质的调查。此法是在调查区域拉一条100 m长的绳作为1个断面,绳子上分为4个线段,1个线段20 m,每段相隔5 m,4个线段其中每段每隔0.5 m作1个标号,整条绳子就有160标号,潜水员潜到海底,记录标号下面所压生物种类或底质类型,并水下录相、拍照及采集珊瑚样品。辅助调查工具是60 t木质渔船一艘,功率为110 kW,和一部带汽油艇尾机的小快艇,功率为29 kW,为了更清楚观察珊瑚分布,配备了水下录相机、水下摄影机和采集珊瑚工具。
线形概率的计算公式为:
$$ \begin{gathered} C=\frac{x}{160} \times 100 \% \\ C a=\frac{\sum\limits_{i=1}^q C_i}{Q} \end{gathered} $$ 式中:C为断面的生物种类或底质类型的线形概率;
x为标号下面所压生物种类或底质类型的数量;
Ca为生物种类或底质类型的平均线形概率;
Ci为i断面的生物种类或底质类型的线形概率;
q为断面数;
Q为总断面数。
2. 结果
2.1 种类组成
佳蓬列岛呈东北西南走向,包括23个岛礁,跨越距离约20 km,可以分为东北部的北尖岛、中部的庙湾岛和西南部的几个小岛屿三个主要组成部份。根据造礁石珊瑚的总体分布情况,整个佳蓬列岛总共设计了12个定量调查线断面,其中庙湾岛6个线断面,北尖岛4个线断面,西南部岛屿2个线断面。本次线断面调查,共采集到造礁石珊瑚8科16种,受调查线断面数量的限制,而实际分布的种类数目应该还要多些,其名录见表 1。在观察线断面调查的水下录相中可得出,在造礁石珊瑚中,霜鹿角珊瑚、盾形陀螺珊瑚、粗糙刺叶珊瑚、十字牡丹珊瑚和扁缩滨珊瑚这5种珊瑚群体较大,密度较高,其线形概率占总线形概率的一半以上,是该区域的优势种。在线断面调查中,也采集到赭色海底柏Melithaea ocracea(Linnaeus)、鳞灯心柳珊瑚Junceella squamata(Pallas)、细如灯心柳珊瑚Scripear gracilis Wright & Studer等8种软珊瑚。另在线断面以外比较深水的地方(水深>20 m),采集到3种非造礁石珊瑚(又称深水石珊瑚),它们是轴生环珊瑚Cyathelia axillaries (Ellis & solander)、小花木珊瑚Dendrophyllia micranthus (Ehrenberg)和华丽筒星珊瑚Tubastrea aurea (Quoy & Gainard)。本次调查,佳蓬列岛造礁石珊瑚的个体,形态各异,大小不等,其中球状和块状的直径一般小于0.5 m;皮壳状的厚度一般小于0.1 m;枝状的枝粗直径一般不超过20 mm,长度一般不超过0.1 m,分叉,总高0.3~0.6 m;扁平扇状的其直径一般是0.3~0.7 m。
表 1 佳蓬列岛造礁石珊瑚组成和分布Table 1. The constitution and distribution of hermatypic corals in Jiapeng Islands种类
species区域 area 北尖岛 庙湾岛 西南部岛屿 鹿角珊瑚科 1.斑星蔷薇珊瑚 Montipora stellata Bernard + + - 2.霜鹿角珊瑚 Acropora pruinosa (Brook) + + + 铁星珊瑚科 3.深室沙珊瑚 Psammocora profundacella Gardiner + + - 菌珊瑚科 4.十字牡丹珊瑚 Pavona decussate (Dana) + + + 滨珊瑚科 5.扁缩滨珊瑚 Porites compressa Dana + + + 6.澄黄滨珊瑚 Porites lutea Milne-Edwards &Haime + + + 7.二异角孔珊瑚 Goniopora duofasciata Thiel - + - 枇杷珊瑚科 8.丛生盔形珊瑚 Galaxea fascicularis (Linnaeus) + + - 蜂巢珊瑚科 9.标准蜂巢珊瑚 Favia speciosa (Dana) + + + 10.秘密角蜂巢珊瑚 Favites abdita (Ellis & Solander) + + - 11.五边角蜂巢珊瑚 Favites pentagona (Esper) - + - 12.锯齿刺星珊瑚 Cyphastrea serailia (Forskal) + + + 13.精巧扁脑珊瑚 Platygyra daedalea (Ellis & Solander) + + + 梳状珊瑚科 14.粗糙刺叶珊瑚 Echinophyllia aspera(Ellis & Solander) + + + 木珊瑚科 15.盾形陀螺珊瑚 Turbinaria peltata (Esper) + + + 16.皱折陀螺珊瑚 Turbinaria mesenterina (Lamarck) + + - 注:+表示有分布,-表示无分布
