卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus）属鲹科、鲳鲹属，俗称黄腊鲳、金鲳、短鳍鲳鲹、红三、红沙等^[1]，是一种暖水性鱼类，在世界各大洋均有分布，在中国的黄海、东海和南海，特别是广西、广东、海南和福建沿海均有一定的资源量^[2]。卵形鲳鲹肉质鲜嫩、食性简单、生长快速、抗病力强，适高温、高盐，深受养殖者和消费者的喜爱，是一种具有较好养殖前景的优良品种^[3-4]。但随着养殖规模和密度的提高以及近海海水环境污染的日渐严重，卵形鲳鲹的病害也逐渐增多^[5-7]，由美人鱼发光杆菌杀鱼亚种（Photobacterium damselae subsp. piscicida）引起的发光杆菌病（Photobacteriosis）是其中一种危害较为严重的疾病，主要临床特征为肾脏、脾脏以及肝脏等器官的表面和实质出现灰白色坏死结节^[2]，可导致较大的经济损失^[1]。在美国、日本、欧洲和中国的海水养殖中该菌为常见的病原菌，对多种养殖鱼类有高致病性^{[1, 8-11]}，发病率达60%，致死率约为50%，潜伏期大约1周^[12]。

转铁蛋白（Tf）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、C-型溶菌酶（C-Lys）都具有抗菌杀菌、自我保护的抗病性能，是抑制细菌繁殖的重要因子^[13-16]。转铁蛋白可抑制细菌的生长主要是由于转铁蛋白具有螯合铁的功能，而铁是许多细菌和病毒生长的重要因子^[13]。肿瘤坏死因子α可以抑菌杀菌主要是其可以促进T细胞增殖，诱导活化B细胞增殖和Ig的分泌，且具有促炎活性和免疫调节活性^[14]等。溶菌酶的杀菌抑菌作用主要是可以水解细菌细胞壁的肽聚糖的β-1，4糖苷键结构，从而造成细菌细胞壁的破裂而使细菌死亡^[15]。

文章通过研究卵形鲳鲹人工感染美人鱼发光杆菌杀鱼亚种后，其肾脏组织中细菌数量以及Tf、TNFα和C-Lys表达量的动态变化，探讨卵形鲳鲹自身免疫防御系统在对抗细菌感染中的作用。

1.   材料与方法

1.1   实验用鱼

卵形鲳鲹来自海南省陵水黎族自治县中国水产科学研究院南海水产研究所养殖基地，体质量（37.65±5.40）g，体长（11.75±0.53）cm，实验在热带水产研究开发中心进行，卵形鲳鲹暂养在2个3 m³水体的水泥池中，水温（30.0±1.5）℃，水源为砂滤天然海水，全天充气，每天早晚各换水1次，换水量为总水量的2/3。早晚各投喂商品饲料1次，投喂量按每条鱼约1.4 g进行计算，暂养3 d后，禁食1 d，选取外观无伤、游动活泼、摄食正常的卵形鲳鲹进行感染实验。

1.2   实验菌株

感染所用菌株为笔者实验室自存的美人鱼发光杆菌杀鱼亚种TOS1株^[17]。

1.3   TOS1注射液制备

将TOS1菌株接种于脑心浸汁琼脂斜面培养基上，28 ℃培养16 h后，在每个试管中加入2 mL无菌生理盐水（0.8%），将菌从斜面培养基上洗下。然后4 ℃、3 000 r·min^-1离心5 min，弃上清，再加2 mL无菌生理盐水，同条件下离心1次，用无菌生理盐水（0.8%）重悬菌液。将菌液做10倍系列稀释，每个浓度取0.1 mL涂布平板，28 ℃培养18~20 h后计数，以确定注射液浓度。

1.4   分组及攻毒

实验共用鱼180尾，分为实验组和对照组，实验组每尾鱼以腹腔注射的方式注射0.2 mL浓度为2.1×10⁷ CFU·mL^-1的TOS1活菌液，养在2个1.5 m³水体的圆形水泥池中，一个池中放30尾，用于观察卵形鲳鲹在注射后的死亡情况；一个池中放60尾，用于采集实验样品。对照组每尾鱼注射0.2 mL无菌生理盐水，分池同实验组。

1.5   样品采集与保存

在注射感染后第0、第3、第6、第12、第24、第48、第72、第96小时，实验组和对照组分别取卵形鲳鲹6尾，用丁香酚麻醉，第0小时取鳃、肾脏、头肾、心脏、脑、肝脏、脾脏、肠、胃、皮肤、肌肉等组织30~35 mg放在1.2 mL的RNA later中，其他时间点取肾脏组织，-20 ℃冰箱保存备用。第0小时所采样品用于对卵形鲳鲹Tf、TNFα、C-Lys的组织分布检测，其他时间点用于检测TOS1感染对卵形鲳鲹Tf、TNFα、C-Lys表达量的影响。

