Comparison of different bacteria growth models on chilled Pseudosciaena crocea
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摘要:
主要研究了养殖大黄鱼0、5℃冷藏过程鱼肉中细菌变化情况，采用修正的Logistic和Gompertz模型拟合细菌生长曲线, 经非线性回归分析求出生长动力学参数和细菌生长预测模型。结果表明，所建立的模型相关系数均大于0.99, 能有效描述菌落总数的动态变化，预测不同贮藏时间内的菌落总数。为验证模型的适用性，把不同时间的菌落总数预测值和实测值比较，依据均方根评价建立的细菌生长预测模型的适用性。0、5℃冷藏过程Gompertz模型均方根分别为0.077和0.100，Logistic模型均方根分别为0.114和0.138，2种模型相比，Gompertz预测结果更为理想。
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关键词:
- 养殖大黄鱼 /
- 冷藏 /
- Gompertz模型 /
- Logistic模型
Abstract:Bacterial changes of fish flesh in cultured Pseudosciaena crocea stored aerobically at 0, 5℃ were mainly analyzed, bacteria growth curves of chilled cultured P.crocea was fitted using modified Logistic and Gompertz equations.Kinetic parameters of bacterial growth and predictive model were developed with nonlinear estimation equations. The results showed that the correlation coefficient of developed models was over 0.99, indicating predictive models make it possible to describe the dynamic changes and predict the bacterial number stored at different time. Difference between predicted values and observed values were compared with root mean squares (RMS) for validating the goodness of predictive models of the bacterial growth. RMS of the Gompertz model were 0.077 and 0.100, and RMS of the Logistic model were 0.114 and 0.138 at 0, 5℃, respectively. Predicted values of the Gompertz were significant compared with the Logistic model.
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Keywords:
- cultured Pseudosciaena crocea /
- cold storage /
- Gompertz model /
- Logistic model
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在研究基因的表达或蛋白质的定位与时序变化时常用荧光物质或报告基因作为标记。传统的荧光标记是通过纯化蛋白质再共价结合到荧光染料上，此方法难以控制化学剂量和染料附着部位，若该标记蛋白用于活细胞内检测，则难以通过细胞膜。因此，该方法已基本淘汰。现在常用的报告基因如荧光素酶(LUX)基因和β-葡萄糖苷酶(GUS)基因也不尽人意, LUX所检测到的荧光产生部位不一定反映荧光素酶基因的特异表达部位；GUS则需要昂贵的反应底物且由于其它因素的干扰，反应颜色的深浅有时不能说明GUS活性的高低或有无。源于水母(Aequorea vic-toria)等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP)可吸收蓝光而后发出绿光[1]，是生物发光现象中能量传递的受体之一，它克服了上述缺陷，具有灵敏度高，操作简便，不需要添加任何底物或辅助因子，不使用同位素，也不需要测定酶的活性等优点，已成为目前最优良的标记基因之一[2]。
1. GFP的生化性质及其发光原理
1.1 GFP的生化性质
源于水母和海笔(Renilla reniformis)的GFP在生化特征、发光光谱性质方面不尽相同，2种GFP的生化、发光光谱及编码序列特征见表 1。
