鲸目(Cetacea)是海洋哺乳类的重要类群，包括须鲸亚目(Mysticeti，baleen whales)和齿鲸亚目(Odontoceti，toothed whales)，共报道有81种(须鲸亚目11种，齿鲸亚目70种)^[1]。其中齿鲸亚目包括海豚总科(Delphinoidea)、抹香鲸总科(Physeteroidea)、喙鲸总科(Ziphioidea)和淡水豚总科(Platanistoidea)。海豚科(Delphinidae)属于海豚总科，通称海豚(dolphins)。海豚可驯养成为观赏动物，以及用于军事目的，被列为国家一、二级重点保护野生动物。随着我国沿海经济的高速发展，沿岸海域和近海海域生态环境逐渐恶化，水生生物资源不断衰退，沿岸和近海小型鲸豚类的栖息环境已受到威胁。因此，开展海洋鲸豚类的遗传背景研究是海洋生物多样性研究和珍稀濒危动物保护的重要措施。

国外学者对鲸类的分子进化进行了大量研究，许多研究表明鲸目与有蹄类尤其偶蹄目之间有较近的亲缘关系^[2-4]，并支持鲸类是单系起源^[5-6]，但对鲸目不同类群(须鲸类、抹香鲸类及其他齿鲸类)之间的分子系统发生关系仍存在争议。一些学者认为齿鲸亚目是单系类群^[7-8]，与形态分类一致，但另一些学者认为齿鲸亚目不是单系类群^[9-11]，须鲸类与齿鲸类没有直接亲缘关系^[12]。国内杨光等^[13-15]、刘珊等^[16]、YAN等^[17]对淡水豚类分子系统发生进行了研究，杨光等^[18-19]、夏军红等^[20]研究了中国水域江豚种群遗传变异和遗传结构。在海水鲸类方面，WANG等^[21]、季国庆等^[22]对我国水域瓶鼻海豚(Tursiops sp.)线粒体DNA控制区序列进行了分析，发现存在2个类群。王加连等^[23]对中国水域真海豚(Delphinus sp.)线粒体DNA的控制区和cyt b序列进行了分析，认为中国水域的真海豚在分类上应归属于长喙真海豚(D.capensis)。杨光等^[24]对5科12种齿鲸的c-mos序列分析发现该序列对解决科以上分类关系有用，而不能很好地区分科以下(不含科)分类关系。尽管海豚游泳生活范围很大，但不同海域的海豚是否是同一种群尚未有报道，所以, 比较在中国出现的海豚与数据库中其他地方的海豚的亲缘关系是非常重要的。线粒体16S rRNA基因序列变异较大，其序列特征分析及其应用方面已有大量报道^[25-28]。但海豚科种类的16S rRNA研究主要是国外的实验材料，国内尚未有海豚类的16S rRNA序列报道。因此，本文对我国广东海域出现的瓶鼻海豚(Tursiops truncatus)、中华白海豚(Sousa chinensis)和糙齿海豚(Steno bredanensis)的16S rRNA基因片段序列进行分析，丰富我国海豚的DNA序列数据，并与38种鲸豚类的同源序列进行比对和分子系统树重建，探讨我国海豚与国外种类的亲缘关系，为进一步开展海豚的种质资源评价、种类鉴定和遗传多样性保护提供基础资料。

1.   材料和方法

1.1   海豚样品

研究所用的瓶鼻海豚、中华白海豚和糙齿海豚分别采于深圳蛇口渔港、珠江口伶仃洋中、北部和深圳小梅沙，均为搁浅死亡海豚。样品数分别为2、2、1头。取肌肉样品保存于95%工业酒精中备用。

