The construction of pituitary gland cDNA library of Nibea coibor
-
摘要:
以浅色黄姑鱼脑垂体为材料,应用SMARTTM cDNA library construction技术,构建以真核表达载体pcDNA3.1 (+) 为基础的浅色黄姑鱼cDNA文库。利用含SfiⅠB酶切位点的oligo(dT)引物合成cDNA第一链,利用含SfiⅠA酶切位点的SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA5′端延伸出去的模板,采用LD PCR引物合成双链cDNA,双链cDNA用SfiⅠ酶切和过柱分级分离后,与引入SfiⅠ酶切位点的pcDNA3.1 (+) -Sfi Ⅰ 载体进行连接,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,构建成脑垂体全长cDNA文库。经过质量鉴定,得到的原始cDNA文库含有约1×105个重组子,重组率为90%,插入cDNA片段长度范围约为0.4~3 kb。研究为深入开展浅色黄姑鱼的生长发育相关基因的研究奠定了良好的基础。
Abstract:A cDNA expression library from the pituitary gland of Nibea coibor was constructed into pcDNA3.1 (+) eukarytical expression plasmid using SMARTTM cDNA library construction protocol. The anchor first strand cDNA containing asymmetrical SfiⅠ restriction enzyme sites (A & B) was synthesized by transcription of total RNA with the SMART technique. The long-distance(LD PCR) was performed using a modified oligo(dT) prime and anchor prime as the prime set, and anchor fist-strand cDNA as the template to enrich the cDNA population for full-length sequences. After digestion with SfiⅠ and size fractionation using CHROM SPIN-400 column, SMART cDNA was ligated into the SfiⅠ-digested pcDNA3.1 (+) -SfiⅠ vector and transferred into the competent cells of Escherichia coli TOP10 strain. The obtained N.coibor cDNA library contains 1.0×105 recombinants, the percentage of vectors with inserts was 90% and the average insert size was between 0.4~3.0 kb. The N.coibor cDNA library gives an ideal base for further study structure and characterization of the gene in relation to growth and development of N.coibor.
-
Keywords:
- cDNA library /
- Nibea coibor /
- pituitary gland
-
浅色黄姑鱼(Nibea coibor)隶属于鲈形目(Perciformes),石首鱼科(Sciaenidae),黄姑鱼属(Nibea)[1]。该鱼肉质细嫩、口感独特、味道鲜美,其鱼鳔可制成滋补养颜的鱼胶。因其生长速度快、抗病力强、适应性广,现已成为我国海水网箱养殖积极推广的优良品种之一。目前对浅色黄姑鱼的研究仅局限于生物学特性和人工繁殖技术方面[2-3]①,养殖技术体系不完善,种质资源和基因资源开发利用研究未见报道。为了保存和利用浅色黄姑鱼基因资源,开发其生长发育相关基因,深入研究其生长发育的分子调控机制,本研究以浅色黄姑鱼脑垂体为材料,构建了全长cDNA表达文库。
① 麦贤仕, 张健生, 陈楷亮, 等. 浅色黄姑鱼人工健康育苗技术[J]. 水产科技, 2004(4):29-30.
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料鱼
浅色黄姑鱼取自广东省饶平县水产养殖场,体重约450 g。
1.1.2 质粒和菌种
哺乳动物细胞高效表达载体质粒pcDNA3.1 (+) 为本实验室保存;pMD18-T Vector购自大连宝生物工程公司;Escherichia coli TOP10为本实验室保存。
