High-performance liquid chromatographic determination of florfenicol in tilapia(Oreochromis niloticus×O.aureus)
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摘要:
建立了罗非鱼(Oreochromis niloticus×O.aureus)血浆、肌肉和肝脏内氟甲砜霉素的高效液相色谱测定方法(HPLC法)。采用内标法和峰高法定量,方法准确,重复性好,灵敏度较高。8、1和0.125 μg·mL-1 3个浓度水平的加标回收率为89.16%~96.13%;对应的批内精密度和批间精密度分别为2.21%~6.55%和2.11%~7.71%。方法检出限为0.03 μg·mL-1。结果表明,此方法非常适合用于罗非鱼体内氟甲砜霉素的动力学和残留研究。
Abstract:A liquid chromatographic (HPLC) method for determination of florfenicol in the plasma, muscle and liver of tilapia (Oreochromis niloticus×O.aureus) was developed. For quantitation, the peak-height measurements and the internal standard were used. The study showed that the linearity and repeatability was good. The method was validated with blank samples fortified at 8, 1 and 0.125 μg·mL-1, the mean recovery was between 89.16% and 96.13%, the coefficient of variation was lower than 7.7%, and the detection limit for flofenicol was 0.03 μg·mL-1. All the results indicate its usefulness for conducting pharmacokinetics and residues studies on tilapia.
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酒糟鱼是中国传统的特色淡水鱼风味食品,原料为新鲜淡水鱼,经漂洗、腌制、干制后,以白糖、酒糟、白酒等浸渍发酵而成,具有酒味醇厚,香味浓郁等特点。传统方法生产酒糟鱼一般需1~2个月,往往以作坊式生产,受自然条件的影响较大,产品品质和卫生状况都难以控制[1-3]。目前国内外对酒糟鱼的研究主要集中在营养价值[4]、糟制方法[5]、糟制过程中微生物的生长[6]等方面,对如何缩短酒糟鱼生产周期方面的研究报道还较少见到。缩短酒糟鱼生产周期,提高生产效率,控制产品品质,是酒糟鱼工业化发展的重要因素。
真空渗透是一种高效的食品加工方法,其原理是利用由压差引起的流体动力学机理和松弛现象[7]来达到缩短腌渍时间的目的。真空渗透能提高产品的品质,如改善冷贮藏芒果粒的硬度和质构[8]、鹅肉肌肉的嫩度[9]、火腿的品质[10]、猪肉的嫩度[11]及牛肉干的色泽和可接受性[12],此外,对改善皮蛋的品质[13]有一定的作用。基于真空渗透技术的诸多优点,将真空渗透技术与酒糟鱼加工技术相结合,提高酒糟鱼腌制发酵速率,对促进酒糟鱼工业化发展具有重大意义。该研究以罗非鱼(Oreochromis mossambicus)为原料,将真空渗透应用到酒糟鱼加工中,研究糟制温度、真空度、时间对酒糟罗非鱼生产效率和品质的影响,优化糟制工艺参数,确立酒糟鱼真空糟制工艺,缩短酒糟鱼生产周期,为酒糟鱼高效快速的工业化生产和品质控制提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
鲜活罗非鱼、糯米、白酒、料酒、食盐、复合香辛料、蔗糖、味精、酒曲均购于广州市海珠区华润万家超市;甲醛、氢氧化钠、硝酸银、浓硫酸等均为分析纯,购于广州齐云公司。
1.2 仪器与设备