1.2   基因组DNA的提取

DNA的提取按郭奕惠等^[29]和王小玉等^[30]的方法。分别取约20 mg肌肉组织，用纯水洗2次后，放入1.5 mL离心管内，先加入100 μL TEN9细胞裂解缓冲液(50 mmol·L^-1 Tris·HCl，pH 9.0；100 mmol·L^-1 EDTA；200 mmol·L^-1 NaCl)，剪碎，再分别加入400 μL TEN9裂解液、150 μL SDS(10%)和10 μL蛋白酶K(10 mg·mL^-1)，混匀后于56℃消化至溶液澄清。分别用等体积饱和酚、酚: 氯仿: 异戊醇(25:24:1)、氯仿: 异戊醇(24: 1)抽提，直至无蛋白中间相，取上清液，加入2倍体积无水乙醇和1/10体积3 M NaAc(pH 5.2)，于-20℃沉淀2 h以上，12 000 rmp·min^-1室温离心10 min，70%乙醇洗涤2次，室温自然干燥后加入100 μL去离子超纯水溶解。提取的基因组DNA用1%琼脂糖凝胶电泳、EB染色观察，再用Biometra紫外分光光度计测定OD_260nm和OD_280nm，以检测抽提DNA的质量和计算DNA浓度，然后配成浓度为20 ng·μL^-1的DNA溶液放于4℃保存备用。

1.3   PCR扩增和序列测序

所用16S rRNA基因引物序列为16SAR: 5′-CGC CTG TTT A (ATC) (CT) AAA AAC AT-3′和16SBR: 5′-CCG GTC TGA ACT CAG (AC) TC A(CT) G T-3′^[31]。由上海生工公司(Sangon)合成。PCR反应在Biometra DNA扩增仪上进行。反应体系为20 μL，包括2 μL PCR buffer (10×)，2 μL dNTP (2 mmol·L^-1)，1.2 μL Mg²⁺ (25 mmol ·L^-1)，10 μmol·L^-1的引物各0.5 μL，0.2 μL TaqDNA聚合酶(5 u·μL^-1)，1 μL DNA(20 ng ·μL^-1)，其余为纯水。反应条件为94℃变性5 min，然后40个循环，每个循环包括94℃变性45 s，45℃退火1 min，72℃延伸1 min，最后72℃延伸7 min。取5 μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增的目的片段送往上海联合基因公司测序。

1.4   数据分析

将测序得到的DNA序列用Clustal X软件^[32]先进行种内序列比对，再同GenBank中的瓶鼻海豚、中华白海豚、糙齿海豚以及鲸类30个属38个种(表 1)的同源序列进行比对分析，用MEGA3软件^[33]计算其变异位点、简约信息位点、单突变子和碱基组成，然后以野猪(Sus scrofa)(AF107224)和山羊(Capra hircus)(M55541)2种偶蹄动物作外群，根据Kimura双参数模型用MEGA3构建NJ(Neighbor-joining)系统树，并采用Bootstrap 1 000次重复检验系统树的置信度。