1.1.3 试剂和酶
SMARTTM cDNA library construction Kit购自Clontech公司。总RNA提取试剂TRIzol reagent购自Invitrogen公司。质粒提取和胶回收试剂盒为V-gene产品,各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶为Takara产品。其余均为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 载体质粒pcDNA3.1 (+) -SfiⅠ的构建
用质粒DNA提取试剂盒提取pcDNA3.1 (+) 质粒,经限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ酶切后,进行琼脂糖凝胶电泳,按V-gene公司的DNA Gel Extraction Kit说明书操作,割胶回收上述酶切载体DNA;为引入SfiⅠ酶切位点,以pλTripIEx2为模板(其为另一研究而构建的含SfiⅠ酶切位点的载体),用SMARTTM Kit中测序引物进行PCR扩增后,回收PCR产物,方法同上;回收后的PCR产物经EcoRⅠ和NotⅠ酶切,并回收。T4 DNA连接酶连接经EcoRⅠ和NotⅠ酶切的pcDNA3.1 (+) 载体DNA和PCR产物构建成pcDNA3.1 (+) -SfiⅠ质粒。提取pcDNA3.1 (+) -SfiⅠ质粒,用SfiⅠ酶切后,割胶回收酶切产物,方法同上;载体DNA以50 ng · μL-1的浓度-20℃保存备用。
1.2.2 浅色黄姑鱼总RNA的提取
活体解剖浅色黄姑鱼,取其脑垂体,用Trizol试剂同步提取总RNA,具体操作按Trizol说明书进行。
1.2.3 浅色黄姑鱼第一链cDNA的合成
按CLONTECH公司SMARTTMcDNA文库构建试剂盒说明书操作,进行第一链cDNA合成:在5 μL反应体系中加入下列组分:0.05~1 μg浅色黄姑鱼总RNA,SMART Ⅳ寡核苷酸和CDS III/3′PCR引物各1 μL,加原子级灭菌水至5 μL,混合均匀,短暂离心;72℃温育2 min后冰浴2 min,短暂离心;再依次加入2 μL的5×first strand buffer、1 μL的20 mmol · L-1 DTT、1 μL的10 mmol · L-1的dNTP混合液和1 μL的PowerScriptTM反转录聚合酶,混合均匀并作短暂离心;42℃反应1 h,逆转录合成第一链cDNA,冰浴终止反应。
1.2.4 LD PCR扩增第二链cDNA
在100 μL的反应体系中依次加入下列组分:2 μL的第一链cDNA,80 μL的灭菌H2O,10 μL的10×cDNA PCR缓冲液,2 μL的10 mmol · L-1dNTP混合液,2 μL的20 μmol · L-15′PCR引物,2 μL的20 μmol ·L-1 CDSIII/3′PCR引物,2 μL的50×advantage cDNA polymerase mix,将反应物混和均匀,短暂离心,放入预热至95℃的PCR仪,运行下列程序:在95℃加热1 min,进入循环程序:95℃ 15 s、68℃ 6 min,共进行24个循环,冷却至4℃;取5 μL PCR产物在1.1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测,剩余PCR产物在-20℃保存。根据电泳结果决定是否需要补加循环次数。
1.2.5 cDNA的纯化、消化和连接反应
取上述扩增的双链cDNA 50 μL,加入2 μL蛋白酶K(20 μg · μL-1),混匀离心,45℃温育20 min将蛋白酶K活性灭活,加入50 μL H2O,分别通过等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提DNA 1次,醋酸钠、糖原和酒精共沉淀后,80%酒精清洗1遍,风干后溶解于79 μL的水中,加入10 μL SfiⅠ(20 U · μL-1),10 μL 10×SfiⅠ缓冲液及1 μL 100×BSA,使总体积达100 μL,于50℃酶切2 h。酶切产物使用CHROMA SPIN-400柱进行分级分离,收集1~16管,每管1滴。分别取3 μL在1.1%琼脂糖凝胶上150 V电泳10 min。收集片段符合建库大小的前4管,混合后加入醋酸钠,糖原和酒精共沉淀后,将沉淀出的cDNA用7 μL灭菌原子级水溶解。
1.2.6 cDNA文库的构建
T4 DNA连接酶连接上述分别经SfiⅠ酶切处理好的pcDNA3.1 (+) -SfiⅠ载体和cDNA,连接反应分别采用1:0.5、1:1、1:1.5的体积比,于16℃连接过夜。连接产物高效转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。转化产物则被分为2部分,其中一部分经半固体琼脂糖培养基扩增后,提取质粒,作为cDNA表达文库总库保存于25%甘油中,-70℃冻存;另一部分涂布平板,4℃保存备用。
1.2.7 插入片段的PCR鉴定