Note:“+” denotes distribution and “-” denotes non-distribution.2.2 优势种类的分布及主要形态特征
霜鹿角珊瑚分布区域较窄,仅见于我国广东沿岸和日本沿岸海域,该种为伞形枝状群体,生活时顶端白色,基部和分枝为棕褐色;盾形陀螺珊瑚,印度洋至太平洋广布种,我国分布于台湾、海南、北部湾、广东沿岸,该种珊瑚骼薄叶片状,珊瑚杯在叶片状骨骼上不规则突起,生活时为黄褐;粗糙刺叶珊瑚,印度洋至太平洋广布种,我国分布于台湾、海南、广东沿岸,生活时为黄色或绿色;十字牡丹珊瑚,是印度洋至太平洋广布种,我国广泛分布于广东和海南岛沿岸;该种群体由坚硬、强壮的叶片状珊瑚骼组成,叶片竖立,生活时单色为黄绿色、紫色、黄褐色,复色为翠绿色加黄色;扁缩滨珊瑚,分布马纳尔湾,马六甲海峡,贝劳群岛,夏威夷,菲律宾等地,我国广东沿岸及北部湾涠洲岛有分布,该种珊瑚骼乳突节瘤块状,节瘤块升高呈枝状,而分枝相互融合成宽板状,生活时为灰褐色。
2.3 线形概率
线断面调查结果列于表 2,从表 2中可得出,造礁石珊瑚的平均线形概率为48.2%,死的造礁石珊瑚平均线形概率占7.1%,软珊瑚平均线形概率占0.8%,与珊瑚共生的生物主要是海绵、海葵和海藻,其平均线形概率占2.9%。在底质类型中,岩石的平均线形概率为19.8%,碎石的平均线形概率为8.8%,沙的平均线形概率为11.9%,泥的平均线形概率仅为0.5%。可见造礁石珊瑚生长在多石的沙质海底上。在调查的12个线断面中,水深分布范围4~15 m,造礁石珊瑚线形概率分布范围为28%~80%,平均线形概率为48.2%,其中10个断面有死的造礁石珊瑚存在,有死造礁石珊瑚存在的断面,线形概率分布范围为1%~15%,其平均线形概率占7.1%。
表 2 调查断面珊瑚及各类底质的线形概率Table 2. The line probability of corals and sediments in investigation line-transection岛屿
island线断面
line-transection线形概率/% line probability 硬珊瑚 死硬珊瑚 软珊瑚 海绵 海葵 海藻 岩石 碎石 沙 泥 北尖岛 海鳅湾 42 13 16 4 15 蟹旁湾 35 9 2 28 6 20 大凼湾 71 4 1 16 2 6 二凼湾 40 3 2 29 17 9 庙湾岛 翁崖礁湾 39 5 3 38 15 下风湾 54 15 24 2 5 下风湾西南小海湾 51 12 5 2 22 8 水坑湾 80 1 16 3 钳虫尾湾 55 1 1 1 23 16 2 1 东南岸线中间 29 5 2 33 18 13 西南岛屿 湾洲海湾 28 15 2 8 2 19 3 23 平洲海湾 54 8 2 3 2 13 1 17 在线断面调查中,造礁石珊瑚密度最高的是庙湾岛的水坑湾和北尖岛的大凼湾,线形概率分别为80%和71%,其次是钳虫尾湾、下风湾、平洲海湾、下风湾西南小海湾,线形概率在50%以上,海鳅湾和二凼湾,线形概率在40%以上,翁崖礁湾和蟹旁湾,线形概率在30%以上,东南岸线中间和湾洲海湾,线形概率在30%以下。调查线断面造礁石珊瑚的线形概率见图 1。
2.4 空间分布
造礁石珊瑚分布最多的是在庙湾岛,其次是北尖岛,西南面岛屿最少。庙湾岛具有较多海湾,造礁石珊瑚主要分布在西北侧的各个海湾内,如翁崖礁湾、下风湾、下风湾西南小海湾、水坑湾和钳虫尾湾,5个海湾都有较多造礁石珊瑚分布,不仅分布密度高,个体也较大,生势也较好。庙湾岛东南侧海岸开阔,海底坡度较陡,造礁石珊瑚分布带较窄,以零星分布为主,不仅分布密度低,个体也较小,生势也较差。北尖岛具有海鳅湾、蟹旁湾、大凼湾和二凼湾4个海湾,湾内均有较多造礁石珊瑚分布,以大凼湾西侧海岸的分布最为密集,湾外沿岸分布数量很少。西南部几个分散的小岛造礁石珊瑚分布较少,仅发现在平洲岛西北面的小湾里有小范围的珊瑚密集分布,以及湾洲岛西南面的小湾里也有一些珊瑚分布,可能与地形没构成海湾有关。可见,造礁石珊瑚密集区主要分布于海湾内或岛屿的背浪面,也就是海浪和海流较为缓和的地方,其它地方则分布较稀疏。