表  1  样品种类、GenBank序列号和碱基组成

Table  1.  Species, GenBank accession numbers and base composition of samples

科名 family	属名 genus	种名/数量 species/nos.	序列长度/bp length	GenBank序列号 Accession number	碱基组成  base composition				GC含量/% GC
					A	T	C	G
海豚科 Delphinidae	宽吻海豚属 Tursiops	瓶鼻海豚 T.truncates(4)	481	DQ839318* AY770538 U13123 Z18663	32.1	26.2	20.2	21.5	41.7
	白海豚属 Sousa	中华白海豚 S.chinensis(2)	481	AY770539	32.2	26.2	20.2	21.4	41.6
	糙齿海豚属 Steno	糙齿海豚(2) S.bredanensis	481	DQ839319* AF334508	31.8	25.5	21.1	21.6	42.7
	真海豚属 Delphinus	真海豚 D.delphis(2)	481	U13106 Z18637	32.4	26.2	20.2	21.2	41.4
	斑纹海豚属 Lagenorhynchus	暗色斑纹海豚 L.obscurus(2)	481	U13114 Z18649	32.2	26.4	20.2	21.2	41.4
		白喙斑纹海豚 L.albirostris(2)	481	U13113 AJ554061	32.5	25.8	20.9	20.8	41.7
	露脊海豚属 Lissodelphis	南露脊海豚 L.peronii(1)	481	U13115	32.0	26.4	20.2	21.4	41.6
		北露脊海豚 L.borealis(1)	481	AF334504	32.4	26.4	20.2	21.0	21.2
	喙头海豚属 Cephalorhynchu	黑喙头海豚 C.eutropia(2)	481	U13105 Z18635	32.2	26.2	20.4	21.2	41.6
	原海豚属 Stenella	蓝白原海豚(1) S.coeruleoalba	481	AJ010816	32.2	26.6	19.8	21.4	41.2
	土库海豚属 Sotalia	土库海豚 S.fluviatilis(1)	481	AF304061	32.2	26.2	20.6	21.0	41.6
	领航鲸属 Globicephala	长鳍领航鲸 G.melaena(1)	481	U13109	32.4	25.4	21.0	21.2	42.2
	伪虎鲸属 Pseudorca	伪虎鲸 P.crassidens(1)	481	AF334506	32.2	25.6	20.8	21.4	42.2
抹香鲸科 Physeteridae	抹香鲸属 Phuseter	抹香鲸 P.catodon(2)	482	U13119 Z18665	32.0	24.1	23.2	20.7	43.9
鼠海豚科 Phocoenidae	鼠海豚属 Phocoena	鼠海豚 P.phocoena(2)	482, 483	U13121 AJ554063	31.4	26.9	19.7	21.9	41.6
		棘鳍鼠海豚(1) P.spinipinnis	480	U13122	32.3	26.7	19.8	21.3	41.1
	江豚属 Neophocaena	江豚(1) N.phocaenoides	482	AF334503	31.3	26.8	20.1	21.8	41.9
一角鲸科 Monodontidae	一角鲸属 Monodon	一角鲸(2) M.monoceros	481	AF334502 AJ554062	31.8	26.2	20.6	21.4	42.0
	白鲸属 Delphinapterus	白鲸 D.leucas(2)	481, 480	AF334501 U13107	31.6	25.8	21.0	21.5	42.5
小抹香鲸科 Kogiidae	小抹香鲸属 Kogia	小抹香鲸 K.breviceps(2)	480，481	U13111 Z18643	31.6	24.5	22.5	21.3	43.8
		拟小抹香鲸 K.simus(1)	480	AF334490	31.5	24.6	22.3	21.7	44.0
喙鲸科 Ziphiidae	柯氏喙鲸属 Ziphius	剑吻鲸 Z.cavirostris(1)	482	U13124	31.3	25.9	21.0	21.8	42.8
	喙鲸属 Berardius	贝氏喙鲸 B.bairdii(1)	482	AF334493	32.2	25.7	21.6	20.5	42.1
	中喙鲸属 Mesoplodon	小喙鲸(2) M.peruvianus	483	U13118 Z18654 U13116 Z18651	32.5	28.6	19.0	19.9	38.9
		热氏中喙鲸(2) M.europaeus	482		32.2	27.6	19.5	20.7	40.2
露脊鲸科 Balaenidae	弓头鲸属 Balaena	北极鲸 B.mysticelus(2)	481	U13102 AP006472	31.2	25.8	22.0	21.0	43.0
	露脊鲸属 Eubalaena	南露脊鲸 E.australis(1)	481	AP006473	30.8	25.2	22.7	21.4	44.1
		北太平洋露脊鲸 E.japonica(1)	481	AP006474	31.4	25.4	22.2	21.0	43.2
小露脊鲸科 Neobalaenidae	小露脊鲸属 Caperea	小露脊鲸 C.marginata(1)	481	AP006475	31.8	26.2	21.6	20.4	42.0
须鲸科 Balaenopteridae	须鲸属 Balaenoptera	长须鲸 B.physalus(2)	481	U13103 Z18633	31.4	25.8	22.0	20.8	42.8
		拟大须鲸 B.edeni(1)	481	AB201258	31.2	27.0	20.8	21.0	41.8
		大须鲸 B.borealis(1)	482	AP006470	31.3	26.8	21.0	21.0	42.0
	座头鲸属 Megaptera	座头鲸(1) M.novaeangliae	482	U13117	31.1	26.6	21.4	21.0	42.4
灰鲸科 Eschrichtiidae	灰鲸属 Eschrichtius	灰鲸 E.robustus(1)	483	U13108	31.5	25.5	21.9	21.1	43.0
恒河豚科 Platanistidae	恒河豚属 Platanista	恒河豚 P.gangetica(2)	483	AF334491 AF248732	32.1	25.9	21.5	20.5	42.0
拉河豚科 Pontoporiidae	拉河豚属 Pontopori	拉河豚 P.blainvillei(1)	483	AF248733	30.8	24.8	22.4	21.9	44.3
白暨豚科 Lipotidae	白暨豚属 Lipotes	白暨豚 L.vexillifer(2)	482	AF304065 AF248731	31.7	26.8	21.0	20.5	41.5
亚河豚科 Iniidae	亚河豚属 Inia	亚河豚 I.geoffrensis(1)	481	AF334497	30.8	25.6	22.5	21.2	43.7
*本研究 *this study