随机挑选文库克隆,扩大培养,取细菌培养液为模板,以插入片段两侧载体序列T7和BGH-RV作引物,进行PCR扩增,鉴定其插入片段的大小。
2. 结果
2.1 浅色黄姑鱼总RNA的提取
用Trizol试剂抽提总RNA提取后,用紫外荧光光度计测定光密度OD260和OD280值,结果OD260/OD280为1.84;用1.2%琼脂糖凝胶电泳,其结果显示(图 1),18S、28S rRNA条带清晰,比例恰当。这表明组织总RNA完整性良好,可用于cDNA文库的构建。
2.2 载体pcDNA3.1 (+) -Sfi Ⅰ 的构建
首先以含SfiⅠ酶切位点的pλTripIEx2为模板,扩增出含有SfiⅠ酶切位点的PCR产物,其片段大小在1 100 bp左右(图 2)。再用EcoRⅠ和NotⅠ分别酶切含SfiⅠ酶切位点的PCR产物和质粒pcDNA3.1 (+),分别割胶回收酶切产物。从图 2和图 3的电泳结果可以看出,经过EcoRⅠ和NotⅠ酶切,其PCR产物和质粒pcDNA3.1 (+) 都比相对应的片段长度小,说明其酶切结果是成功的,可用于下一步实验。最后用T4DNA连接酶连接两者,转化TOP10感受态细胞,涂LB(含Amp+)平板,37℃过夜培养。随机挑选克隆培养,用PCR筛选阳性克隆。用载体两端的引物进行PCR扩增都可以扩出相应大小的片段,说明成功转化连接产物。然后,扩大培养提取pcDNA3.1 (+) -SfiⅠ质粒,用SfiⅠ酶切,可以酶切出一条1 000 bp左右的插入片段,说明已经在载体pcDNA3.1 (+) 中成功的引入SfiⅠ酶切位点,可以用于后续的文库构建。为了确保后续实验的顺利,构建好的pcDNA3.1 (+) -SfiⅠ质粒送到博亚生物公司测序,进一步确定是否已经成功引入SfiⅠ酶切位点。其测序结果证实:在载体pcDNA3.1 (+) 中成功引入了SfiⅠ酶切位点。最后,构建好的载体DNA以50 ng ·μL-1的浓度-20℃保存备用。
2.3 cDNA的合成
取1 μg总RNA直接进行逆转录合成第一链cDNA,反应体系10 μL,取2 μL第一链产物通过LD PCR法扩增富集cDNA,取5 μL PCR产物在1.1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测(图 4),剩余PCR产物在-20℃保存,根据电泳结果再增加4个循环,第二链cDNA合成共进行28次循环。最后留取一半cDNA于-70℃保存备用,另一半经酶切消化和柱回收得到7 μL的双链cDNA。LD PCR产物电泳结果呈现从大到小均匀的smears带,没有特征带,大小在0.1~4.0 kb范围内,主要集中于0.5~2.0 kb之间,这表明可满足构建cDNA文库的要求。
2.4 cDNA分级分离柱的纯化分析
在cDNA分级分离过程中,cDNA片段从第4管以后流出,小片段的DNA从第9管开始出现,因此,收集cDNA片段大于500 bp的第5~8管可以确保cDNA文库的质量。
2.5 cDNA文库的容量和片段长度检测
将制备的cDNA克隆到载体中, 需要考虑的关键问题是cDNA和载体pcDNA3.1 (+) -SfiⅠ的连接比例,在本实验中体积比在1.5:1时能更好地产生有效的重组体。本文库的原始库容量约为1×105重组子。
随机挑选单克隆进行菌落PCR鉴定,其结果显示,所插入的片段主要集中于700~1 500 bp之间,这与第二链cDNA电泳结果相吻合。由文库的克隆混合物为模板做PCR反应,扩增的smears带范围均分布在0.5~3.0 kb之间(图 5);其中文库总质粒经SfiⅠ酶切的总库质粒也呈现0.4~3.0 kb的均匀smears涂布;与菌落PCR结果基本一致,由菌落PCR推算出文库的重组率为90%。
3. 讨论
总RNA的完整性是获得高质量的cDNA文库的关键。WILFINGER等认为纯的RNA的OD260/OD280值应在1.9~2.1(10 mmol · L-1 Tris.Cl,pH 7.5);但当pH小于7.5时,OD260/OD280值也相应降低[3]。因为本实验中用DEPC水(pH < 7.5)溶解总RNA,故其OD260/OD280值偏低是正常的,符合cDNA文库的构建要求。
构建cDNA文库[4-8]的载体主要有质粒、噬菌体和噬菌粒3种。三者各有优缺点,可根据不同的目的选用。本文采用的是质粒pcDNA3.1 (+) 可算是第一代载体,它具有易于操作、重组效率高,可以直接进行功能表达筛选等优点。同时,在本实验中为了使cDNA可定向直接插入载体pcDNA3.1 (+),在其载体中引入SfiⅠ酶切位点,保证了所构建的文库既适于用核酸探针筛选,也可作为表达文库用抗体进行免疫学筛选。
本研究采用SMARTTM cDNA library construction技术构建浅色黄姑鱼脑垂体cDNA文库,具有RNA所用样品少,可直接从总RNA出发合成cDNA以及通过LD PCR方法富集全长cDNA片段等的优点;同时,还可通过常规电泳对每一步骤进行实时检测。另外,将cDNA组分通过Chroma Spin-400柱分离时,可根据分子量的大小分管收集cDNA;选择分子量大的cDNA,可以提高文库全长cDNA克隆比例,减少筛选的工作量。
