Depuration processes of transgenic fish inbred strain
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摘要:
外源基因(双链DNA)作为外显子可能整合在一条染色体上的不同DNA链上,转基因鱼的第一代为嵌合体。三杂交纯化过程方可获得转基因鱼纯合体:嵌合体与纯系个体两次回交,获得杂合子单一的杂合体;第二代杂合体自交可以获得纯合体。
Abstract:Foreign gene (double stranded DNA) is maybe integrated in different DNA strand of the same chromosome as an exon. The first generation of transgenic fish is mosaic. The homozygote generation of transgenic fish is maybe obtained by the three-cross depuration process. The heterozygote generation with single heterozygosis is obtained by twice backcross mating between mosaic and pure individual. Finally, the homozygote generation is obtained by self-cross mating of the second heterozygote.
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Keywords:
- transgenic fish /
- mosaic /
- heterozygote /
- homozygote
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目前,各国实验室对一些有应用价值的小型实验模式鱼类进行了纯化培育工作,如斑马鱼(Danio rerio)、虹鳉(Poecilia reticulatus)、青鳉(Oryzias latipes)、新月鱼(Xiphophorus maculatus)以及剑尾鱼(Xiphophorus helleri)等都有近交超过20代的品系,这些品系已经有较高的遗传均一性,为转基因鱼研究提供了基础材料[1]。我国在淡水养殖鱼类转基因的研究方面也取得较好成绩,但在鱼类繁育体系建立和品系培育方面,通常按种质标准参数进行选育种及原种入库,定期按种质标准更换亲鱼。转基因鱼模型的研究,通过对鱼类染色体(基因组)的定向改造,可以获得高产、优质、抗逆的鱼类养殖新品系。因此,具有稳定遗传性和遗传均一性的转基因鱼品系的纯化显得尤为重要。
外源基因导入受体细胞(细胞质或细胞核)有多种方法[2]。目前主要有显微注射、电脉冲(电穿孔)、精子携带、磷酸钙共沉淀、脂质体融合、逆转录病毒转染、微弹轰击、激光介导、基因枪(粒子枪)等方法。基因或DNA的注射研究方法,从一开始就是转基因的主要研究方法。早在20世纪60年代,芒罗(Munro)将具有特殊脚爪特征的矮脚鸡DNA注入到白色来航鸡的卵巢中,得到具有矮脚鸡脚爪特征的来航鸡后代,第一次证实了外源基因在受体中具有生物功能。20世纪80年代初,人们成功地用显微注射法向动物生殖细胞转移外源基因,建立了第一个转基因小鼠模型。经过几十年的研究与发展和各国科学家的共同努力,显微注射方法已经从样品获取与处理、注射针制备与处理、样品的固定、注射仪结构、动力传送与缓冲系统、DNA的注射浓度与体积、注射针的插入与定点、实时监视器、立体显微镜等方面有了明显进步与改善,相关的仪器和设备产品不断出现与改进。虽然其它的基因导入方法有这样或那样的优点,但从目前转基因研究的大量文献与资料的统计数据来看,显微注射方法仍是目前广泛使用、技术成熟、效果最好的一种基因导入方法[3]。而其它转基因方法仍处于初级或研发阶段,尚有很多待以改进之处。
外源基因整合进入鱼类性腺组织细胞的染色体上之后,如果胚胎及鱼体发育正常并且外源基因表达也正常,通常外源基因(双链DNA)作为外显子可能整合在一条染色体上的不同DNA链上,实际上该转基因鱼的第一代(F0)为嵌合体群体。需要指出的是,在初次获得的转基因鱼嵌合体中,若外源基因整合到非性腺组织细胞的染色体上,外源基因的表达只是胚胎中含有亲本(性)细胞中残留的部分外源基因,其在胚胎的发育过程中逐渐消失,不是真正的转基因子代(嵌合体)[3]。
要想获得转基因鱼的纯合体群体,一般需要进行三杂交的纯化过程(图 1)。第一步,从实验鱼的纯系群体中获得纯种后代个体(AA),转入外源基因后获得嵌合体群体。即:AA × AA(纯系个体)→AA+(外源基因导入)→F0 (嵌合体)。第二步,嵌合体与纯系个体回交,获得第一代杂合体(F1a)群体;随机选择第一代杂合体个体再次与纯系个体回交,获得第二代杂合体(F1b)群体。即:F0 (嵌合体)× AA→F1a(杂合体)× AA→F1b(杂合体)。第三步,第二代杂合体(F1b)自交,经过筛选可以获得具有稳定遗传性和遗传均一性的纯合体(F2)。即:F1b(杂合体)× F1b(杂合体)→F2(纯合体)。
三杂交的纯化过程中有3个问题需要说明,一是进行2次与原种亲本(纯系个体)回交的目的是可以获得杂合子单一的杂合体群体,从而保证了以后杂合子单一的杂合体自交而获得纯合体群体;二是第一次回交获得杂合子不纯的2种基因型(F1a(a)和F1a(b))杂合体的群体,若在这样的群体中杂交,只能产生杂合子不纯的多种基因型杂合体的群体;三是三杂交的纯化过程中不考虑雌性(♀)和雄性(♂)个体,因为选用的原种亲本(纯系个体)、嵌合体和杂合体转基因鱼进行回交和自交,无论雌性(♀)或雄性(♂)个体均是同样情况。
由于现阶段转基因技术的某些限制和实验中的一些非技术因素(如外源单链DNA和环状DNA在转基因过程中的整合行为差异、外源DNA载体和启动子某些功能的不明确性以及外源DNA序列可能出现的序列变异或置换等),外源基因或DNA并非定点整合在染色体的某一位点上[4]。因此,在某一条转基因鱼的同一条染色体臂上可能出现单个位点和多个位点随机整合的情况;在减数分裂过程中,还有姐妹染色单体交换的各种情况等等,使得在实验中的三杂交纯化过程变得更加复杂。图 1的纯化模式图只是简单地模拟理想转基因鱼的三杂交纯化过程,虽然多位点随机整合和姐妹染色单体交换出现的几率目前尚无法确定,转基因子代鱼也由于外源基因的整合破坏了正常基因的表达导致胚胎发育异常而死亡的几率较大,通过三杂交纯化过程获得转基因鱼的纯合体群体仍是一个值得借鉴的实验手段。
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