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2.   结果

2.1   碱基组成与同源比对分析

经PCR扩增，分别得到了瓶鼻海豚、中华白海豚和糙齿海豚3种海豚5个个体清晰的16S rRNA基因片段扩增产物。经单向测序、去除引物分别得到515、519和529 bp的片段。同源比对结果显示，瓶鼻海豚(2个个体)和中华白海豚(2个个体)种内个体间序列分别相同，其中本文的中华白海豚与GeneBank数据库中的中华白海豚序列相同(GeneBank登录号AF334507，来自美国，序列未列出)，与GeneBank中登录号为AY770539的中华白海豚序列不同。其余2种海豚的序列已在GeneBank数据库注册(表 1带*者)。3种海豚的碱基组成见表 1，其碱基组成几乎一致，和其它鲸豚类一样，16S rRNA基因中碱基A、T比G、C含量丰富(表 1)。与GeneBank中35种鲸类(表 1)的55条同源序列进行比对分析，两端截平后得到497个比对位点，包含127个变异位点(104个简约信息位点，24个单突变子)，其中有14个插入/缺失位点。本研究中瓶鼻海豚的1条16S rRNA基因部分序列与来自GeneBank中3条瓶鼻海豚(来自澳大利亚和比利时)同源序列间有5个变异位点，共形成3个单倍型(haplotype)；中华白海豚2个个体间(其中1个来自澳大利亚，登录号是AY770539)有2个变异位点；糙齿海豚2个个体间(其中1个来自美国，登录号是AF334508)有1个变异位点。糙齿海豚和瓶鼻海豚、中华白海豚种间都有8个变异位点而瓶鼻海豚和中华白海豚间只有2个变异位点。

2.2   海豚科种间遗传距离

根据Kimura双参数模型得出瓶鼻海豚、中华白海豚、糙齿海豚和海豚科其它6种的遗传距离(表略)。瓶鼻海豚3个单倍型(haplotype)的遗传距离分别为0.004、0.004、0.008，与其它种间的为0.004~0.017，种内遗传距离与种间遗传距离有部分重叠。中华白海豚2个个体间遗传距离为0.004，与其它种间为0.004~0.019，种内遗传距离等于或小于种间遗传距离。糙齿海豚2个个体间遗传距离为0.002，种间为0.017~0.030，与其它种之间的遗传距离都比较大。

2.3   聚类分析

本研究的瓶鼻海豚样品与土库海豚(土库海豚属)聚类在一起，再与GenBank中的1个瓶鼻海豚相聚，中华白海豚样品却与GenBank中的另2个瓶鼻海豚聚在一起，糙齿海豚(糙齿海豚属)与GenBank中的糙齿海豚聚类在一起(图 1)。

图  1  38种鲸类16S rRNA基因片段的NJ树

枝旁显示bootstrap 1 000个循环的置信度, *表示本研究物种

Figure  1.  The NJ tree of 38 cetaceans based on partial mitochondrial 16S rRNA gene sequences

The numbers beside branches represent the percentage of 1 000 bootstrap replicates, * represents this study.