809 Titrando自动电位滴定仪(瑞士Metrohm);DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司);DZF6050真空干燥箱(上海精宏);电子分析天平;紫外分光光度计(上海美谱达);凯氏定氮仪(瑞典FOSS公司);UItra Turrax T25B型均质机(德国IKA工业设备公司)。
1.3 实验方法
水分的测定采用恒温常压直接干燥[14];盐分的测定采用SC/T 3011—2001[15]电位滴定法;氨基态氮和总酸的测定采用中性甲醛[16]电位滴定法;粗蛋白的测定采用凯氏定氮法[17];总糖含量的测定采用GBT 9695.31—2008[18]分光光度法。鱼肉增重率η=(m2-m1)/m1,其中m1为糟制前鱼肉的质量,m2为糟制后鱼肉的质量。在不同条件下糟制好的鱼块经过一定温度和时间干燥制成成品,感官评定小组由10名经过感官评定培训的成员组成,对产品的色泽、滋味、口感、香味等4个方面进行评价,总分为100分,参考谭汝成等[5]得到感官评定标准(表 1)。
表 1 酒槽鱼感官评定标准Table 1. Sensory evaluation standards of wine-lees fish类别class 评分标准evaluation standard 分值score 滋味taste 甜咸适中滋味和谐酒味醇厚无酸涩味 26~30 甜咸味重滋味较柔和酒味较醇厚无酸涩味 20~25 甜咸轻或重酒味较淡回味短或有酸涩味 10~19 酒味不明显回味短 0~9 香味fragrance 酒香味突出纯正浓郁腊香味浓郁无异味 19~25 酒香味突出柔和腊香味明显异味轻 12~18 酒香味轻,腊香味明显异味轻 6~11 无酒香味腊香味不足有明显异味 0~5 色泽colour 表皮呈黄褐色均匀一致光泽好 16~20 表皮黄褐色光泽好 11~15 表皮呈黄色不均匀光泽差 6~10 表皮和肉均呈深褐色或无光泽 0~5 口感texture 咀嚼性好口感柔和 19~25 咬劲过大口感较好 12~18 咬劲不足或口感粗糙 6~11 软烂或有纤维感 0~5 1.4 样品制备
样品制备工艺流程:原料预处理→盐腌→预干制→糟制→低温冷风干燥→杀菌→真空包装→冷藏。
1.4.1 米酒制作
糯米于清水中浸泡15 h,常压下蒸制40 min,取出后立即用约30 ℃的冷开水冲淋使饭粒分离,并降至28 ℃,转移至清洁的玻璃容器中,加入适量酒曲。其中,m(米饭) : m(酒曲)=250 : 1。将酒曲的60%与米饭拌匀,搭窝,然后将其余酒曲撒在米饭表面和窝内,加盖后于28 ℃恒温培养箱中发酵48 h。
1.4.2 原料前处理
原料经去鳞、去内脏、去头后沿着脊椎骨取背部肉片,切成8 cm×4 cm×1.5 cm的鱼段,漂洗后沥干表面水分。将鱼以m(鱼) : V(水)=1 : 2的比例于4 ℃、15%的盐水中分别腌制4 h、7 h、10 h、13 h、16 h和20 h后,沥干表面水分。
1.4.3 预干制
将腌制好的鱼片放于50 ℃的烘箱中干燥至鱼块水分质量分数分别为75%、65%、50%、40%和30%。
1.4.4 糟制
将干燥后的鱼段按鱼糟质量体积比1 : 2的比例放于洁净的容器中,放于一定温度(5 ℃、15 ℃和25 ℃)和真空度(0 MPa、0.05 MPa和0.095 MPa)的真空干燥箱中糟制12 h,再恢复常压糟制12 h,如此反复2 d、4 d、6 d、8 d和12 d。
1.5 数据处理
每次实验设3个平行,取平均值。数据采用Excel 2010软件进行统计分析。
2. 结果与分析
2.1 腌制时间的确定
食盐腌制过程包括了两个传质过程,1)盐从溶液进入食品结构内(鱼肌肉中),2)鱼肉中的水流出来[19]。腌制时间过短,产品风味不佳,反之产品口感较差。因此,腌制时间决定产品品质[20]。该实验在张群飞等[21]的研究基础上将沥干后的罗非鱼块于4 ℃条件下分别腌制4 h、7 h、10 h、13 h、16 h、20 h,再经50 ℃、7 h热风干燥,0.095 MPa、20 ℃、6 d间歇真空糟制制得成品。
根据感官评价和含盐量确定最佳的腌制时间,结果分别见图 1和表 2。盐腌13 h时所得产品感官评分值最高且产品风味较好(图 1)。鱼肉中含盐量约为4.71%(表 2),综合以上实验结果选择盐腌时间13 h。
