Genetic diversity and specific AFLP bands in three cultured tilapia strains
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摘要:
对不同来源的养殖群体进行种质鉴定，探索在种苗阶段即区分新吉富罗非鱼(New GIFT strain Oreochromis niloticus)、吉诺玛罗非鱼(GenoMar strain O.niloticus)和奥杂罗非鱼(O.niloticus ♀ ×O.aureus ♂)3个养殖群体具有重要的意义。笔者选取了5对AFLP(amplified fragment length polymorphism)引物组合对3个罗非鱼养殖群体共60尾个体进行比较分析，引物组合E-ACA/M-CAT表现出较好的区分能力，有7条标记的分布在群体间表现出“有和无”的差别，引物组合E-ACA/M-CAG的扩增图谱中有2条带表现出“有和无”的差别。遗传多样性方面，平均基因多样性在新吉富罗非鱼和吉诺玛罗非鱼分别为0.1605和0.1595，而在奥尼罗非鱼为0.2214，多态位点百分数和Shannnon多样性指数也表现出相近的变化趋势。分析表明新吉富罗非鱼群体在遗传上已较为稳定，吉诺玛罗非鱼遗传多样性偏低。
Abstract:New Gift tilapia, GenoMar tilapia, and the hybrid tilapia of Oreochromis niloticus ♀ ×O.aureus ♂ were three major cultured tilapia lines in south China. Identifying these lines was important especially at fry stage. Using amplified fragment length polymorphism(AFLP)technique, we analyzed a total of 60 samples with five primer pairs. Out of 245 AFLP bands, 53.02% were polymorphic. Seven bands from primer pair E-ACA/M-CAT and two bands from E-ACA/M-CAG were found to be specific and could be used to distinguish the three cultured tilapia lines. As for genetic diversity of the three tilapia lines, gene diversity index of New Gift tilapia, GenoMar tilapia, and the hybrid were 0.1605, 0.1595, and 0.2214, respectively. Percent of polymorphic bands and Shannon index presented the similar trend in gene diversity index in these three lines, suggesting that New Gift tilapia was genetically stable, gene diversity index of GenoMar tilapia was a little small.
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罗非鱼(Tilapia)属于鲈形目(Perciformes)，丽鱼科(Cichlidae)，全世界约有700种，自然分布于非洲及西亚的以色列和约旦等地，后来被广泛移植到世界各地。罗非鱼具有生长速度快、食性杂、抗病力强、肉味鲜美而少刺等许多优点，是世界性的主要养殖鱼类之一。目前，中国南方养殖的罗非鱼品种主要包括新吉富罗非鱼(New GIFT strain Oreochromis niloticus)、吉诺玛罗非鱼(GenoMar strain O.niloticus)和奥尼杂交鱼(O.niloticus ♀ ×O.aureus ♂)等。其中新吉富罗非鱼和吉诺玛罗非鱼皆是来自于国际水生生物资源管理中心通过混合选育得到的吉富品系。新吉富罗非鱼是上海水产大学1994年引进吉富品系罗非鱼之后在青岛、蚌埠和广州3个基地系统选育得到的第8和9代。吉诺玛罗非鱼是吉富品系罗非鱼经吉诺玛公司在菲律宾培育亲本后在中国市场上销售的第15代。奥尼罗非鱼是尼罗罗非鱼♀ ×奥利亚罗非鱼♂的杂交种，因子代一般表现出高雄性率而在中国南方得到较大面积的养殖。随着罗非鱼养殖不断推向新的高潮，相应地对不同来源养殖群体进行种质鉴定研究将为罗非鱼养殖业的健康可持续发展提供理论基础。
AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术[1]作为一种新型的分子标记，被广泛应用于鱼类遗传多样性检测[2-4]、种质鉴定[5-7]、系统分类[8]、遗传连锁图谱构建[9-10]和QTL(quantitative traits location)定位[11-12]等研究。在罗非鱼中，AGRESTI等[13]和KOCHER等[14]应用AFLP结合SSR构建了罗非鱼的遗传连锁图谱。EZAZ等[15]将尼罗罗非鱼(O.niloticus)一个与性别连锁的AFLP标记进行物理图谱定位到第1对染色体上，MOEN等[16]采用四杂交群体将罗非鱼耐低温QTL定位到第23号连锁群。EZAZ等[17]对尼罗罗非鱼雌核发育系和克隆系进行种质分析。笔者利用AFLP技术筛选了中国南方3个主要罗非鱼养殖群体的特异性标记，并进行遗传多样性分析，以期建立在鱼苗阶段就能够区分这3个养殖群体的检测技术，并探讨各个养殖群体的遗传变异水平，为后续的罗非鱼遗传育种提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
所有新吉富罗非鱼、吉诺玛罗非鱼和奥杂罗非鱼样品均由广东省罗非鱼良种场提供。每个群体随机采样20尾，于95%的乙醇中固定和保存。基因组DNA提取方法参考黄培堂等《分子克隆实验指南》[18]。
1.2 AFLP反应
实验方法参照VOS等[1]的方法。选用EcoRⅠ和MseⅠ限制性内切酶，内切酶和连接酶均购自New England Biolab公司。引物及接头由上海生物工程有限公司合成。选择性扩增使用了8种EcoRⅠ引物和8种MseⅠ引物共64个引物组合，根据预试验结果，从中筛选重复性好、多态性较高的5个引物组合进行正式扩增反应。扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行100 W恒功率电泳。染色程序参考《分子克隆实验指南》[18]银染方法。在显色终止、漂洗之后进行拍照、记录和分析。
1.3 数据统计与分析
首先按电泳图谱中扩增条带的有无，每个DNA片断视为一个分子标记，在同一位点，当AFLP谱带存在时赋值为“1”，不存在时赋值为“0”，将整个分子标记图谱转化成“0”和“1”的数字矩阵。利用POPGENE 1.31软件[19]，计算以下遗传参数。
Nei平均基因多样性指数H=1-∑Pi2，Pi2为单个位点上等位基因的频率；
Nei群体间遗传相似性系数I=∑ (XiYi) /﹛∑(Xi)2∑ (Yi) 2﹜1/2
其中Xi、Yi分别为X和Y群体第i个位点的等位基因频率；
群体间Nei遗传距离DA=1－lnI
加上偏差较正后Nei群体间遗传相似性系数
I=(2n－1)∑(XiYi)/﹛∑[2n(Xi)2－1]∑[2n (Yi)2－1] ﹜1/2
其中Xi、Yi分别为X和Y群体第i个位点的等位基因频率；
群体内Shannon多样性指数H0=－∑ (XilnXi) /N
其中Xi为位点i在某一群体中出现的频率，ln为自然对数，N为所测座位数。
2. 结果
2.1 AFLP扩增结果
在预试验的基础上，笔者选取了5对AFLP引物组合对3个罗非鱼养殖群体共60尾个体进行比较分析，共统计了245个DNA条带，结果见表 1。各引物组合之间的扩增效果之间存在一定差异，扩增片段大小在0.1~1.8 kb之间。5对引物组合共扩增出131条多态性条带，多态比例53.02%。平均每对引物组合扩增出49条带，其中26.20条带呈现出多态性。
表 1 5对AFLP引物组合的检测结果Table 1. Result of 5 AFLP primer pairs引物组合
primer pair总带数
total bands单态性条带数
monomorphic bands多态性条带数
polymorphic bands多态带百分数/%