1.6   肾脏组织细菌平板计数

注射后第3、第6、第12、第24、第48、第72、第96小时，在实验组中取3尾卵形鲳鲹，分别无菌操作取50 mg肾脏组织，放在无菌的玻璃研磨器中，加入1 mL无菌生理盐水，研磨到无明显组织块后，进行10倍系列稀释，每个浓度取0.1 mL进行平板涂布，每个浓度做2个平行，28 ℃培养18~20 h后进行平板计数。

1.7   总RNA提取和cDNA合成

取保存于RNA later中的样品，按照Trizol（TaKaRa）使用说明书提取组织总RNA，用核酸蛋白分析仪测定样品在260 nm和280 nm的吸收值，确定RNA的浓度。

以提取的总RNA（2 μg）为模板，按照使用说明书利用M-MLV反转录酶（Promega）制备cDNA，－20 ℃保存备用。

1.8   Tf、TNFα以及C-Lys基因的表达量检测

根据笔者实验室卵形鲳鲹转录组数据中已知β-actin、Tf、TNFα以及C-Lys基因序列，用Primer 5.0软件设计引物，由北京六合华大基因科技有限公司进行合成。

利用Mastercycler ep realpiex 2荧光定量仪（Eppendorf）进行实时荧光定量PCR反应。具体操作按照GoTaq^® qPCR Master Mix Kit (A6001)（Pr omega）试剂盒说明书进行，所用引物见表 1。反应体系为Nuclease-Free Water 5.4 μL，上游引物（10 μmol·L^-1）0.3 μL，下游引物（10 μmol·L^-1）0.3 μL，GoTaq^® qPCR Master Mix（2X）7.5 μL，cDNA模板1.5 μL，共15 μL。反应程序为95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，40个循环，每个延伸步骤后进行荧光信号检测，用于检验产物的特异性。每个样品设3个重复。

表  1  荧光定量PCR引物序列

Table  1  Primers of real time PCR

引物名称 primer	核酸序列（5′→3′） nucleotide sequence
β-actinF β-actinR TfF TfR TNFF TNFR C-LyzF C-LyzR	AGCCCACAACACCTCTTCC TCCTCACATTCACACCGCC CCCACCTCTCCATTCTGT TACCATCGCTGTTTTCGC GAGTTGGAGTGGAAGAA TGAGAGGTGTGAAGCGT GGACAAACGCCCACTTCA CACCACATCCTGCCACAT

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1.9   数据处理

荧光定量实验数据采用2^-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。用Excel 2007整合计算，并采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），同时用Duncan′s检验法分析各组数据差异的显著性，结果以平均值±标准误（X±SE）表示（n≥3），P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。图形用Origin Pro 7.0进行处理。

2.   结果与分析

2.1   累计死亡率及肾脏组织细菌数量

在感染TOS1后，实验组卵形鲳鲹从感染后的第6小时开始出现死亡，第48小时累计死亡率达到76.4%，之后再无死亡。在第3~第24小时卵形鲳鲹死亡率较高，其中第12~第24小时为死亡高峰期，第24~第48小时死亡率相对下降；对照组在实验期间内无死亡情况（图 1）。卵形鲳鲹肾脏组织中细菌数量在第3~第96小时一直处于下降趋势，第3~第24小时内细菌数量下降明显，从1.07×10⁶ CFU·g^-1下降到2.3×10⁴ CFU·g^-1，减少了2个数量级，在第24~第48小时内细菌数量变化不大，处于平台期，之后又迅速下降，从2.07×10⁴ CFU·g^-1下降到1.29×10³ CFU·g^-1（图 2）。

图  1  美人鱼发光杆菌TOS1感染卵形鲳鲹的累积死亡率

Fig. 1  Accumulative mortality of T.ovatus infected with P.damselae subsp.piscicida TOS1

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图  2  感染TOS1后卵形鲳鲹肾脏组织中美人鱼发光杆菌数量变化

Fig. 2  Changes of colony of P.damselae subsp.piscicida in T.ovatus′ kidney tissue after TOS1 infection