表 2 腌制时间对酒糟鱼含盐量的影响Table 2. Effects of curing time on the salt content of fish腌制时间/h curing time 4 7 10 13 16 20 w(盐)/% salt content 1.98±0.20a 2.53±0.16b 4.27±0.18c 4.71±0.22d 6.16±0.20e 6.42±0.12e 注:同行不同上标字母表示具有显著差异(P<0.05)
Note: Different superscripts within the same line indicate significant difference.2.2 预干制工艺的确定
鱼块的糟醉速率可能与糟醉初始水分含量相关。该研究通过控制鱼块糟醉初始水分质量分数,达到提高糟醉速率的目的。将腌制后的鱼块分别在30 ℃、50 ℃和70 ℃的条件下热风干燥,每隔一定时间取样测水分质量分数,再经一定的糟制工艺制成成品。图 2显示的是不同热风干燥温度下罗非鱼块水分质量分数的变化。结果表明随着干燥时间的延长,鱼段水分质量分数逐渐下降,且温度越高,达到相同水分质量分数所需的时间越短。鱼肉在50 ℃温度条件下水分质量分数降到50%所需的时间与30 ℃相比缩短了13 h,在70 ℃温度条件下的热风干燥时间比50 ℃缩短了约5 h。考虑到鱼肉干燥速率与鱼肉品质,热风干燥温度选50 ℃较合适。
表 3是不同热风干燥温度对鱼肉色泽的影响。温度一定时,随着干燥时间的延长,明亮度(L*)逐渐降低,红绿色值(a*)和黄蓝色值(b*)逐渐增大,表明鱼肉的亮度随着干燥时间的延长逐渐降低,鱼肉的色泽逐渐变深。这是由于热风干燥过程中鱼肉发生美拉德反应,产生棕色物质[22-24],干燥时间越久,棕色物质积累越多[25]。除此之外,鱼肉在70 ℃干燥时,亮度降低情况较50 ℃和30 ℃明显,15 h后色泽较深(表 3),且在高温下,鱼肉表面容易出现较明显的收缩干结现象[26],不利于糟液渗入鱼肉内部,从而影响到制品的糟制效率。
表 3 干燥温度对鱼块色泽的影响Table 3. Effect of dry temperature on colour of fish温度/℃ temperature 时间/h time 明亮度L* light 红绿色值a* red 黄蓝色值b* yellow 30 2 92.56±0.51a -5.21±0.44a 4.14±1.02a 5 90.05±0.74a -4.96±0.65a 6.83±0.97b 10 83.72±0.95b -3.67±0.38b 9.51±0.59c 15 79.53±0.32c -2.78±0.34c 11.63±0.37d 25 66.79±0.47d 1.03±0.83d 14.19±1.26e 50 2 81.36±0.98a -2.92±0.48a 11.55±1.17a 5 77.29±0.36b -2.46±0.53b 14.21±1.46b 10 73.48±0.28c -1.10±0.72c 19.75±0.84c 15 68.23±0.77d 0.61±0.61d 21.03±0.21d 25 62.97±0.86e 2.39±0.35e 29.40±0.79e 70 2 72.21±0.31a -2.04±0.58a 20.15±1.16a 5 67.52±0.46b -0.58±0.55b 25.24±1.43b 10 60.15±0.39c 3.30±0.70c 28.99±0.89c 15 56.60±0.59d 5.24±0.49d 31.91±0.78d 25 49.31±0.80e 8.69±0.33e 37.73±1.27e 注:同列不同上标字母表示具有显著性差异(P<0.05),后表同此
Note: Different superscripts within the same row indicate significant difference.The same case in the following tables.表 4为鱼肉水分质量分数对糟制过程的影响。根据预干制干燥曲线,取不同含水量鱼肉,按糟制工艺进行糟制,根据感官评价及糟制增重率确定预干制终点水分质量分数。结果显示随着鱼肉水分质量分数的升高,鱼肉糟制后的增重率呈现先上升后下降的趋势,且糟制后鱼肉的口感、滋味、香味等感官评价值也呈现先上升后下降的趋势,由于较干鱼肉在糟制时易吸收米糟中的糟醉液,但过干的鱼肉收缩干结,在鱼肉表面形成一层硬壳,阻碍糟醉液渗入鱼肉内部,从而影响糟醉增重率和制品的口感。水分质量分数为约50%时制得的酒糟鱼产品感官评价值与干基增重率最高。综合以上分析,选定酒糟罗非鱼预干制终点鱼肉水分质量分数为50%,热风干燥温度为50 ℃,干燥时间为11 h。
