The construction of pituitary gland cDNA library of Nibea coibor
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摘要:
以浅色黄姑鱼脑垂体为材料，应用SMARTTM cDNA library construction技术，构建以真核表达载体pcDNA3.1 (+) 为基础的浅色黄姑鱼cDNA文库。利用含SfiⅠB酶切位点的oligo(dT)引物合成cDNA第一链，利用含SfiⅠA酶切位点的SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA5′端延伸出去的模板，采用LD PCR引物合成双链cDNA，双链cDNA用SfiⅠ酶切和过柱分级分离后，与引入SfiⅠ酶切位点的pcDNA3.1 (+) -Sfi Ⅰ 载体进行连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，构建成脑垂体全长cDNA文库。经过质量鉴定，得到的原始cDNA文库含有约1×105个重组子，重组率为90%，插入cDNA片段长度范围约为0.4~3 kb。研究为深入开展浅色黄姑鱼的生长发育相关基因的研究奠定了良好的基础。
Abstract:A cDNA expression library from the pituitary gland of Nibea coibor was constructed into pcDNA3.1 (+) eukarytical expression plasmid using SMARTTM cDNA library construction protocol. The anchor first strand cDNA containing asymmetrical SfiⅠ restriction enzyme sites (A & B) was synthesized by transcription of total RNA with the SMART technique. The long-distance(LD PCR) was performed using a modified oligo(dT) prime and anchor prime as the prime set, and anchor fist-strand cDNA as the template to enrich the cDNA population for full-length sequences. After digestion with SfiⅠ and size fractionation using CHROM SPIN-400 column, SMART cDNA was ligated into the SfiⅠ-digested pcDNA3.1 (+) -SfiⅠ vector and transferred into the competent cells of Escherichia coli TOP10 strain. The obtained N.coibor cDNA library contains 1.0×105 recombinants, the percentage of vectors with inserts was 90% and the average insert size was between 0.4~3.0 kb. The N.coibor cDNA library gives an ideal base for further study structure and characterization of the gene in relation to growth and development of N.coibor.
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Keywords:
- cDNA library /
- Nibea coibor /
- pituitary gland
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鱼类外周血细胞是机体细胞免疫和体液免疫的重要组成部分，是快速诊断疾病的有效指标，因而，研究鱼类外周血细胞形态、数量和分布非常重要，也是研究免疫功能的基础。目前，包括鱼类在内的非哺乳类脊椎动物的血液学研究开展十分广泛，已有许多学者先后对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)[1]、鲷(Acanthopagrus australis)[2]、鳜(Siniperca chuatsi)[3]和南方鲇(Silurus meridionalis)[4]等血细胞进行过显微结构研究，有的还深入到了亚显微水平和组织化学水平。军曹鱼(Rachycentron canadum)亦称海鲡，属于鲈形目、军曹鱼科、军曹鱼属，生长在热带、亚热带海洋水域，为暖水性鱼类，近年来已经成为南方主要的名优海水养殖品种，是目前海水网箱养殖中生长速度最快，个体最大，最有推广前景的鱼类[5]。本文以军曹鱼外周血液为材料，利用光镜技术研究了其血细胞的种类和形态，将加深对军曹鱼血液有形成分的理解。
1. 材料与方法
军曹鱼取自南海水产研究所三亚热带研究开发中心实验基地，人工池养，鱼龄为出膜后第60天，健康无病，共20尾。从心脏采血，利用其中10尾的血液做血红蛋白含量的测定、红细胞计数、白细胞计数，按照陈其才等[6]缩编的生理学试验提供的血液指标测定的方法进行；另外10尾的血液做血细胞涂片，将血液直接在洁净载玻片上涂片，晾干后，按常规Wright氏和Giemsa-Wrigh氏复染法染色，用Leica显微镜在油镜下观察、测量细胞大小(长径×短径)，取测量的平均值。每尾鱼选2张血涂片，对其上的200个白细胞进行分类计数。
2. 结果
2.1 血细胞种类组成
军曹鱼稚鱼血红蛋白的测定、红细胞计数、白细胞计数、白细胞分类计数和各类血细胞的大小见表 1、表 2、表 3。
表 1 军曹鱼稚鱼的部分血液指标(n=10)Table 1. The hematological indices of juvenile cobia血液指标
hematological indices平均值±标准差
means±SD血红蛋白/mg·mL-1
hematolobin8.12±0.87 红细胞数/×109 ind·mL-1
erythrocyte count2.97±0.82 白细胞数/×106 ind·mL-1
leucocyte count1.39±0.94 表 2 红细胞的大小(n=100)Table 2. The sizes of erythrocytesμm 参数
parameters细胞长径
long diameter of cell细胞短径
short diameter of cell核长径