percent of polymorphic bandsE-AAG/M-CAG 52 24 28 53.85 E-ACA/M-CAC 34 18 16 47.06 E-ACA/M-CAG 54 21 33 61.11 E-AAG/M-CAC 55 28 27 49.09 E-ACA/M-CAT 50 23 27 54.00 合计 total 245 114 131 平均 average 49.00 22.80 26.20 53.02 2.2 3个群体的特异性标记
在该研究选取的5对引物中，每个引物不仅在多态条带百分数方面表现出差异，在扩增的群体间特异性条带上也表现出较大差别(表 2)。其中E-ACA/M-CAT引物组合表现出较好的区分能力，有7条标记的分布在群体间表现出“有和无”的差别，引物E-ACA/M-CAG的扩增图谱中有2条带表现出“有和无”的差别。其它3对引物组合则没有发现可以用于区分不同群体的特异性条带。
表 2 不同群体的特异性AFLP标记Table 2. Specific bands of three tilapia lines特异性条带
specific band新吉富罗非鱼
New Gift tilapia吉诺玛罗非鱼
GenoMar tilapia奥尼罗非鱼
O.niloticus ♀ ×O.aureus ♂E-ACA/M-CAT-1044 × × √ (14/20) E-ACA/M-CAT-954 × √ (4/20) √ (8/20) E-ACA/M-CAT-690 √ (20/20) √ (20/20) × E-ACA/M-CAT-686 × × √ (13/20) E-ACA/M-CAT-402 × × √ (19/20) E-ACA/M-CAT-304 √ (11/20) √ (6/20) × E-ACA/M-CAT-298 × × √ (20/20) E-ACA/M-CAG-1650 × × √ (16/20) E-ACA/M-CAG-420 × × √ (13/20) 2.3 3个群体的遗传多样性、遗传相似性和遗传距离
采用3种指标考察了3个罗非鱼养殖群体的遗传多样性。其中多态位点百分数在新吉富罗非鱼和吉诺玛罗非鱼分别为32.35%和30.61%，而在奥尼罗非鱼高达36.24%。平均基因多样性在新吉富罗非鱼和吉诺玛罗非鱼分别为0.1605和0.1595，而在奥尼罗非鱼为0.2214(表 3)。
表 3 3个罗非鱼群体的遗传多样性Table 3. Genetic diversity of three cultured tilapia lines种类
species多态位点/%
percent of polymorphic bands平均基因多样性
average gene diversity Shannon多样性指数
Shannon diversity index新吉富罗非鱼 New Gift tilapia 32.35 0.1605 0.2481 吉诺玛罗非鱼 GenoMar tilapia 30.61 0.1595 0.2656 奥尼罗非鱼
O.niloticus ♀ ×O.aureus ♂36.24 0.2214 0.2983 群体间遗传相似性系数和遗传距离见表 4。偏差校正后，不同群体间的遗传相似性系数为0.9088~0.9567，遗传距离为0.0474~0.0992。
表 4 3个罗非鱼群体的Nei遗传相似性系数(左上角)及遗传距离(右下角)Table 4. Nei′s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (underneath diagonal) of three cultured tilapia lines新吉富罗非鱼 吉诺玛罗非鱼 奥尼罗非鱼 新吉富罗非鱼 New Gift tilapia - 0.9567 0.9088 吉诺玛罗非鱼 GenoMar tilapia 0.0474 - 0.9224 奥尼罗非鱼 O.niloticus ♀ ×O.aureus ♂ 0.0992 0.0839 - 3. 讨论
罗非鱼养殖在中国的淡水养殖业中占有重要的位置。在罗非鱼养殖业的发展过程中，养殖群体先后经历数次大的遗传学事件，如1994年引进吉富罗非鱼、1998年上海水产大学从埃及引进尼罗罗非鱼原种[20]，以及奥尼杂交鱼得到大量养殖、吉诺玛罗非鱼进入中国市场等。不同来源的罗非鱼外部形态上差异较小，不易分辨。由于以上原因，使得目前中国罗非鱼养殖群体种质资源状况相当复杂。