表 4 鱼块水分质量分数对糟制过程的影响Table 4. Effect of moisture content of fish on wine-lees pickling processingw(水分)/%
moisture content糟制增重率/%
rate of wine lees pickling滋味
taste香味
fragrance色泽
colour口感
texture总分
total point75 5.73±1.63a 26±3.02a 19±2.88a 16±1.13a 19±3.22a 80 65 18.92±1.08b 26±2.99a 20±3.61a 18±2.76a 20±1.79a 84 50 40.70±1.49c 28±4.24a 22±1.79a 18±2.09a 23±2.89b 91 40 33.59±2.43d 20±2.56b 14±2.54b 15±3.17a 17±3.04a 66 30 24.11±1.32e 9±1.06c 11±2.10c 6±1.01b 12±2.96c 38 2.3 真空糟制工艺研究
酒糟鱼为发酵类产品,其风味物质与酒糟中乳酸菌、酵母菌等微生物的生长代谢有关。真空糟制可提供无氧环境,有利于乳酸菌[27]和酵母菌等兼性厌氧型微生物的生长,同时抑制杂菌的生长繁殖。真空糟制的主要影响因素有温度、真空度和糟制时间。糟醉液中氨基态氮、总糖含量较高且富含有机酸。因此以酒糟鱼中总糖、氨基态氮、盐含量、水分含量、总酸为指标,分别考察糟制温度、真空度和糟制时间对各项指标与产品品质的影响。
2.3.1 真空度对酒糟鱼品质的影响
由渗透理论可知,一般情况下,真空度与渗透速率呈正相关。表 5的结果显示:鱼肉中氨基态氮、总酸、总糖含量随着糟制真空度的增加而上升,盐含量随着真空度的增加呈现降低趋势,而真空度对鱼肉水分含量没有太大的影响。这是因为鱼肉在真空作用下产生一定程度的膨胀,鱼肉细胞间距增大[28],真空度越大,细胞间距越大,糟醉液更易进入鱼肉内部,提高糟醉速率。同时鱼肉较高浓度的盐分也会扩散到糟醉液中。在真空度为0.095 MPa时鱼肉的总糖、总酸和氨基态氮值优于常压和0.05 MPa,因此,真空糟制工艺真空度选择为0.095 MPa。
表 5 真空度对酒糟鱼品质的影响Table 5. Effects of vacuum degree on the quality of drunk fish真空度/MPa
vacuum degreew(总糖)/μg·g-1
total sugarw(盐)/%
salt contentw(总酸)/mg·g-1
total acidw(氨基态氮)/g·kg-1
amino acid nitrogenw(水分)/%
moisture content0 34.71±0.34a 5.86±0.74a 26.11±0.41a 0.92±0.08a 63.62±1.22a 0.05 57.91±0.52b 5.50±0.63a 28.83±0.32b 0.78±0.09b 63.20±2.17a 0.095 71.80±0.48c 4.61±0.69b 31.34±0.62c 0.96±0.11a 63.06±1.69a 2.3.2 真空糟制时间对酒糟鱼品质的影响
表 6为糟制过程中酒糟鱼感官品质的变化。结果表明,随着糟制时间的延长,酒糟鱼滋味、色泽、香味、口感等各项评分都显著提高,在糟制第6天时评分最高。这是因为随着糟制时间的延长,鱼肉中的食盐会渗透入糟醉液中,糟醉液中的风味物质和有机酸、氨基酸等物质会渗入鱼肉内部,鱼肉的咸味会由偏咸到适宜,酒糟鱼的滋味、香味等也会显著提升。酒糟鱼由于总糖含量的增加,再经过一定的干燥处理,会使酒糟鱼出现较诱人的色泽[29]和香味,有助于提升感官评价得分。此后,糟制时间继续延长,感官评分值降低,酒糟鱼出现酸涩苦味,可能是过度发酵的原因。此外,酒糟鱼中总糖含量过高时,酒糟鱼的色泽过深,从而影响感官评价值。