佳蓬列岛的造礁石珊瑚垂直分带明显。整个佳蓬列岛周围水深浅于20 m都有造礁石珊瑚分布,5 m以浅稀疏分布,5~15 m密集分布,15~20 m只有零星分布,20 m以深,基本无分布。近岛周水深4~7 m以霜鹿角珊瑚为主,其余水深以盾形陀螺珊瑚、粗糙刺叶、十字牡丹珊瑚和扁缩滨珊瑚为主。造成这一分布原因主要是受光照度强弱和该海区环境条件的影响,阳光对造礁石珊瑚来说至关重要,水较深(7 m以下),加上该海区沉积物稍多,透明度不高,光照度就弱,枝状的珊瑚由于受光面积小,不太适应这种环境,因而不发育,分布就小。而叶片状、蕈状、皮壳状等形状的珊瑚,具有较大的受光面积,也就适宜在这一环境生长。当然,对于非造礁石珊瑚而言,其在非常低的光强下也能生存。
本次调查,鹿角珊瑚属只有霜鹿角珊瑚这一种,其它多数为大珊瑚杯型的种类,这与该海区沉积物稍多有关,霜鹿角珊瑚其种类特征是珊瑚杯小,而小珊瑚杯的种类抵抗沉积物和埋藏能力较弱,不适宜有大量沉积物存在的环境下生活。
3. 珊瑚的保护措施
根据多次现场考察、访问渔民和潜水观察,了解到整个佳蓬列岛造礁石珊瑚的总体分布情况,并设计了12个定量调查线断面,其中庙湾岛6个线断面,北尖岛4个线断面,西南部岛屿2个线断面,线断面设置大多位于海湾内,并选择在造礁石珊瑚较丰富的水域,故此,文中所指线形概率一般是指造礁石珊瑚较丰富区域的线形概率。
在12个线断面定量调查中,其中10个线断面有死的造礁石珊瑚存在,死的造礁石珊瑚其平均线形概率占7.1%,造成大量造礁石珊瑚死亡的原因,除了人为毁坏外,在北尖岛正东20km设有二洲海洋倾倒区,有些垃圾运输船舶不按规定末到倾倒区就倾倒垃圾,冬天东北季风盛行,西南流带来垃圾沉积物,使这一区域沉积物增多,大量沉积物积聚覆盖在造礁石珊瑚上面,并使其死亡,本次调查,见到造礁石珊瑚有大量沉积物积聚在上面,这是一个有力的佐证。珊瑚虫在生长过程会分泌碳酸钙,石珊瑚就是珊瑚虫死后骨骼堆积形成的,而珊瑚礁就是长期无数珊瑚虫不断死亡后缓慢生长而成的,有人对南海珊瑚礁上的珊瑚生长速度的进行计算,南海现代的珊瑚生长速度为每年5.5 mm,一座巨大的珊瑚礁体,可能需要几百、几千甚至上万年的积累,因此,珊瑚礁一旦遭受破坏,就难以恢复。造礁石珊瑚分布区栖息各种各样的海洋生物,造礁石珊瑚与藻或其他生物的种内和种间关系,造就了珊瑚礁生物群落极高的生物多样性。总的来说,佳蓬列岛周围的海洋环境不如南海诸岛,珊瑚生长情况较差,还长期遭受人为破坏的影响,至今还有人偷采珊瑚加工出售,潜捕鱼贝时随意凿击和翻动礁块,有的非法电鱼,甚至炸鱼。这些活动对珊瑚生态环境造成直接破坏,为了更好地保护珊瑚,应在其密集分布区域建立珊瑚保护区,并制定相关的保护措施,如禁止拖网和围网作业;禁止炸、电、毒、潜捕等其他破坏珊瑚资源生态环境行为;不准挖沙和抽沙作业;禁止取土石围填海;不准超标工业生活污水和船舶舱底水排出;严厉打击盗采和经销珊瑚活体及其制品的活动。
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表 1 培养温度与菌株D-1的生物量
Table 1 Effect of temperature on growth of strain D-1
温度/℃
temperature25 30 35 40 45 菌体浓度/108 CFU·mL-1
abundance5.6 8.2 10.3 4.7 1.3 表 2 初始pH值与菌株D-1的生物量
Table 2 Effect of initial pH on growth of strain D-1
初始pH值
initial pH5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 菌体浓度/108 CFU·mL-1
abundance4.2 7.8 9.8 11.6 9.2 6.3 表 3 接种量与菌株D-1的生物量
Table 3 Effect of inoculum size on the growth of strain D-1
接种量/%
