卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)属鲈形目(Perciformes)，鲹科(Carangidae)，鲳鲹亚科(Trachinotinae)，鲳鲹属(Trachinotus)，俗称黄腊鲳、短鳍鲳鲹、金鲳、红三、红沙等。卵形鲳鲹是暖水性鱼类，该鱼肉无刺，肉质细嫩，味鲜美，体色艳丽，具有鲹类的特殊香味，历来被列为名贵食用鱼类^[1]。近年来，卵形鲳鲹的人工养殖在华南各沿海地区迅速开展，目前已成为海水网箱养殖鱼类的主要品种之一，产生了良好的经济效益和社会效益。目前，国内对卵形鲳鲹的研究主要集中在繁殖生物学、人工育苗、网箱养殖和病害防治等方面。近几年有关鱼类同工酶的报道较多^[2-6]，而对卵形鲳鲹生化遗传方面的研究尚未见报道。此文采用聚丙烯酰胺垂直板梯度凝胶电泳对卵形鲳鲹的6种组织的5种同工酶进行了研究，探讨其同工酶系统的遗传基础，为卵形鲳鲹的遗传多样性分析和品种改良提供有价值的生化遗传指标。

1.   材料和方法

卵形鲳鲹为网箱养殖鱼类。取回实验室后马上进行解剖，取肌肉、肝脏、脾脏、肾脏、心脏、脑等6种组织。各组织、器官先用0.8%生理盐水冲洗干净，取适量称重，放在小培养皿中，下面垫上冰袋，用消毒后的剪刀适当剪碎，小心拨入玻璃匀浆器的玻璃管中，然后把玻璃管竖直插入冰水混合物中以样品: 缓冲液=1 : 3的比例混合匀浆。匀浆0.5 h后，4℃、13 000 r · min^-1离心30 min，然后取上清液，按需分量装小管中置于-70℃冰箱中备用。此实验采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝胶电泳法。浓缩胶的浓度均使用4%，缓冲液是tris-HCl(pH 6.7)溶液。梯度胶的浓度和缓冲系统见表 1。用移液枪进行点样，每个点样孔加25 μL样品。电泳是在4℃冰箱中进行，电泳缓冲液使用tris-Gly缓冲液，pH 8.3。染色方法参考《同工酶技术及其应用》^[7]、《电泳》^[8]和《蛋白质电泳实验技术》^[9]。酶的命名参考SHAKLEE等^[10]推荐的方法，以同工酶缩写名称的大写代表酶蛋白，小写代表编码基因。若该酶有1个以上座位编码，各座位按其编码酶从阴极到阳极的迁移顺序命名为1、2、3……。

表  1  用于分析卵形鲳鲹的同工酶名称、编号，缓冲系统和凝胶浓度

Table  1.  The name, serial number, buffer system and gel concentration for analyzing the isozyme of T.ovatus

酶的名称 name of enzyme	编号 serial number	缓冲系统 buffer system	梯度胶/% gel concentration
酯酶(EST)	3.1.1.1	TVB	4~28
乳酸脱氢酶(LDH)	1.1.1.27	TC	4~15
苹果酸脱氢酶(MDH)	1.1.1.37	TC	4~7.5
苹果酸酶(ME)	1.1.1.40	TC	4~7.5
天门冬氨酸氨基转移酶(AST)	2.6.1.1	TC	4~15
注：TC. Tris-柠檬酸(pH 7.0)；TVB. Tris-硼酸-EDTA(pH 8.4) Note：TC. Tris-citric acid(pH 7.0)；TVB. Tris-boric acid-EDTA(pH 8.4)

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2.   结果与分析

2.1   酯酶(EST，EC 3.1.1.1)

卵形鲳鲹不同组织的EST电泳图谱见图 1。卵形鲳鲹的EST同工酶由2个位点Est-1和Est-2控制，其在组织中的表达有明显的组织特异性，肌肉、脾脏、心脏和脑组织中记录1个位点，在肌肉和脾脏中表达微弱，在心脏和脑表达明显；肝脏和肾脏中2个位点都有表达，且表达明显。

图  1  卵形鲳鲹不同组织的EST电泳图谱

M. 肌肉；L. 肝脏；S. 脾脏；K. 肾脏；H. 心脏；B. 脑

Figure  1.  Electrophoretogram of EST in various tissues of T.ovatus

M. muscle; L. liver; S. spleen; K. kidney; H. heart; B. brain

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2.2   乳酸脱氢酶(LDH，EC 1.1.1.27)