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3.   讨论

本文初步分析了我国广东海域出现的海豚科的瓶鼻海豚、中华白海豚和糙齿海豚线粒体16S rRNA部分序列及其与国外种类的亲缘关系。3种海豚的16S部分序列碱基组成几乎一致，碱基A、T含量比G、C丰富。在系统发育分析中，我国的糙齿海豚(糙齿海豚属)与GenBank中的糙齿海豚(AF334508)聚类在一起，与两者的16S rRNA基因间遗传距离相一致(0.002)，表明我国的糙齿海豚与分布于美国的糙齿海豚有较近的亲缘关系。但瓶鼻海豚(宽吻海豚属)和中华白海豚(白海豚属)各自的聚类结果比较乱。我们的瓶鼻海豚样品与土库海豚属的土库海豚(S.fluviatilis)(AF304061)聚类在一起，再与GenBank中的1个瓶鼻海豚(Z18663)相聚，而中华白海豚样品却与GenBank中的另2个瓶鼻海豚(AY770538，U13123)聚在一起，但GenBank中的中华白海豚(AY770539)却与原海豚属的蓝白原海豚(S.coeruleoalba)(AJ010816)聚在一起。表明我国水域的瓶鼻海豚和中华白海豚与国外种存在一定的差异。瓶鼻海豚和中华白海豚分布很广，生活于不同水域的种类在形态等方面存在差异，可能是造成种类判别混乱的重要原因。如中国水域的瓶鼻海豚根据形态和分子特征可分为2个类型，truncatus和aduncus型^{[21-22, 34]}，本试验的瓶鼻海豚隶属于truncatus型。但中国境内的中华白海豚形态特征基本一致，与其他各地种的最大区别在于，背部及背鳍基部没有骆驼峰状的隆起^[1]。然而同种不同地理种群的种群遗传结构和遗传多样性如何甚少研究报道。由于海洋哺乳动物非常珍贵，有关种类的样品稀少，无法进行种群遗传结构研究，因此，本文的测序分析可为相关种类的种群遗传学分析添砖加瓦，积累资料。

NJ聚类分析结果与目前的主流观点基本相同，即须鲸亚目形成单系群而齿鲸亚目则为多系群，包括海豚总科、抹香鲸总科、喙鲸总科和淡水豚总科。其中抹香鲸总科与须鲸亚目聚合在一起^{[9-11, 35]}，而与传统的形态分类不同。淡水豚总科为一并系群并处于整个鲸豚类的基部，其中恒河豚科是最早分化的一支^{[7, 12, 36-37]}。但在鲸豚类大部分属间的系统发育关系的bootstrap检测值都很低，尤其是各大类群之间就更低^{[9, 12]}，有可能是因为它们在进化中来自于不同的祖先^[38]，它们对海水的适应只是一种次生现象，尤其是淡水豚类，它们可能是陆地-淡水甚至陆地-海水-淡水次生，因此，与其它齿鲸类和须鲸类相距较远也就不足为奇。由于国内海洋小型鲸豚类研究开展较晚，相关的研究报道不多，大部分基础生物学研究尚处于空白状态，其遗传多样性和系统发生关系的研究还有赖于积累更多的形态学和分子生物学资料。

此外，本研究发现鼠海豚科江豚属的江豚与一角鲸科白鲸属的白鲸聚合一起，与形态分类不同。HAMILTON等^[36]研究淡水河豚类的系统发生中显示江豚和鼠海豚有更近的亲缘关系。江豚无背鳍，一角鲸科成员背鳍小或者消失。分布范围广泛的江豚在不同地区水域存在着不同的地理种群或亚种，因此有必要用更多分子数据及形态解剖学资料对江豚的分类地位和系统发生做进一步的分析。