表 1 源于水母和海笔的GFP生化性质，发光光谱及编码序列的比较Table 1. Comparison of biochemical characteristics, emission spectrum and coding sequence of GPF originated from jellyfish (A.victoria) and sea pansy (R.reniformis)水母GFP
jellyfish (A.victoria)海笔GFP
sea pansy (R.reniformis)分子量/kDa
molecular weight≈27 ≈54 结构
structure单体多肽 同二聚体 稳定性
stability稳定(65℃，pH 11, 1%SDS, 6 M盐酸胍等不同的处理荧光不消失) 更稳定 氨基酸残基数
number of amino acid238 未见报道 吸收/激发峰/nm
absorbtion/irradiation peak2个(主395, 次475) 1个(498) 最大发射峰/nm
maximum emission peak508 509 消光系数/mM-cm-
absorbtion coefficient21~30, 7~15 270 量子当量数
quanta equivalent weight0.72~0.85 0.80 编码序号中内含子数
number of introns3 未见报道 cDNA长度/bp
cDNA length962 未见报道 1.2 源于水母的GFP的发光原理
GFP之所以能产生绿色荧光是由于其蛋白分子多肽链内含有特殊的生色基团结构，即第65~67位氨基酸Ser- Tyr-Gly链内环化加氧形成对羟苯甲基咪唑环酮，和周围其它3个氨基酸形成六肽生色团[3]。但上述3个氨基酸残基是如何控制光谱的特征目前还不十分清楚。
体外试验时，当Ca2+与来自水母的发光蛋白质结合时，便可以观察到一种蓝光，这种分子内的反应受一种在结合了Ca2+后转化为荧光素酶蛋白质的催化，产生CO2和蓝色荧光蛋白(BFP)，BFP在反应中也是一种发光体，如果在反应体系中加入GFP，即可以观察到绿光，这一体外模拟试验与水母自然的发光现象一致[4, 5]。总的过程可用下式表示：
1.3 GFP作为标记蛋白的优点
(1) 荧光特性稳定。GFP的荧光非常稳定。只有在过热、过酸、过碱或添加某些变性剂的条件下，GFP才会变性，甚至荧光消失。一旦恢复中性环境，或是除去某些变性剂，荧光就可恢复并具有和原来一致的发射光谱。在很大的pH范围内(7~12.2)GFP的吸收、发射光谱基本相同。(2)检测方便。用荧光显微镜或肉眼就可以观察到，且可进行活体观察，不会损伤正在生长的细胞和组织。(3)无种属特异性，也没有细胞种类和位置的限制。Chalfie等[6]发现GFP cDNA既可以在大肠杆菌E.coli中表达，也可以在真核生物线虫Caenorhabditis elegans中表达。(4)GFP对受体细胞基本无毒害。Sheen等[7]证实在玉米转GFP基因植株中，即使GFP在细胞中的表达量很高时，对细胞也不会产生明显毒害。(5)不受假阳性干扰。由于其他生物本身不含有GFP，因此不会出现假阳性结果，GFP作为分子探针可以代替荧光染料避免由于染料非特异性结合造成的定位不准，使结果真实可靠[8]。(6)无需任何反应底物和辅助因子。(7)可制成永久标本。GFP的荧光可以耐受光漂白，也可耐受福尔马林的固定，因而可制成长期保存的标本。(8)灵敏度高。GFP标记方法比免疫组织化学方法具有更高的灵敏度和分辨率。
2. GFP基因的特征及其遗传改进
2.1 GFP基因的特征
1992年，Prasher等[9]根据GFP的氨基酸序列合成了相应的寡核苷酸片断，以此为探针从水母A.vctorea PBR322-cDNA文库中分离到GFP1 cDNA，以GFP1序列为探针筛选另一噬菌体文库λgt10-cDNA时，得到GFP10, 11, 12, 13共4个GFP重组子。以GFP1 cDNA为探针，从水母A.victorea的基因组文库中筛选到3种GFP克隆。通过对这些阳性克隆限制性酶切和Southen blot分析，发现存在有3种不同的内切酶图谱，这和天然存在3种不同GFP同分异构体的结果相符合。对阳性克隆GFP10的EcoRΙ酶切片段的全序列分析发现：GFP10 cDNA含有965个核苷酸，含有一个编码238个氨基酸的开放阅读框(ORF)。对GFP基因结构进一步研究表明，它由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸残基。
尽管GFP基因作为报告基因或分子探针有许多无可比拟的优点，但野生型GFP发光较弱，其次荧光反应不是酶反应，不能通过添加某些物质来加强信号，且不易对荧光进行定量检测。
2.2 对GFP的遗传改进
针对上述存在的问题，进行了如下改进。
2.2.1 更换GFP生色团氨基酸