在cDNA文库的构建中,合成全长的cDNA双链在基因的筛选和表达过程中是至关重要的。决定cDNA第一链合成质量的要素,除了前已述及的模板mRNA的质量外,便是反转录酶和引物。实验中我们采用了SMARTTM cDNA library construction试剂盒中的提供的PowerScriptTM RT,此酶不含RNaseH活性,更能保证cDNA第一链的全长和高产。反转录的引物常用Oligo(dT)12~18和随机六聚体核苷酸。本实验用Oligo(dT)12~18(CDS III/3′PCR Primer)引物,它能有效地从mRNA的3′端开始反转录,能合成大部分全长cDNA。但对于那些分子量较大而又有较长3′端非编码序列的mRNA来说,难以得到包括5′端编码区的全长cDNA[9]。在第一链合成中还用SMART IV Oligonucleotide作为mRNA5′端延伸出去的模板。
在cDNA文库的构建中,以400 bp以上的cDNA构建cDNA文库是最佳的选择,小于200 bp DNA片段虽然能增加重组子数量,提高文库滴度,但这将极大地增加下一步筛选的工作量,而且高滴度文库其重组率往往低,高重组率文库其滴度又往往低[9]。因而,构建cDNA文库应选择适当大小的cDNA。本实验为了获得高质量的重组率和减少筛选的工作量,选择400 bp以上的cDNA构建cDNA文库,故其重组数偏低。
-
图 5 文库总菌液PCR检测插入cDNA范围电泳图
M1. 100 bp DNA分子量标准;M2. 1 kb DNA marker;1. 总文库菌液PCR产物
Figure 5. Gel electrophoresis of PCR results from the total library plasmids with T7 and BGH-RV primers
M1. 100 bp DNA marker; M2. 1 kb DNA marker; 1. PCR results from the total library plasmids with T7 and BGH-RV primers
-
[1] 福建鱼类志编写组. 福建鱼类志(下卷)[M]. 福州: 福建科学技术出版社, 1985: 118-119. https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=53a48ef74d12566aabcad12db0e4cdce [2] 沈卓坤, 黄玮, 黄培铃. 浅色黄姑鱼人工繁殖与苗种培育技术[J]. 水产养殖, 2004, 25(5): 6-7. doi: 10.3969/j.issn.1004-2091.2004.05.003 [3] 马长艳, 周开亚, 郭豫杰, 等. 中华绒螯蟹卵巢差减cDNA文库的构建[J]. 动物学研究, 2003, 24(1): 53-56. https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=e4ccfb1630b4b4e32cec16bfe2154af9&site=xueshu_se&hitarticle=1 [4] 陈慧萍, 姜孝玉, 徐洪滨, 等. 金钱鱼毒腺cDNA表达文库的构建及EST序列分析[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2004, 20(2): 166-170. doi: 10.3969/j.issn.1007-7626.2004.02.005 [5] 王艺磊, 张子平. 日本对虾精巢和卵巢全长cDNA文库的构建[J]. 动物学杂志, 2003, 38(2): 9-13. doi: 10.3969/j.issn.0250-3263.2003.02.003 [6] 王维新, 史成银, 黄捷. 中国明对虾鳃细胞全长cDNA文库的构建[J]. 海洋水产研究, 2004, 25(5): 6-11. doi: 10.3969/j.issn.1000-7075.2004.05.002 [7] 万榕, 宋军, 林旭, 等. 中华眼镜蛇毒腺cDNA表达文库的建立和分析[J]. 第四军医大学学报, 2004, 25(13): 1208-1211. doi: 10.3321/j.issn:1000-2790.2004.13.017 [8] 黄英, 张宗玉. cDNA文库构建策略[J]. 国外医学分子生物学分册, 1999, 21(6): 337-340. https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/Ch9QZXJpb2RpY2FsQ0hJTmV3UzIwMjQxMTA1MTcxMzA0Eg5RSzE5OTkwMDE3NDQzORoINGkxdzkxOTc%3D [9] 傅作申, 程远国, 张玉静, 等. 用长距PCR法构建恶性疟原虫cDNA表达文库[J]. 热带医学杂志, 2002, 2(3): 225-229. doi: 10.3969/j.issn.1672-3619.2002.03.004