AFLP对于亲缘关系及遗传上区别不大的种类以及对环境因子引起的变化的检测来说是很合适的分子标记法[21]。该研究找出的新吉富罗非鱼、吉诺玛罗非鱼和奥尼罗非鱼群体之间的特异性AFLP标记可用于罗非鱼种质的分子辅助鉴定。在统计的245条DNA带中，有9条表现出群体间特异性，其中有8条DNA条带可在3个群体间区分出奥尼罗非鱼，只有E-ACA/M-CAT-954一条DNA条带在新吉富罗非鱼和吉诺玛罗非鱼之间表现出“有或无”的差异。新吉富罗非鱼和吉诺玛罗非鱼具有共同的来源，那就是国际水生生物资源管理中心通过混合尼罗罗非鱼的4个野生群体(埃及、加纳、肯尼亚和塞内加尔)和4个亚洲的养殖群体(以色列、新加坡、泰国和中国台湾)选育得到的吉富品系，而奥尼罗非鱼是尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼的杂交子一代，因此，相对而言新吉富罗非鱼和吉诺玛罗非鱼具有较近的亲缘关系，而奥尼罗非鱼亲缘上与新吉富和吉诺玛相对较远。该研究找到的9个特异性条带对于这3个罗非鱼群体的区分能力也从一个侧面表现了它们之间的亲缘关系。
在9条特异性条带中，E-ACA/M-CAT-954在新吉富罗非鱼中没有出现，而在吉诺玛罗非鱼和奥尼杂交鱼中出现频率分别为20%(4/20)和40%(8/20)，这个现象值得稍做探讨。一个物种的基因引入到另一个物种的基因库中的现象叫“渐渗杂交”(introgressive hybridization)，如果这2个物种在自然界里重叠分布，或在同一养殖系统里养殖，而且能产生可育的后代，那么杂交后代一般倾向于同较为繁盛的物种回交，这样就造成了群体内的大多数可育个体同较为繁盛的物种相似，但也保留着另一亲本物种的一些性状。李思发和蔡完其[22]采用同工酶的方法发现南京的一个罗非鱼场的尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼养殖群体之间存在遗传渐渗现象。由于罗非鱼类很容易在种间自行杂交，奥尼杂交种同正宗的尼罗罗非鱼在外表上相似，难以用肉眼加以区分。E-ACA/M-CAT-954在吉诺玛罗非鱼和奥尼杂交鱼中出现，一方面可以作为区别新吉富罗非鱼群体的特异性标记，另一方面提示笔者，今后在罗非鱼保种和育种工作中要对群体遗传因素予以充分重视。
此研究表明，3个罗非鱼养殖群体的遗传多样性较高，其中奥尼罗非鱼群体的遗传多样性水平最高，平均基因多样性指数为0.2214，相对应新吉富罗非鱼和吉诺玛罗非鱼的平均基因多样性指数分别为0.1605和0.1595，新吉富罗非鱼群体比吉诺玛罗非鱼具有更高的遗传多样性水平。采用Shannon多样性指数和多态位点百分数2个指标分析也得到类似的结果，这也与特异性条带所表达的结果能够互相印证。颉晓勇[23]采用AFLP技术对新吉富罗非鱼选育过程中不同代数群体的遗传变异分析表明，基础群体F0的基因多样性指数为0.1834，选育群体F6、F7、F8和F9的基因多样性指数分别为0.1765、0.1754、0.1620和0.1560，呈现出明显的随选育代数增加而基因多样性下降的趋势。群体遗传学认为，一个群体的遗传多样性水平越低，发生遗传漂变和遗传瓶颈的概率就越大。在育种与养殖生产实践中，遗传多样性水平的降低意味着健康可持续发展将面临持续增大的风险。此研究中，新吉富罗非鱼群体的平均基因多样性水平与颉晓勇[23]研究的F8和F9相近。经测定，新吉富罗非鱼经过10年系统的选择育种，其F8和F9代生长速度已较基础群体提高40%左右，群体的遗传结构已较为稳定，于2006年审定为鱼类优良养殖品种并面向全国推广。此研究的新吉富罗非鱼样本是在2004年F8获得的3年之后，其遗传多样性水平仍然与F8相近，从侧面也说明新吉富罗非鱼群体在遗传上已较为稳定。相比较而言，吉诺玛罗非鱼和新吉富罗非鱼具有相同的起源，只是吉诺玛罗非鱼后续经历了不同的选育过程，至2003年已选到第15代，此研究测得其平均基因多样性指数为0.1595，略低于新吉富罗非鱼。原因可能与吉诺玛罗非鱼经历的选育代数更多、选育方式不同等因素有关。李莉好等[24]采用AFLP标记对比研究了青岛、广州和吉诺玛等3种吉富罗非鱼的遗传多样性(青岛群体即是新吉富罗非鱼)，发现青岛群体的群体内基因多样性指数为0.245，吉诺玛群体为0.179，说明吉诺玛罗非鱼群体遗传多样性水平明显相对偏低，而且比此研究检测到的偏低程度更为严重，因此，及时对选育群体的遗传结构进行监测并采取积极的措施应是吉诺玛罗非鱼育种所需要迫切解决的问题。