不同组织的LDH酶谱见图 2。记录到的LDH由3个基因座位编码，分别记为Ldh-1、Ldh-2、Ldh-3。组织差异性表现在脾脏没有记录到LDH，心脏和脑记录到Ldh-1的表达，肌肉记录到Ldh-3，肾脏记录到Ldh-1、Ldh-2和Ldh-3的表达。LDH的活性在各个组织中也存在差异，肌肉和心脏的活性最强，脑和肾脏次之，肝脏和脾脏最低。

图  2  卵形鲳鲹不同组织的LDH电泳图谱

. 肌肉；L. 肝脏；S. 脾脏；K. 肾脏；H. 心脏；B. 脑

Figure  2.  Electrophoretogram of LDH in various tissues of T.ovatus

M. muscle; L. liver; S. spleen; K. kidney; H. heart; B. brain

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2.3   苹果酸脱氢酶(MDH，EC 1.1.1.37)

不同组织的MDH见图 3。卵形鲳鲹的MDH分为2个区，由2个位点编码。Mdh-1表达为MDH1和MDH2 2条酶带，Mdh-2表达为MDH3 1条酶带。各组织的LDH具有一定的组织差异性，肝脏的活性最强，而且可以观察到3条酶带；心脏的活性次之，可以观察到MDH1和MDH3；脾脏可以检测到MDH2和MDH3；肌肉、脾脏和脑的活性较低，可以检测到MDH1和MDH3。

图  3  卵形鲳鲹不同组织的MDH电泳图谱

M. 肌肉；L. 肝脏；S. 脾脏；K. 肾脏；H. 心脏；B. 脑

Figure  3.  Electrophoretogram of MDH in various tissues of T.ovatus

M. muscle; L. liver; S. spleen; K. kidney; H. heart; B. brain

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2.4   苹果酸酶(ME，EC 1.1.1.40)

不同组织的ME见图 4。卵形鲳鲹的ME同工酶只检测到1条酶带，由1个基因座位编码。肝脏的活性最强，脾脏、肾脏和心脏次之，肌肉和脑组织没有检测到ME。

图  4  卵形鲳鲹不同组织的ME电泳图谱

M. 肌肉；L. 肝脏；S. 脾脏；K. 肾脏；H. 心脏；B. 脑

Figure  4.  Electrophoretogram of ME in various tissues of T.ovatus

M. muscle; L. liver; S. spleen; K. kidney; H. heart; B. brain

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2.5   天门冬氨酸氨基转移酶(AST，EC 2.6.1.1)

不同组织的AST同工酶见图 5。卵形鲳鲹的AST记录到3条酶带，由2个基因座位编码。在肝脏中的活性最强，肾脏次之，其它的几种组织没有检测到AST。

图  5  卵形鲳鲹不同组织的AST电泳图谱

M. 肌肉；L. 肝脏；S. 脾脏；K. 肾脏；H. 心脏；B. 脑

Figure  5.  Electrophoretogram of AST in various tissues of T.ovatus

M. muscle; L. liver; S. spleen; K. kidney; H. heart; B. brain

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3.   讨论

3.1   卵形鲳鲹同工酶的表达具有明显的组织特异性

5种同工酶在卵形鲳鲹不同组织中表达的座位数、异聚体形成的能力及活性的强弱都有差异。EST同工酶在肝脏和肾脏表达了2个座位，其它的4种组织只表达了1个座位。LDH同工酶在肾脏表达了3个座位，在肌肉、肝脏、心脏和脑都只表达了1个座位，而在脾脏中没有表达。MDH同工酶在6种组织中都检测到2个座位，但每个座位的表达产物并不一样，酶活性强弱也不一样。ME同工酶在肝脏、脾脏、肾脏和心脏中都检测到1个座位，在肌肉和脑中没有发现ME。AST在肝脏和肾脏检测到2个基因座位，其它4种组织没有发现。

上述结果分析表明，卵形鲳鲹不同组织同工酶表达有明显的组织特异性，其酶谱特征在不同组织中均有差异，尤其是肝脏、肾脏中的EST、MDH和肾脏中LDH的表达式样明显不同于其它组织。鱼类同工酶组织特异性的存在是机体在特定环境下适应生存条件及组织分化并特异性执行各自功能的结果。例如EST属于水解酶类，能催化酯键水解，对于酯类代谢和生物膜的结构与功能具有一定的作用，因此，卵形鲳鲹的EST在肝、肾中表达较明显。LDH是参与糖酵解的关键性酶，LDH3催化乳酸形成，在卵形鲳鲹肌肉等厌氧代谢组织中活性强，是对嫌气组织无氧酵解特性的适应；LDH1与乳酸利用有关，在卵形鲳鲹心、肾、脑等的好气组织中占优势。MDH是糖代谢三羧酸循环过程中最重要的酶，在细胞中的功能主要是使苹果酸脱氢酶参与糖酵解的有氧代谢，因此，在卵形鲳鲹的肝脏、肌肉和心脏表达强烈。