由于Tyr66和Gly67很保守，是维持生色团活性所必需的，而Ser65则相对易变，因此可用其它氨基酸来替换Ser。Heim等[10]发现当以Ala, Leu, Cys, Thr取代Ser时，荧光强度增加4~6倍，其中，以Thr取代Ser时，其激发光和发射光波最长分别为490和510 nm，且生色基团的形成速度比野生型快4倍。可以更快地在受体细胞中表达出来，能更好地应用于实验研究。而以Arg, Asn, Asp, Phe和Trp取代Ser时，其荧光强度比野生型弱。Delagrave等[11]对64~69位氨基酸进行随机突变，筛选出了激发波长向红光偏移的突变株(Red-shifted GFP, RSGFP)，最大发射波长490 nm，很容易与野生型GFP区分。因此，利用GFP和RSGFP共表达，再利用不同波长的光激发标记物，可以分析比较同一细胞或组织内不同蛋白质，启动子或其它调控元件的作用情况。
2.2.2 改变碱基成分
Rouwendal等[12]把密码子改为植物偏爱的蛋白表达的密码子，增加G和C的含量，降低A和T的含量，能有效地提高GFP基因在植物受体中的表达效率。
2.2.3 改变GFP基因序列
Pang等[13]在gfp10 cDNA的第404与405位之间插入一个植物内含子，以增强其表达并连接于强启动子之后，通过组织培养得到转基因植株，可明显观测到荧光。同时由于第405~488位为隐蔽型内含子(Cryptic intron)，该段序列转录的mRNA被植物误识别为内含子，从而被错误加工，导致GFP不能正确表达。因此要除去隐蔽型内含子，避免植物细胞的错误剪接[14]。GFP在受体内的表达水平的提高还有赖于寻找到更为通用的转录翻译的增强子和更强的启动子。
3. GFP在转基因中的应用
GFP应用前景很广[15]，可作为转基因动物和部分植物的筛选标记，应用于基因表达与产物定位，用于研究病毒与宿主的关系等等。
转基因动物研究在其问世后短短的十多年时间里已取得了很大的进展，这一技术在农业、医药行业已显示出广阔的应用前景。然而时至今日，转基因动物研究中还存在着一些技术上难以克服的困难，突出地表现在制作转基因动物的效率极低，从而极大地阻碍了这项研究的深入和拓宽。GFP这一选择标志的应用，兴许能为克服这一困难带来一线曙光。
从理论上讲，GFP的应用至少在以下2个方面对转基因动物的研究有所帮助。
3.1 制作转基因动物的前期工作
GFP基因的表达产物极易检测，可以单独构建包含这一报告基因的载体以检查基因构件中调控序列调控能力的强弱以及表达的组织特异性，调控序列调控能力的强弱可通过GFP荧光的强弱来反映。这一作用不能低估，不少报道表明转基因的表达存在着表达过高或太弱的问题。转基因表达水平低固然不是人所希望的，但也不是转基因表达水平越高越好，因为外源基因的表达水平不仅会影响到宿主动物本身的健康，也会影响到转基因产品的质量。
3.2 提高转基因动物的制作效率
可以将待转的目的基因构件与GFP基因串联起来一并整合，由于GFP基因的表达产物在胚胎发育的早期即可检测到，可以只选择那些表达了GFP的胚胎进行移植，这样即可以减少移植胚胎的盲目性。由于GFP基因具有特性稳定、检测方便等优点，所以将GFP应用于转基因动物研究中，可以节约成本，提高效率。
日本的科技工作者在这方面作了一些卓有成效的尝试。Takada等[16]将细胞巨化病毒(CMV)1E增强子，人延伸因子1α启动子(EF-1α，包括5′侧翼区的一部分，完整的外显子1，内含子1及外显子2的一部分，共计1 187 bp)，GFP基因(S65T)以及SV40的早期加尾信号组成的基因构件显微注入383个原核期小鼠胚胎，经过4 d的体外培养，其中148个胚胎发育至囊胚期，应用普通荧光显微镜研究者很简单地在其中59个囊胚期小鼠胚胎中检测到了GFP。用聚焦激光扫描镜(激光波长480 nm)研究者在桑椹胚及孵化囊胚期的小鼠胚胎中均检测到荧光(带通滤波器500~530 nm)。将55个GFP阳性胚胎植入假孕母鼠子宫，获得8只胎鼠和4只活鼠，PCR检测结果表明其中11只属转基因阳性，Southern印迹杂交的结果证实其中8只属真正意义上的转基因鼠。后期的研究工作表明，表达GFP的小鼠生长正常，行为也无明显的异常，携带GFP基因的母鼠与正常小鼠交配后，收集其胚胎并在体外培养，在半数胚胎的4细胞至囊胚期胚胎中均可清晰地检测到GFP。用上述同一基因构件研究者显微注射了389个牛胚胎，43个在体外培养时发育至囊胚，在其中的4个胚胎中检测到了GFP，2个是内细胞团表达了GFP，2个是滋养外胚层细胞表达了GFP，研究者未报道关于牛胚胎移植后的结果。
作为先驱性的研究工作，Wang等[17]将GFP基因与exu基因串联后转入果蝇基因组，结果表明2种基因均得到高水平的表达。这一尝试在研究exu基因的转入活动规律及确定相应蛋白质的位置上获得了满意的结果。
4. GFP用于转基因动物研究时值得考虑的问题
将GFP作为选择标记应用于转基因动物的研究中，为研究工作带来了许多方便。但是，由此而产生的伦理学及社会学等问题，更值得我们思考。
生物学家利用对生命运动规律的认识成果有目的、有预见地改变动物的遗传组成，赋予动物一些新的生产性状以求更好地服务于人类，这种行为能被生物学家接受并受到推崇，然而社会学家、生态学家以及其它领域的人士对以GFP标记的“发绿光”、“发红光”的转基因动物持何种态度值得审慎考虑。
致谢: 福建宁德夏威水产食品有限公司管崇乐、上海水产大学食品学院2004级硕士研究生周彩华等对实验工作给予了帮助和协作，谨此致谢！ -
