野鲮亚科隶属(Labeoninae)鲤形目(Cypriniformes)中的鲤科(Cyprinidae)，约有26个属近300个种，约占整个鲤科鱼类总数的15% ~20%，是一类对流水环境具有特殊适应性的鲤科鱼类类群，局限地分布于亚洲和非洲的热带及亚热带地区^[1]。野鲮亚科鱼类过去通常被包含在鲃亚科内，陈湘粦等^[2]对鲤科鱼类类群骨骼形态研究发现，原归入鲃亚科中具有复杂的口唇及其相关构造的类群在骨骼结构上存在独特离征，构成鲤科中的一个单系群，启用了野鲮亚科的名称。不同鱼类长期生活在相似的环境中会造成平行演化，使得它们在外部及骨骼形态上表现出较高的趋同性，因此仅用形态特征分析这些外形相似物种间的亲缘关系，会面临很大的困难，整个鲤科鱼类的系统发育研究也因此受到较大制约。

近年来分子系统学及DNA分子技术的快速发展，使得从分子水平研究鱼类物种间的亲缘关系及进行物种鉴定成为可能。鲤科鱼类分子系统进化研究是近年来鱼类分子进化研究的热点之一，Simons等^[3]和Gilles等^[4]利用细胞色素b和12S rRNA、16S rRNA基因序列对北美和欧洲的鲤科鱼类的系统进化进行了研究，何舜平等^[5-6]利用细胞色素b基因序列探讨了东亚低等鲤科鱼类的系统发育问题，王绪桢等^[7]研究了S7核糖体蛋白基因序列变异在低等鲤科鱼类中的系统发育意义，郑冰蓉等^[8]研究了鲤属鱼类mtDNA控制区序列的变异情况，童金苟等^[9]研究了3个鲤品种线粒体基因片段序列的保守性，郑光明等^[10]利用RAPD技术研究了鲮、麦鲮和野鲮的分子遗传标记，江世贵等^[11]利用生长激素(growth hormone, GH)基因序列分析了几种鲤科鱼类系统进化关系。上述研究主要集中在鲤科的鲤亚科和较低等亚科的鱼类，但对较进化的野鲮亚科鱼类的系统发育研究资料甚少，而研究野鲮亚科鱼类的分类和系统发育，对于深入了解整个鲤科鱼类的系统进化关系和物种形成方式具有重要的科学意义，因此本研究选用16S rRNA基因序列变异初步探讨了野鲮亚科和鲤亚科的系统发育关系，为进一步研究鲤科鱼类特别是野鲮亚科和鲃亚科、鲤亚科的系统发育关系打下了基础。

1.   材料和方法

1.1   研究材料

研究所用的鲮(Cirrhinus molitorella)、麦鲮(C.mrigala)和露斯塔野鲮(Labeo rohita)样品均为养殖品种，采自广东省南海水产养殖基地，所有标本均在95%的酒精中保存，其余物种16S rRNA序列从GenBank下载。本研究所用样品的具体种类如表 1。

表  1  本研究所用物种一览表

Table  1.  List of taxa used in this study

分类阶元 taxon	物种 species	DNA长度/bp DNA length/bp	GenBank登录号 GenBank accession number
野鲮亚科	鲮(C.molitorella)	361	AY378175
	麦瑞加拉鲮(C.mrigala)	362	AY378176
	露斯塔野鲮(L.rohita)	361	AY378177
	双色角鱼(E.bicolor)	359	LBI247069
鲤亚科	鲤鱼(Cyprinus carpio)	362	AU301091
	鲫鱼(Carassius auratus)	360	S50055
鲃亚科	南鲃(Barbus meridionalis)	360	BME247061
亚科	扁吻(Pungtungia herzi)	358	AB025216
	麦穗鱼(Pseudorasbora pumila)	358	AB025215
	鳈(Sarcocheilichthys variegatus)	359	AB054124
雅罗鱼亚科	小点吻鱼岁(Rhinichthys osculus)	358	AF081863

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1.2   方法

1.2.1   基因组DNA的提取

采用本实验室改进的方法，分别取50 μg背部肌肉组织剪碎放入1.5 mL的微量离心管中，加入600 μL TEN9(50 mM Tris.Cl pH 9.0, 100 mM EDTA, 200 mM NaCl)细胞裂解液和终浓度为2%的SDS，微型匀浆器匀浆后加入蛋白酶K至终浓度为100 μg·mL^-1，55℃温浴2~4 h，经酚抽提，异丙醇沉淀后溶于50 μL灭菌双蒸水中，测定DNA浓度后-20℃贮存备用。