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2.2   Tf、TNFα和C-Lys的组织表达分布

在健康卵形鲳鲹中，Tf、TNFα和C-Lys在所检测的肝脏、肾脏、心脏、脾脑、头肾、肌肉、鳃、脑、胃和肠这10个组织中均有表达。Tf在肝脏中的表达量最高，与其他组织中的表达量差异极显著（P<0.01），相对于肾脏，各组织中Tf表达量的高低顺序依次为肝脏（3 198倍）>脑（2.653倍）>头肾（1.115倍）>肾脏（1倍）>肌肉（0.113 1倍）>鳃（0.075 08倍）>脾脏（0.068 43倍）>心脏（0.068 12倍）>胃（0.010 59倍）>肠（0.006 646倍）（图 3-a）；TNFα基因在肝脏中的表达量最高，其次是鳃，与其他组织表达量差异显著（P<0.05），相对于肾脏，各组织中TNFα表达量的高低顺序依次为肝脏（5.732倍）>鳃（4.591倍）>脾脏（1.728倍）>肌肉（1.509倍）>头肾（1.489倍）>肠（1.336倍）>肾脏（1倍）>胃（0.514 8倍）>心脏（0.378 2倍）>脑（0.372 9倍）（图 3-b）；C-Lys基因在头肾中的表达量最高，与其他组织表达量差异极显著（P<0.01），其次是肾脏，与其他组织表达量差异显著（P<0.05），相对于肝脏，各组织中C-Lys表达量的高低顺序依次为头肾（253.4倍）>肾脏（75.21倍）>肌肉（2.057倍）>心脏（1.971倍）>肝脏（1倍）>脑（0.190 6倍）>鳃（0.126 5倍）>脾脏（0.097 7倍）>胃（0.062 4倍）>肠（0.054 4倍）（图 3-c）。

图  3  转铁蛋白、肿瘤坏死因子α和C-型溶菌酶基因在不同组织中的表达分布

*.差异显著（P<0.05）；**.差异极显著（P<0.01）；后图同此。

Fig. 3  Distribution of Tf, TNFα and C-Lys expression in different tissues

"*" indicates significant difference (P <0.05);"**" indicates very significant difference (P <0.01). The same case in the following figure.

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2.3   TOS1感染对肾脏中Tf、TNFα和C-Lys表达的影响

感染TOS1后，实验组卵形鲳鲹肾脏中的Tf相对于对照组的表达量先升高后下降再升高，第3~第12小时相对于对照组的表达量是升高的，其中第6小时最高，为对照组的17.99倍，在第48小时下降到对照组的0.13倍，在第96小时又升高到对照组的1.42倍（图 4-a）；TNFα相对于对照组的表达量先升高后下降又升高再下降，在第6小时升高为对照组的2.00倍，在第12小时下降为对照组的0.6倍，在第24小时升高为对照组的6.05倍，在第96小时下降为对照组的0.25倍（图 4-b）；感染TOS1后，C-Lys的表达量相对于对照组下降，在第6小时下降至最低，为对照组的0.18倍，在第24小时略升高至对照组的0.64倍，在第48小时下降为对照组的0.22倍，在第96小时为对照组的0.31倍，其表达量在第3~第96小时一直低于对照组（图 4-c）。从结果可以看出，TOS1感染卵形鲳鲹能促进Tf、TNFα的表达，而抑制C-Lys的表达。

图  4  卵形鲳鲹肾脏转铁蛋白、肿瘤坏死因子α和C-型溶菌酶基因在TOS1感染不同时间相对表达量的变化

Fig. 4  Relative expression of Tf, TNFα and C-Lys gene in kidney of T.ovatus infected by TOS1 at different time

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3.   讨论

卵形鲳鲹的脾脏、肾脏和肝脏等器官都是美人鱼发光杆菌感染的靶器官^[1]，在鱼体内肾脏外还包裹了两层膜，在此实验中取肾脏进行细菌计数可以减少污染。人工感染美人鱼发光杆菌后，卵形鲳鲹肾脏内细菌含量在第3~第96小时内持续减少，在第3~第24小时细菌数量大量下降的同时，卵形鲳鲹的死亡率较高。而在第24~第48小时细菌数量减少不明显，同样，卵形鲳鲹的相对死亡数也少。在第48小时后细菌数量又迅速降低，此时卵形鲳鲹没有出现死亡（图 1，图 2）。这可能是因为卵形鲳鲹与美人鱼发光杆菌之间先进行了激烈的相互作用，在这个过程中卵形鲳鲹体内免疫系统发挥着重要的作用^[18]。当卵形鲳鲹抵抗住了美人鱼发光杆菌的侵害而成活下来，鱼体自身的持续清菌活动，使细菌数量减少；反之，当卵形鲳鲹抵抗不住细菌的侵害，鱼死亡。

Tf有2个结合铁的结构域，是铁离子运输和代谢过程中不可或缺的重要因子^[19]，并且可以作为细胞因子，行使其他生物学机能^[20]；另外，其还具有抗菌杀菌的功能^[21-23]，中华鳖（Amyda sinensis）^[24]、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)^[25]和草鱼(Ctenopharyngodon idellus)^[19]中Tf在肝脏中的水平都是最高的。同样，在此研究中卵形鲳鲹Tf在肝脏中的表达量占绝对优势，是其他组织的几千倍。用嗜水气单孢菌（Aeromonas hydrophila）感染中华鳖^[24]、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）感染黄喉拟水龟（Mauremys mutica）^[23]等后，Tf在肝脏、肾脏等组织的表达量均有上调现象。此研究中经过病原刺激后卵形鲳鲹肾脏中Tf表达量在第0~第12小时高于对照组，其中，在第6小时的表达量最高，而在第3~第24小时肾脏中细菌数量下降明显，卵形鲳鲹死亡数大，这说明其参与到机体的抗菌杀菌的自我免疫保护中。