表 6 糟制时间对酒糟鱼感官评价的影响Table 6. Effect of vacuum wine lees pickling time on sensory evaluation of drunk fish糟制时间/d
wine lees pickling time滋味
taste香味
fragrance色泽
colour口感
texture总分
total point2 9±3.03a 11±2.98a 9±2.93a 16±1.73a 45 4 19±2.07b 19±1.99b 11±1.76a 19±2.63ac 68 6 28±3.46c 21±2.75bc 19±2.06b 24±3.06b 92 8 26±2.69c 23±1.77c 20±3.17b 21±2.45c 90 12 17±3.11b 13±2.08a 5±2.81c 11±1.86d 46 表 7为糟制过程中酒糟鱼品质变化。结果表明,在糟制过程中,酒糟鱼的成分出现了显著变化,这与以上分析结果即真空渗透能有效提高糟制速率相符。其中真空糟制6 d酒糟鱼品质和真空糟制8 d的相似,而真空糟制12 d总酸含量较高。考虑到糟制效率与产品的感官品质和营养成分,确定真空糟制时间为6 d。与传统糟制30 d~40 d[5]相比,糟制时间缩短了约4/5。
表 7 糟制时间对酒糟鱼品质的影响Table 7. Effect of vacuum wine lees pickling time on quality of drunk fish糟制时间/d
wine lees pickling timew(总糖)/μg·g-1
total sugarw(氨基态氮)/g·kg-1
amino acid nitrogenw(总酸)/mg·g-1
total acidw(盐)/%
salt contentw(水分)/%
moisture content2 71.80±0.48a 0.96±0.11a 31.34±0.62a 4.61±0.69a 63.06±1.69a 4 205.10±0.74b 1.58±0.11b 73.49±0.94b 3.15±0.40b 63.89±0.72a 6 596.93±1.63c 1.98±0.15c 123.95±0.53c 2.99±0.54c 65.22±1.26b 8 667.14±1.73d 2.16±0.14c 129.06±0.64c 2.06±0.68d 66.18±1.47c 12 752.58±1.57e 3.28±0.10d 291.75±0.76d 1.03±0.92e 69.56±0.98d 2.3.3 真空糟制温度对酒糟鱼品质的影响
表 8为糟制温度对酒糟鱼品质的影响。结果显示,糟制温度与酒糟鱼的品质呈正相关,即随着糟制温度的升高,酒糟鱼肉中氨基态氮、总酸、总糖含量逐渐增高,而鱼肉水分含量和盐含量没有显著变化。在一定温度范围内,随着温度的升高,酵母菌和乳酸菌等优势菌的生长代谢旺盛[30],对酒糟鱼的发酵成熟起到促进作用。根据渗透方程,环境温度越高时,物质的震动速率增高,酒糟鱼的渗透速率增高,酒糟鱼产品的品质好。由以上分析,酒糟鱼真空糟制温度选用25 ℃可以得到品质较高的酒糟鱼产品。
表 8 糟制温度对酒糟鱼品质的影响Table 8. Effects of vacuum wine lees pickling temperature on quality of drunk fish温度/℃
temperaturew(总糖)/μg·g-1
total sugarw(盐)/%
salt contentw(总酸)/mg·g-1
total acidw(氨基态氮)/g·kg-1
amino acid nitrogenw(水分)/%
moisture content5 52.94±0.45a 5.01±0.96a 30.70±0.34a 0.94±0.12a 65.07±1.16a 15 60.08±0.57b 5.40±0.71a 33.85±0.76a 0.96±0.11a 63.51±0.63b 25 71.80±0.37c 4.61±0.69b 31.34±0.62a 0.96±0.11a 63.06±1.69b 综合以上分析,真空糟制温度为25 ℃,真空糟制时间为6 d,真空度为0.095 MPa时,制得的酒糟鱼品质优于传统工艺[28]且糟制效率提高了约5倍。
3. 结论