inoculation size1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 菌体浓度/108 CFU·mL-1
abundance5.2 8.0 10.0 11.6 12.5 12.3 10.8 9.8 9.3 8.4 表 4 装液量与菌株D-1的生物量
Table 4 Effect of dissoved oxygen on the growth of strain D-1
装液量/mL·500 mL-1(三角瓶)
dissoved oxygen50 100 150 200 250 300 菌体浓度/108 CFU·mL-1
abundance10.7 11.2 9.6 8.4 7.5 6.3 表 5 不同碳源与菌株D-1的生物量
Table 5 Effect of carbon sources on growth of strain D-1
碳源
carbon sources葡萄糖
glucose蔗糖
sucrose可溶性淀粉
soluble starch玉米淀粉
maize starch土豆淀粉
potato starch玉米淀粉+葡萄糖
maize starch+ glucose添加量/%
dose added0.5 0.5 2 2 2 2+0.3 菌体浓度/108 CFU·mL-1
abundance3.2 2.7 7.4 7.5 6.3 8.9 表 6 不同氮源与菌株D-1的生物量
Table 6 Effect of nirtrogen sources on the growth of strain D-1
氮源
nirtrogen sources蛋白胨+牛肉膏+酵母膏
peptone+beef extracts+yeast extract牛肉膏
beef extract酵母膏
yeast extract蛋白胨
peptone豆粕粉
D-1fated soybean powder氯化铵
NH4Cl硫酸铵
(NH4)2SO4添加量%
dose added1.0+0.5+0.5 2 2 2 2 2 2 菌体浓度/108
CFU·mL-1 abundance8.8 9.6 7.8 10.5 6.8 0.08 0.06 表 7 玉米浆添加量与菌株D-1的生物量
Table 7 Effect of maize syrup on the growth of strain D-1
添加量/%
dose added0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 菌体浓度/108 CFU·mL-1
abundance5.8 6.6 10.5 12.3 9.8 8.2 7.3 表 8 不同无机盐与菌株D-1的生物量
Table 8 Effect of inorganic salt on the growth of strain D-1
无机盐inorganic salt NaCl K2HPO4 NaH2PO4+Na2HPO4 NaH2PO4+K2HPO4 NaH2PO4 添加量/%
dose added0.5 0.5 0.2+0.2 0.2+0.2 0.5 菌体浓度/108 CFU·mL-1
bacteria4.2 4.1 1.4 0.8 4.6 表 9 正交实验结果分析表
Table 9 The result and statistics analysis of orthogonal experiment
实验编号
no.A
玉米淀粉/%
maize starchB蛋白胨/%
peptoneC
NaH2PO4/%D
玉米浆/%
maize syrup生物量/108 CFU·mL-1
abundance1 1 (1) 1 (1.5) 1 (0.3) 1 (1.5) 4.0 2 1 2 (2.0) 2 (0.5) 2 (2.0) 4.5 3 1 3 (2.5) 3 (0.8) 3 (2.5) 7.4 4 2 (2) 1 2 3 9.3 5 2 2 3 1 13.4 6 2 3 1 2 9.6 7 3 (3) 1 3 2 7.0 8 3 2 1 3 8.9 9 3 3 2 1 10.2 K1 5.3 6.8 7.5 9.2 K2 10.8 8.9 8.0 6.8 K3 8.7 9.1 9.3 8.5 R 5.5 2.3 1.8 2.4 -
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