对虾池塘养殖系统是一种高密度、集约化的“人工营养型”养殖生态系统。传统的“高放养密度，高投饵量，高换水率”对虾养殖模式，易造成虾塘生态环境恶化，有毒有害物质增加，还易滋生病原菌、病毒，这些除影响对虾类生长，使养殖病害发生频繁，经济损失惨重外，还会对邻近海域生态环境造成不良影响^[1-4]。为预防虾病发生，在养殖过程中，消毒剂和抗生素的大规模施用所带来的危害，如破坏虾塘中的自然微生态平衡、抗药病原生物的产生，对虾药残超标等问题也越来越受到人们的关注。

有益微生物作为一种生态调节剂，对降解和转化养殖过程中产生的有机污染，改善养殖生态环境有显著效果，还能起到抑制病原菌生长繁殖，促进对虾生长的作用，同时又因其具有使用成本低、收效大和无再次污染等优点，现已广泛应用于对虾无公害养殖中^[5-12]。

目前，国内外有关对虾养殖过程中虾塘细菌动态变化的研究有较多报道^[13-17]，但对于有益微生物的应用对虾塘中细菌的动态变化影响研究的报道则较少见^[18-19]。本文根据2001年5~7月对深圳市东部水产公司对虾养殖基地，半封闭式斑节对虾精养模式下，对虾养成过程虾塘水体和沉积物中细菌数量变化情况的调查资料，对比研究分析了施用有益微生物对虾塘中细菌数量动态变化的影响，旨在为探讨海水对虾池塘养殖中如何进一步提高有益微生物的施用效果，更好调控养殖生态环境，尤其是对有害菌的控制提供参考依据。

1.   材料和方法

1.1   实验地点

实验在位于大亚湾大鹏澳南部的深圳市东部水产公司53.5 hm²(800亩)对虾养殖基地进行，选择3、4和5号面积均约1.33 hm²(20亩)的虾塘进行实验研究，其中3和4号虾塘作为实验组，5号虾塘为对照组。该对虾养殖基地采用的是半封闭式对虾精养模式，养殖前，蓄水池于高潮时一次性从邻近的大鹏澳海域纳潮蓄水，作为以后整个养殖过程中的水源。

1.2   养殖管理

实验虾塘和对照虾塘除施用有益微生物不同外，其它的养殖管理措施均相同。斑节对虾Penae-us monodom虾苗投放时间均为2001年5月3日，放苗量为5×10⁵ind · hm^-2，放苗后10 d内不投饵，虾苗以虾塘中的基础生物性饵料为食。10 d后开始投喂人工配合饲料，早、晚各1次; 17 d后，每天分早、中、下午和晚上共投喂4次，投喂量均根据饵料台检查情况决定。每天巡池，观察水色变化和虾的活动情况。养殖前期30 d内，少量添水，最后水深约160 cm左右。之后，采取不间断方式逐渐加大虾塘换水量，每口虾塘安置3台水车式增氧机，视需要进行间歇性增氧，并根据需要投放水质改良剂(如沸石粉、熟石灰)和光合细菌，每隔约15 d，用ClO₂消毒剂对虾塘进行全池泼洒消毒。

1.3   实验方案

2001年4月29日开始在实验虾塘施用有益微生物粉剂——加强型“利生素”^①, 之后每隔约15 d施用1次，到养殖结束共施用了7次。每次的施用量均约为1.5 mg · L^-1(虾塘中的浓度)，且均在用ClO₂消毒剂进行全池泼洒消毒处理后5~7 d进行。对照实验虾塘中不施用有益微生物。

① 中国水产科学研究院南海水产研究所研制并生产，以芽孢杆菌属为主的复合粉状有益微生物制剂，有益活菌含量2×10⁹CFU · g^-1。

1.4   采样和分析方法

每次采样调查于虾塘消毒处理前1~3 d进行，每次间隔约15 d，按《海洋监测规范》^[20]规定的操作方法，在每口虾塘的进水口和出水口附近采表层水混合样，在进水口附近采表层沉积物样品(图 1)。所采样品立即带回实验室处理，分别涂布普通海水培养基2216E(5 g蛋白胨、1 g酵母粉、0.1 g磷酸高铁、1 000 mL陈海水)和弧菌选择性培养基TCBS(广东微生物研究所生产)平板，28℃下培养7 d后计数。

图  1  采样点示意图(●采样点)

Figure  1.  Sketch map of sampling sites(●sampling site)

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1.5   数据处理

用Excel 2003中的数据分析工具，对实验组与对照组虾塘中的细菌数量差异显著性进行成对双样本均值t-检验，P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有极显著性差异。