该研究综合分析了酒糟罗非鱼盐腌时间、预干制温度与时间以及真空糟制工艺对酒糟鱼成品品质的影响。发现罗非鱼鱼块在4 ℃、15%盐水条件下盐腌13 h,酒糟鱼成品咸度适宜;罗非鱼鱼块盐腌之后,在50 ℃热风干燥11 h,鱼块预干制终点水分在50%时,酒糟鱼感官评价得分较高,色泽较好;真空糟制温度25 ℃、糟制时间6 d,真空度0.095 MPa时制得的酒糟鱼品质较佳。通过真空渗透技术能够有效地提高酒糟鱼生产效率,成功避免了因长时间浸泡导致的鱼肉糜烂等问题,为酒糟鱼的工业化生产提供理论依据。
致谢: 林钦研究员对本研究给予了亲切指导,戴明、王学峰、赵汉取和马延强提供了很多帮助,在此一并感谢。 -
表 1 血浆、肌肉和肝脏样品工作曲线
Table 1 The calibration curves for florfenicol in plasma, muscle and liver samples
样品
sample线性范围/μg·mL-1
concentration range标准曲线回归方程
calibration equation相关系数
R血浆 plasma 0.03~16 C血=2.729 H-0.06 0.9998 肌肉 muscle 0.03~16 C肌=2.939 H-0.1121 0.9995 肝脏 liver 0.03~16 C肝=2.8336 H-0.1326 0.9986 表 2 不同组织样品在3个浓度水平的平均回收率(平均值±标准差%)
Table 2 The recovery of florfenicol in the plasma, muscle and liver samples of tilapia
浓度/μg·mL-1
concentration血浆
plasma肌肉
muscle肝脏
liver0.125 94.79±2.81 91.70±5.41 89.52±4.32 1 96.13±2.35 96.09±1.91 89.17±3.97 8 92.86±1.22 92.72±2.59 89.16±3.71 表 3 不同组织样品中药物在3个浓度水平的批内精密度(RSD%)
Table 3 The intra-batch precision of a liquid chromatographic method to determine florfenicol in the plasma, muscle and liver samples of tilapia
浓度/μg·mL-1
concentration血浆
plasma肌肉
muscle肝脏
liver0.125 3.75 6.45 5.61 1 2.21 3.07 6.55 8 2.37 2.65 4.71 表 4 不同组织样品中药物在3个浓度水平的批间精密度(RSD %)
Table 4 The inter-batch precision of florfenicol in the plasma, muscle and liver samples of tilapia
浓度/μg·mL-1
concentration血浆
plasma肌肉
muscle肝脏
liver0.125 6.27 6.26 2.92 1 2.11 4.39 7.71 8 2.39 4.46 3.72 表 5 工作标准液中氟甲砜霉素的稳定性
Table 5 Stability of florfenicol in the working standard solutions(0~5℃)
浓度/μg·mL-1
concentration变化率/% change percent 第2天 第46天 第48天 8 1.3 1.2 1.2 1 1.0 1.9 0.5 0.125 1.5 表 6 罗非鱼样品中氟甲砜霉素的稳定性
Table 6 Stability of florfenicol in the plasma, muscle and liver samples fortified at nominal concentrations of 1 μg·mL-1 florfenicol
样品
sample浓度/μg·mL-1 concentration 变化率/%
change percent第2天 第11天 血浆 1.006 1.020 1.4 肌肉 1.049 1.107 5.8 肝脏 1.056 1.064 0.8 -
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