1.2.2   引物设计与PCR扩增

参照已报道的鲤科鱼类16S rRNA基因序列进行同源检索排序，设计一对引物：16S-F: 5’-GGTAGGGCAATCACTTCTCT-3；16S-R: 5’-TAGCGGCTGGACCATTAGGA-3’。以提取的总DNA为模板，用Invitrogen公司的高保真DNA Taq酶(PLATINUM Taq DNA Polymerase Hight Fidelity)进行PCR扩增，30个循环。PCR反应条件为变性94℃、120 s，退火55℃、60 s，延伸68℃、45 s。循环结束后72℃延伸10 min。取5 μL PCR产物于1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，观察扩增结果。扩增的PCR产物送上海博亚生物技术有限公司测序。

1.2.3   数据分析

先用Clustal_X 1.81^[12]排序软件对16S rRNA序列进行对位排列，辅以手工校正，用Mega 2.1(Molecular Evolution Genetics Analysis)^[13]软件统计转换数和颠换数，分析各物种间的DNA序列差异，并基于Kimura双参数模型，用转换和颠换的信息，采用邻接法(Neighbore-Joining method, NJ)构建系统树，系统树各分支的置信度由自展法“Bootstrap”1000循环检验，相对遗传距离用Mega 2.1中的“Pairwise distance”计算。

2.   结果

2.1   16S rRNA的基因序列及差异

本研究测定了野鲮亚科鱼类鲮、麦鲮和露斯塔野鲮3个种的16S rRNA基因部分序列，用Clustal_X 1.81软件对测定的序列进行对位排列，辅以手工校正，并将从GenBank中下载的序列读入Clustal_X 1.81中，经排序后生成供系统发育分析的序列矩阵。所测序列的长度分别为361、362和361，平均碱基组成为：T，19.6%；C，25.2%；A，33.7%，G，21.4%，与其他鲤科鱼类的碱基含量相类似，AT的比率大于GC的比率。在所比较的11种鲤科鱼类16S rRNA序列中，有94个核苷酸变异位点，简约信息位点有67个，其中有7个是插入或缺失。基因序列差异和碱基替代情况统计见表 2。

表  2  基于线粒体16S rRNA序列变异的相对遗传距离

Table  2.  Pairwise distance matrix for the 16S ribosomal RNA fragment

		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
1	鲤鱼		0.097	0.129	0.113	0.126	0.130	0.110	0.126	0.144	0.123	0.109
2	鲫鱼	2.055		0.099	0.084	0.109	0.109	0.096	0.133	0.150	0.116	0.122
3	双色角鱼	2.026	1.781		0.086	0.125	0.119	0.109	0.125	0.143	0.123	0.129
4	鲮	1.682	2.103	2.789		0.105	0.115	0.096	0.115	0.133	0.122	0.115
5	露斯塔野鲮	0.903	1.889	2.116	1.888		0.086	0.064	0.102	0.108	0.086	0.086
6	麦瑞加拉鲮	1.220	1.954	2.234	2.548	10.288		0.031	0.070	0.102	0.067	0.070
7	南鲃	1.719	2.004	1.670	2.234	1.494	2.004		0.049	0.089	0.049	0.049
8	扁吻	1.046	1.604	1.824	1.634	1.539	1.835	1.246		0.086	0.080	0.061
9	麦穗鱼	1.286	2.003	1.685	1.868	2.144	2.437	1.358	2.004		0.080	0.09
10	鳈	1.790	1.836	2.202	3.207	2.027	2.144	1.670	2.649	1.857		0.043
11	小点吻鱼岁	1.889	2.536	2.518	2.340	2.446	2.736	2.635	2.241	1.750	3.222
*对角线以下是转换/颠换，对角线以上是转换加颠换 *below diagonal, transition/transversion ratios; above diagonal, transition+transversion

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2.2   基于16S rRNA基因部分序列构建的系统树