2.   结果和讨论

2.1   水体中总异养细菌和弧菌数量变化特征

2.1.1   异养细菌

整个实验过程中，3口虾塘水体中的总异养细菌数量基本呈单峰型的变化特征(图 2)，即在养殖前期均处于相对较低水平，一般在15×10⁴CFU · mL^-1以下，之后均开始有明显上升趋势，3、4和5号虾塘水体中的总异养细菌数量分别达到58×10⁴、77×10⁴和81×10⁴CFU · mL^-1的最高值，直至养殖将结束时才略有下降。不同之处在于，对照组虾塘水体中的总异养细菌数量的上升变化趋势较实验组有明显提前。

图  2  虾塘水体中总异养菌数量变化

Figure  2.  Density variation of heterotrophic bacteria in the water column

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把对虾养殖过程分为前期(5月)、中期(6月)和后期(7月)3个阶段(表 1)，则可发现，在养殖前期，实验组与对照组水体中的总异养细菌数量没有明显差异; 养殖中、后期实验组间3和4号虾塘的相差也不大，而对照组5号虾塘水体中的总异养细菌数量明显高于对照组。3口虾塘间水体中总异养细菌数量成对双样本t-检验分析表明，实验组成3和4号虾塘间并没有明显差异(P=0.165>0.05)，4号虾塘与对照组5号虾塘间的差异也不明显(P=0.608>0.05)，而3号虾塘的则显著低于5号虾塘(P=0.026＜0.05)。由此可见，有益微生物的应用，对虾塘水体中总异养细菌数量，尤其是在养殖的中、后期有明显的抑制作用。

表  1  对虾养殖各阶段虾塘水体总异养细菌平均数量

Table  1.  Average density of heterotrophic bacteria in the water column at different culture stages  ×10⁴CFU · mL^-1

养殖阶段 aquaculture phase	虾塘号  pond no.
	3	4	5
前期 prophase	7.2	22.2	10.2
中期  middle phase	10.0	11.7	31.7
后期  final phase	46.3	64.7	71.0

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2.1.2   弧菌

3口虾塘水体弧菌数量变化特征也基本相同。在养殖前半阶段，各虾塘水体中的弧菌数量均处在较低水平，约在11×10²CFU · mL^-1以下; 之后弧菌数量均开始急剧上升，其中对照组5号虾塘水体中弧菌数量上升幅度最大，最高值达150×10²CFU · mL^-1，已经超过了致使对虾发病的弧菌数量临界值100×10²CFU · mL^{-1 [21]}，而对照组3和4号虾塘上升幅度明显较小，最高值分别为54×10²和30×10²CFU · mL^-1(图 3)。

图  3  虾塘水体中总弧菌数量变化

Figure  3.  Density variation of vibrio in the water column

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成对双样本t-检验分析结果显示，3、4和5号虾塘间水体中弧菌数量均无显著差异(P>0.05)。但从对虾养殖各阶段虾塘水体中弧菌数量变化情况看，尤其是养殖后期，5号虾塘水体中弧菌数量明显高于3和4号虾塘(表 2)。可见，有益微生物的施用，对虾塘水体弧菌数量，尤其是在对虾养殖后期还是有一定的抑制作用。

表  2  对虾养殖各阶段虾塘水体总弧菌平均数量

Table  2.  Average numbers of vibrio in the water column at different culture stages ×10²CFU · mL^-1

养殖阶段 aquaculture phase	虾塘号  pond no.
	3	4	5
前期  prophase	1.8	2.3	5.0
中期  middle phase	2.9	5.8	8.8
后期  final phase	39.0	24.0	97.7

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2.2   表层沉积物中总异养细菌和弧菌数量变化特征

2.2.1   异养细菌

实验过程中各虾塘表层沉积物中总异养细菌数量变化的差异较大。实验组3和4号虾塘的变化特征虽均呈双峰型，但3号虾塘是在养殖前期和养殖将结束时，分别出现了12×10⁶和14×10⁶CFU · g^-1的峰值，而4号虾塘的峰值出现在养殖中期和养殖将结束时，其峰值分别为19×10⁶和9.5×10⁶CFU · g^-1; 对照组5号虾塘的变化特征呈单峰型，即在养殖前半段不断上升，达到12×10⁶CFU · g^-1的峰值，之后又不断下降(图 4)。

图  4  虾塘表层沉积物中总异养菌数量变化

Figure  4.  Density variation of heterotrophic bacteria in the sediment

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表层沉积物中总异养细菌数量成对双样本t-检验分析结果显示，3号虾塘分别与4和5号虾塘都没有显著差异(P=0.178>0.05，P=0.708>0.05)，而4号虾塘反而显著高于5号虾塘(P=0.014＜0.05)。总体来看，在斑节对虾养殖各阶段，对照组与实验组表层沉积物中总异养细菌数量水平差异不大(表 3)。可见，有益微生物的施用对虾塘表层沉积物中总异养细菌数量变化没有明显影响。