表 1 0℃冷藏大黄鱼菌落总数
Table 1 Total viable counts of P.crocea stored aerobically at 0℃
lgCFU·g-1 时间/h
time实测值
observed valuesGompertz预测模型predictive model Logistic预测模型predictive model 预测值
predicted values残存值
residual values预测值
predicted values残存值
residual values0 5.20 5.20 0.00 5.21 -0.01 49 5.10 5.20 -0.10 5.24 -0.14 76 5.25 5.21 0.04 5.29 -0.04 123.5 5.34 5.42 -0.08 5.48 -0.14 167 6.05 5.95 0.10 5.89 0.16 214 6.50 6.55 -0.05 6.52 -0.02 262 6.89 6.96 -0.07 6.99 -0.10 286 7.10 7.08 0.02 7.12 -0.02 334 7.34 7.22 0.12 7.23 0.11 383 7.22 7.29 -0.07 7.27 -0.05 409 7.31 7.31 0.00 7.28 0.03 
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表 2 0℃冷藏大黄鱼细菌生长动力学参数
Table 2 Kinetic parameters of bacteria growth on P.crocea stored aerobically at 0℃
参数
parametersN0
(lgCFU·g-1)Nmax
(lgCFU·g-1)μmax(h-1) M(h) Ns
(lgCFU·g-1)货架期/h
shelf lifeGompertz模型model 5.20 7.33 0.013 170.88 7.31 409 Logistic模型model 5.20 7.26 0.024 195.56 注：Ns为感官终点细菌数
Note: Ns denotes population at the time of organoleptic rejection.
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表 3 5℃冷藏大黄鱼菌落总数
Table 3 Total viable counts of P.crocea stored aerobically at 5℃
lgCFU·g-1 时间/h
time实测值
observed valuesGompertz预测模型predictive model Logistic预测模型predictive model 预测值
predicted values残存值
residual values预测值
predicted values残存值
residual values0 5.20 5.20 -0.00 5.22 -0.02 49 5.41 5.21 0.20 5.29 0.12 76 5.24 5.29 -0.05 5.39 -0.15 123.5 5.79 5.82 -0.04 5.81 -0.02 167 6.60 6.50 0.10 6.48 0.18 216 6.90 7.03 -0.14 7.08 -0.18 264 7.40 7.30 0.10 7.30 0.10 291 7.34 7.37 -0.03 7.34 -0.00
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表 4 5℃冷藏大黄鱼细菌生长动力学参数
Table 4 Kinetics parameters of bacteria growth on P.crocea stored aerobically at 5℃
参数
parametersN0
(lgCFU·g-1)Nmax
(lgCFU·g-1)μmax(h-1) M(h) Ns
(lgCFU·g-1)货架期/h shelf life Gompertz模型model 5.20 7.29 0.016 137.17 7.34 291 Logistic模型model 5.20 7.38 0.030 154.99
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表 5 非线性回归方程分析
Table 5 Analysis of nonlinear estimation equation
参数
parameters均方根(RMS)
root mean square相关系数(R)
correlation coefficient0℃ 5℃ 0℃ 5℃ Gompertz模型model 0.077 0.100 0.994 0.993 Logistic模型model 0.138 0.114 0.992 0.995
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