卵形鲳鲹同工酶组织特异性，表现在以下几个方面：

(1) 位点的表达。某些位点的同工酶仅限于某种组织特有，在其它组织中，该同工酶不表达或活性太低而检测不出。如Est-2仅在肝脏和肾脏中表达，Ldh-2仅在肾脏中表达。

(2) 位点表达的程度即酶活性的强弱。一方面，同一位点在不同组织中的相对含量或表达的数量差别很大，如Est-1在肝脏和肾脏中的表达很强，Ldh-3在肌肉中的表达很强，而这些位点在其它组织中表达较弱；另一方面，不同位点在不同组织中相对活性不同，如肌肉中Mdh-1较Mdh-2编码的酶活性强，而在脑组织中恰好相反。这些差异也是和所在组织和器官的功能密切相关的。酯酶除了维持细胞正常的能量代谢外，还能水解大量非生理存在的酯类化合物，认为可能与机体的解毒作用密切相关，EST2只在肝脏和肾脏中出现且活性较强，因而有可能参与解毒功能，而肝脏是机体的重要解毒器官。Mdh-1是线粒体型，Mdh-2是上清液型，卵形鲳鲹脑组织中Mdh-1活性较弱可能说明脑细胞线粒体有氧代谢不发达。

(3) 等位基因表达上的差异。由于复等位基因的存在，不同的组织中会有不同的等位基因表达，结果同一位点上的酶谱表型在不同组织中有明显差异，或有时等位基因编码的亚基不一定完全表达或不能通过电泳鉴定其产物，即存在“哑等位基因”或“无效基因”。结果也导致不同组织中同一位点的酶谱表型出现差异，如Mdh-1在肝脏中表达为MDH1和MDH2，在肾脏中表达为MDH2，在其它的4种组织中表达为MDH1，MDH是二聚体酶，在肝脏有2条酶带，其它5种组织只有1条酶带，可能存在哑等位基因。

3.2   卵形鲳鲹同工酶组织特异性与功能的相关性

不同组织同工酶活性的差异是同工酶组织特异性的一种表现，这种差异与其组织的生理功能相关。

EST属于水解酶类，能催化酯键水解，对于酯类代谢和生物膜的结构与功能具有一定作用。在硬骨鱼类中EST一般认为是单体或二聚体，由多个位点编码，多态现象非常普遍，EST酶谱非常复杂^[11-13]。对卵形鲳鲹各组织的EST电泳分析可知，它的酶谱比较简单，总共只有3条酶带，其中在肝脏的活性高于其它组织，这可能与肝脏的解毒等作用有关^[14]。

LDH是参与糖酵解的关键性酶，催化丙酮酸与乳酸间的相互转化，在肌肉和心脏组织中活性高，可在有氧状态下，催化乳酸转化为丙酮酸而进入三羧酸循环，通过有氧氧化呼吸从而获得较多的生物能量来保证其收缩功能的正常进行^[15]。卵形鲳鲹LDH3催化乳酸形成，在肌肉等厌氧代谢组织中活性强，是对嫌气组织无氧酵解特性的适应；LDH1与乳酸利用有关，在心、肾、脑等的好气组织中占优势^[16]。

MDH、ME是生物氧化的重要酶类，主要催化苹果酸与丙酮酸、草酰乙酸之间的相互转化，这些酶的大量存在，利于将物质经三羧酸循环转化为能量以供肌肉收缩所需。在细胞中的功能主要是使苹果酸脱氢参与糖酵解后的有氧代谢^[17]。因此，MDH在心脏、肝脏和肾脏等有氧代谢旺盛的组织中染色较深。卵形鲳鲹的MDH含量非常丰富，特别是在肝脏中，这说明肝脏的有氧代谢很旺盛。

AST是一种磷酸吡哆醛蛋白质，也可以作用于L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。AST的活性器官是肝，它的活性可作为鱼肝、肾功能破坏的检测指标之一^[18]。在卵形鲳鲹中，肝脏和肾脏可检测出AST，其中在肝脏中的含量比较丰富。