表  3  对虾养殖各阶段虾塘表层沉积物中总异养细菌平均数量

Table  3.  Average numbers of heterotrophic bacteria in the sediment at different culture stages  ×10⁶CFU · g^-1

养殖阶段 aquaculture phase	虾塘号 pond no.
	3	4	5
前期  prophase	6.4	7.3	4.6
中期 middle phase	4.9	16.0	10.0
后期  final phase	7.0	9.7	2.3

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2.2.2   弧菌

各虾塘表层沉积物中弧菌的数量变化特征与总细菌数量变化相似。实验组3和4号虾塘的变化特征均呈双峰型，在养殖前期，3号虾塘最高值达97×10³CFU · g^-1，之后弧菌数量开始下降，养殖中期降至最低值后又开始明显回升，到养殖将结束时，上升至72×10³CFU · g^-1的最高值; 而4号虾塘的峰值出现在养殖中期和养殖将结束时，其峰值分别为72×10³和150×10³CFU · g^-1。对照组5号虾塘的弧菌数量也呈单峰型的变化特征，即在养殖前期逐渐升高，到养殖中期达到50×10³CFU · g^-1，之后又逐渐下降(图 5)。

图  5  虾塘表层沉积物中弧菌数量变化

Figure  5.  Variation of heterotrophic bacteria in the sediment

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表层沉积物中弧菌数量成对双样本t-检验分析结果均显示，3与4号虾塘(P=0.381>0.05)，5号虾塘分别与3和4号虾塘(P=0.512>0.05，P=0.239>0.05)均无显著差异。总体上看，在斑节对虾养殖前、中期，3口虾塘间表层沉积物中弧菌数量水平均无明显差异，在养殖后期，反而实验组之3和4号虾塘表层沉积物中的弧菌数量均明显高于对照组5号虾塘(表 4)。可见，有益微生物的施用对虾塘表层沉积物中弧菌数量变化也没有明显影响。

表  4  对虾养殖各阶段虾塘表层沉积物中弧菌平均数量

Table  4.  Average numbers of vibrio in the sediment at different culture stages ×10³CFU · g^-1

养殖阶段 aquaculture phase	虾塘号 pond no.
	3	4	5
前期  prophase	48.6	16.0	20.0
中期  middle phase	4.5	36.0	36.0
后期 final phase	38.7	90.0	8.3

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本实验所用“利生素”是以芽孢杆菌属为主的复合粉状有益微生物制剂，有研究表明芽孢杆菌可以通过分泌代谢产物，如胞外抗菌蛋白^[22]，以及竞争营养^[23]等方式抑制其它细菌的生长。本实验结果表明，施用有益微生物的对于抑制虾塘表层沉积物中异养细菌和弧菌数量的增加不如对水体中的效果明显，这可能与养殖过程中，有益微生物制剂——“利生素”的施用方式有一定关系。本实验中，利生素采用加水稀释再全池泼洒的施用方式，因此，有益微生物主要在接种到水体中，从而可通过分泌代谢产物和竞争营养的方式达到抑制水体中其它细菌群的作用。然而，进入沉积环境中的有益微生物数量较少，对其它细菌群的抑制能力也相对有限。如能改进有益微生物的施用方式，使有益微生物能较好地进入到沉积环境中，则可以进一步提高有益微生物对沉积环境中细菌群的抑制效果。

3.   小结

(1)对虾养成过程中，实验组与对照组虾塘水体中总异养细菌和弧菌数量的变化特征基本相似，在养殖前期，总异养细菌和弧菌数量均较稳定，并处于相对较低的水平，养殖中、后期水体中总异养细菌和弧菌数量均急剧升高，其中对照组5号虾塘升幅最大，其弧菌数量甚至超过了致使对虾发病的弧菌数量临界值100×10²CFU · mL^-1。

(2) 总体看来，2个实验组虾塘表层沉积物中总异养细菌和弧菌数量均表现为双峰型的变化特征，峰值一般出现在养殖前期或中期和养殖将结束时; 而对照组虾塘则呈单峰型，峰值均出现在养殖中期。实验组与对照组之间表层沉积物中总异养细菌和弧菌数量差异则不明显。

(3) 有益微生物技术的应用对虾塘水体中总异养细菌和弧菌数量增加的抑制效果较对沉积环境中的效果明显，这可能与有益微生物制剂——“利生素”采用加水稀释再全池泼洒的施用方式，使得进入水体中有益微生物数量明显多于进入沉积物有关。因此，要进一步提高对虾养殖过程中有益微生物的应用效果，在异养细菌和弧菌数量易于剧增的养殖中、后期，增加利生素的施用量，研制和配合使用沉降性较好的有益微生物制剂，将大大提高对水体和沉积环境中总异养细菌，尤其是弧菌的生长的抑制效果，进一步降低虾病发生风险。