基于我们测得的3种野鲮亚科鱼类序列数据，结合从GenBank下载的其它8种鲤科鱼类相应序列，经Clustal_X 1.81软件排序后，用分子系统学软件Mega 2.1中的NJ法获得唯一的一个系统树，其拓扑结构和各分枝的置信度如图 1所示，最高置信度为97%。

图  1  NJ法构建的鲤科鱼类分子系统树(枝上显示bootstrap 1000个循环的置信度)

Figure  1.  The NJ tree of the Cyprinidae based on partial mitochondrial 16S rRNA sequences(the numbers represent the percentage of 1000 bootstrap replications)

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3.   讨论

长期以来，鲤科特别是野鲮亚科鱼类的分类和系统进化问题一直存在争议，过去野鲮亚科鱼类通常被包含在鲃亚科内^[14]，也有人因其独特的口唇及其相关结构和对流水环境的适应性，采用墨头鱼亚科(Garrinae)的名称，但墨头鱼亚科尚不能涵盖现今野鲮亚科的全部类群，且没有确切的鉴别特征。陈湘粦等^[2]在研究了鲤科鱼类类群骨骼形态后，把原鲃亚科中在骨骼结构上存在独特特征的一个单系群称为野鲮亚科。按现今的分类标准，野鲮亚科鱼类共有20个属，其中8个属为我国所特有，本研究所用样品鲮和麦鲮属于鲮属(Cirrhinus)，露斯塔野鲮属于野鲮属(Labeo)。鲮主要分布于中国南方以及国外的印度、中南半岛等地，麦鲮和露斯塔野鲮主要分布于印度和中南半岛。郑光明等人^[10]利用RAPD技术研究了鲮，麦鲮和露斯塔野鲮的亲缘关系，结果表明鲮与露斯塔野鲮的亲缘关系较近；江世贵等人^[11]利用较保守的GH基因研究鲮与野鲮亚科和鲤亚科的系统关系时发现，鲮与鲤亚科中鲤的亲缘关系更近，同源性达到97%，而与野鲮亚科的麦鲮和露斯塔野鲮的亲缘关系更远，同源性分别为87%和83%。为系统研究野鲮亚科鱼类的分类和系统进化发育位置，必须结合现代分子生物学技术寻找更多合适的分子遗传标记，系统探讨鲤科鱼类的进化问题。

线粒体16S rRNA结构既具有保守性，又具有高变性。保守性能够反映生物物种的亲缘关系，为系统发育重建提供线索；高变性则能揭示出生物物种的特征核苷酸序列，是属种鉴定的分子基础，因此一般认为16S rRNA适用于种以上水平的变异分析^[9]，也是较适合研究亚科鱼类间系统发育的一个分子遗传标记。本研究采用16S rRNA部分序列研究了鲤科鱼类几个亚科间的分子系统发育关系，序列比对结果显示在所比较的364个位点中，有94个为变异位点。总共11个分类阶元的转换颠换比平均约为2.1，多个分类阶元的转换颠换比小于2.0，一般认为转换颠换比的值小于2.0时则此基因序列的突变已经达到饱和状态，受进化噪音的影响可能性较大^[15]，重建系统发育树时如不进行特别加权就会得出错误信息，由于本研究分类阶元为种间比较，重建系统发育树时受饱和度得影响较小。

本研究采用16S rRNA部分序列重建了鲤科鱼类几个亚科间的分子系统发育树，结果表明整个系统树形成了两个大的支系，一个支系是由鲤亚科、野鲮亚科和鲃亚科鱼类组成，另一个支系是由亚科和雅罗鱼亚科鱼类组成，野鲮亚科鱼类没有形成单系群，野鲮亚科的鲮、角鱼与鲤亚科的鲤、鲫形成姐妹群，然后在与野鲮亚科的麦鲮和露斯塔野鲮聚在一起，这与江世贵等人^[11]的结果相一致，说明鲮与鲤亚科鱼类具有较近的亲缘关系。陈湘粦等人将鲤科鱼类根据骨骼特征划分为两大支系：雅罗鱼系和鲃系，认为雅罗鱼系的雅罗鱼亚科是较低等的鲤科鱼类，鲃系中鲃亚科是原始类群，野鲮亚科最进化，本研究利用16S rRNA基因部分序列构建的分子系统树也显示鲃亚科在鲃系中处于分支的基部比较原始，野鲮亚科较进化。