对3个罗非鱼群体间遗传相似性系数和遗传距离分析表明，新吉富罗非鱼和吉诺玛罗非鱼之间遗传相似性系数达0.9567，这2种罗非鱼和奥尼罗非鱼之间的相似性系数分别为0.9088和0.9224，说明新吉富罗非鱼和吉诺玛罗非鱼亲缘关系较近，与奥尼罗非鱼亲缘关系较远。群体间遗传距离分析也表现出相似的结果。这种结果与前面特异性条带所反映的关系相一致，也说明分子标记分析除了对选育群体的遗传变异分析十分重要之外，还可以有效地用于追溯不同罗非鱼群体的历史渊源。
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表 1 5对AFLP引物组合的检测结果
Table 1 Result of 5 AFLP primer pairs
引物组合
primer pair总带数
total bands单态性条带数
monomorphic bands多态性条带数
polymorphic bands多态带百分数/%
percent of polymorphic bandsE-AAG/M-CAG 52 24 28 53.85 E-ACA/M-CAC 34 18 16 47.06 E-ACA/M-CAG 54 21 33 61.11 E-AAG/M-CAC 55 28 27 49.09 E-ACA/M-CAT 50 23 27 54.00 合计 total 245 114 131 平均 average 49.00 22.80 26.20 53.02 
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表 2 不同群体的特异性AFLP标记
Table 2 Specific bands of three tilapia lines
特异性条带
specific band新吉富罗非鱼
New Gift tilapia吉诺玛罗非鱼
GenoMar tilapia奥尼罗非鱼
O.niloticus ♀ ×O.aureus ♂E-ACA/M-CAT-1044 × × √ (14/20) E-ACA/M-CAT-954 × √ (4/20) √ (8/20) E-ACA/M-CAT-690 √ (20/20) √ (20/20) × E-ACA/M-CAT-686 × × √ (13/20) E-ACA/M-CAT-402 × × √ (19/20) E-ACA/M-CAT-304 √ (11/20) √ (6/20) × E-ACA/M-CAT-298 × × √ (20/20) E-ACA/M-CAG-1650 × × √ (16/20) E-ACA/M-CAG-420 × × √ (13/20)
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表 3 3个罗非鱼群体的遗传多样性
Table 3 Genetic diversity of three cultured tilapia lines
种类
species多态位点/%
percent of polymorphic bands平均基因多样性
average gene diversity Shannon多样性指数
Shannon diversity index新吉富罗非鱼 New Gift tilapia 32.35 0.1605 0.2481 吉诺玛罗非鱼 GenoMar tilapia 30.61 0.1595 0.2656 奥尼罗非鱼
O.niloticus ♀ ×O.aureus ♂36.24 0.2214 0.2983
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表 4 3个罗非鱼群体的Nei遗传相似性系数(左上角)及遗传距离(右下角)
Table 4 Nei′s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (underneath diagonal) of three cultured tilapia lines
新吉富罗非鱼 吉诺玛罗非鱼 奥尼罗非鱼 新吉富罗非鱼 New Gift tilapia - 0.9567 0.9088 吉诺玛罗非鱼 GenoMar tilapia 0.0474 - 0.9224 奥尼罗非鱼 O.niloticus ♀ ×O.aureus ♂ 0.0992 0.0839 -
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