TNFα是一种参与多项生物机体活动调控的细胞因子，其包括免疫调控、维持机体体内免疫系统平衡、细胞凋亡和细胞的增殖与分化等^[26]，此外，还在抵抗寄生虫、细菌和病毒感染过程中起重要介质的作用^[27-29]。KINOSHITA等^[30]发现斑马鱼（Danio rerio）中TNFα在肠中表达量最高，其次是脾脏和鳃。GRAYFER等^[31]的研究显示金鱼（Crassius auratus）TNFα在脾脏中表达量最高，脑、鳃和心脏中也有较高的表达量。该研究发现卵形鲳鲹TNFα在肝脏和鳃中的表达量显著高于其他组织，在脾脏、肠、头肾、肾脏和肌肉中有一定表达量，在心脏中的表达量最少。虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、条石鲷（Opolegnathus fasciatus）等受到LPS刺激后，TNFα都会有一个上调的过程^[32-33]。该研究结果表明，美人鱼发光杆菌刺激卵形鲳鲹后，其肾脏中TNFα在感染后第3、第6、第24小时感染组都高于对照组，而第3~第24小时是卵形鲳鲹清除体内病原细菌，发挥免疫保护的重要时期，说明TNFα在抵抗外原入侵，以及抗细菌感染防御中起着重要作用。

溶菌酶又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，广泛存在于各种无脊椎动物、高等动物和植物中^{[31, 34]}，其能催化细菌细胞壁中肽聚糖N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键的水解，破坏肽聚糖支架，导致细菌细胞壁破裂，内容物逸出而使细菌溶解死亡。因此，它是一种广谱抗菌效应分子。除此之外，它还可诱导调节其他免疫因子的合成与分泌^[35-36]。C-Lys的组织分布不是一个固定的模式，如在日本鳗鲡（Anguilla japonica）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）中C-Lys在胃、肠中表达量最多，可能是其还具有消化功能^[37-38]。而在卵形鲳鲹中C-Lys在头肾中表达量最高，其次是肾脏，在其他的组织中的表达量都比较少，该结果与YE等^[39]关于草鱼的研究结果相似，说明其可能与机体防御有关。病原刺激可导致溶菌酶表达量升高^[37-41]，例如用迟缓爱德华氏菌（Edwarsiella tarda）感染日本鳗鲡，在感染后的第24和第48小时C-Lys在各组织中表达量增加^[35]，潘宝平等^[40]用鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激青蛤（Cyclina sinis）后，青蛤血细胞中C-Lys在第12~第24小时出现上调。但在该实验中发现C-Lys在实验组的表达量在感染后的第3~第96小时一直低于对照组，出现负调控现象。有关研究发现在革兰氏阴性菌中广泛存在一种新的C-型溶菌酶抑制剂家族——膜结合C-型溶菌酶抑制剂（membrane-bound lysozyme inhibitor of C-type lysozyme，MliC）或细胞周质C-型溶菌酶抑制剂（periplasmic lysozyme inhibitor of C-type lysozyme，PliC）^[42]。而美人鱼发光杆菌是革兰氏阴性菌^[1]，可能存在这种新型的C-型溶菌酶抑制剂，所以该细菌进入鱼体后抑制了C-Lys的活性，从而出现了表达量下降的情况。另外，该研究结果显示，对照组卵形鲳鲹在注射生理盐水后，肾脏中Tf、TNFα、C-Lys的表达量随时间变化有一定的波动，基本趋势为先下降后升高，特别是72 h后C-Lys的表达量变化与第6~第24小时比差异显著，这可能是因为注射导致卵形鲳鲹受到刺激，卵形鲳鲹发生应激反应。这与王美娟^[43]的研究相符，淇河鲫（Qihe crucian carp Carassius auratus）注射生理盐水（0.75%）后，其肾脏中C-Lys的表达量也出现类似结果。

4.   结论

健康卵形鲳鲹中Tf在肝脏中的表达量最高，且与其他组织差异极显著，其次是脑；TNFα在肝脏和鳃中都有较高的表达量，与其他组织差异显著；C-Lys在头肾中表达量最高，其次是肾脏。美人鱼发光杆菌感染卵形鲳鲹会促进其肾脏中Tf和TNFα的表达，而抑制C-Lys的表达。