long diameter of nuclei核短径
short diameter of nuclei红细胞
erythrocyte10.61±0.95 7.90±0.48 5.93±1.07 3.12±0.52 表 3 白细胞分类计数(n=2 000)和各类白细胞的大小(n＝10)Table 3. Differential leucocytes counts and the sizes of different blood cells参数
parameters小淋巴细胞
small lymphocyte大淋巴细胞
large lymphocyte嗜中性粒细胞
neutrophil单核细胞
monocyte血栓细胞
thrombocyte白细胞分类计数
leucocytes counts53.00±8.511 7.59±4.28 4.78±1.372 4.63±4.08 细胞长径/μm
long diameter of cell5.35±1.041 1.72±1.661 1.42±1.401 1.04±0.98 6.49±1.44 细胞短径/μm
short diameter of cell5.10±0.271 0.28±1.161 0.93±0.80 9.70±0.71 4.76±0.82 核长径/μm
long diameter of nuclei4.95±0.91 9.90±0.74 6.32±1.08 8.21±1.63 5.24±1.23 核短径/μm
short diameter of nuclei4.70±0.84 9.10±0.34 5.41±0.77 6.40±0.94 3.90±0.79 2.2 血细胞的显微结构
血涂片分别用Wright氏和Giemsa-Wrigh氏复染法染色，Wright氏染色剂使胞浆尤其是中性粒细胞的颗粒着色清晰，Giemsa氏染色剂使胞核着色清晰，各类血细胞在2种染色剂下的着色反应一致。军曹鱼稚鱼外周血涂片，在光镜下可区分出红细胞和各种白细胞，椭圆形的红细胞占绝大多数，少数单个或三五成群的白细胞分散于密集的红细胞之间。按Ehrlisk的标准[7]可将外周细胞分为血栓细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性白细胞。军曹鱼稚鱼外周血白细胞群的构成特点是以淋巴细胞为主，血栓细胞较多，单核细胞较少，在血涂片上未见嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
2.2.1 红细胞
军曹鱼稚鱼外周血涂片中成熟红细胞呈椭圆形，表面光滑，核卵圆形，位于细胞中央，核内含有致密染色质团块，呈深紫红色，胞质内充满血红蛋白，呈均匀的浅紫红色或浅橘红色，核周与胞质交界处有半透明的薄环。未成熟红细胞形状与成熟的有所差别，细胞呈圆形，其核也较圆，染色相对于成熟红细胞浅，细胞质也浅于成熟的红细胞。幼稚红细胞数量较少，胞体及胞核略大于成熟红细胞(图版Ⅰ-1)。血涂片中偶尔而可见呈分裂状态的红细胞，可见到核分裂的现象(图版Ⅰ-2)。
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图版Ⅰ 1. 未成熟的红细胞瑞氏染色×2 000；2. 即将分裂的红细胞瑞氏-姬姆氏复染色×1 500；3. 成群的血栓细胞瑞氏-姬姆氏复染色×1 500；4. “蝌蚪状”血栓细胞瑞氏染色×2 000；5. 椭圆形的血栓细胞瑞氏染色×2 000；6. 纺锤状血栓细胞瑞氏染色×2 000；7. 有伪足样突的小淋巴细胞瑞氏染色×2 000；8. 缺核小淋巴细胞瑞氏染色×2 000；9. 有微绒毛突起的大淋巴细胞瑞氏-姬姆氏复染色×2 000；10. 核呈马蹄形的单核细胞瑞氏-姬姆氏复染色×1 500；11. 核呈月牙形的单核细胞瑞氏染色×2 000；12. 核呈不规则形单核细胞瑞氏染色×2 000；13. 核呈两分叶的中性粒细胞瑞氏-姬姆氏复染色×2 000；14. 核呈卵圆形的中性粒细胞瑞氏-姬姆氏复染色×2 000；15. 核呈肾形的中性粒细胞瑞氏-姬姆氏复染色×1 500图版Ⅰ. 1. immature erythrocyte Wright′s staining×2 000; 2. dividing erythrocyte Wright-Giemsa′s staining×1 500; 3. group of thrombocytes Wright-Giemsa′s staining×1 500; 4. "tadpole shape" thrombocyte Wright′s staining×2 000; 5. "oval shape" thrombocyte Wright′s staining×2 000; 6. "spindle shape" thrombocyte Wright′s staining×2 000; 7. small lymphocyte with pseudopodia Wright′s staining×2 000; 8. small lymphocyte with fragmentary nucleus Wright′s staining×2 000; 9. large lymphocyte with pseudopodia Wright-Giemsa′s staining×2 000; 10. monocyte with "horse′s hoof shape"nucleus Wright-Giemsa′s staining×1 500; 11. monocyte with "crescent shape"nucleus Wright′s staining×2 000; 12. monocyte with deformed nucleus Wright′s staining×2 000; 13. neutrophil with bilobed nucleus Wright-Giemsa′s staining×2 000; 14. neutrophil with round nucleus Wright-Giemsa′s staining×2 000; 15. neutrophil with "kidney shape" nucleus Wright-Giemsa′s staining×1 5002.2.2 白细胞
军曹鱼稚鱼外周血涂片中只能观察到白细胞中的血栓细胞、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞。
血栓细胞在血涂片中可见到多种形态，三五成群或更多集合在一起，呈“岛屿”状，圆形或不规则形，核质比大，染色质致密呈深蓝色(图版Ⅰ-3)；或是单个或成对存在，胞体卵圆形，一端的胞质向外突起，呈蝌蚪状，胞核占细胞的大部分，突起的胞膜内充满淡红色的胞质(图版Ⅰ-4)；或是单个分布，胞体椭圆形或棒状(图版Ⅰ-5)；或是单个存在，胞体纺锤形，只在长轴两端有少量胞质，中间处与核膜几乎相切(图版Ⅰ-6)。
淋巴细胞根据形状大小可分为大淋巴细胞和小淋巴细胞。小淋巴细胞呈圆形或不规则形，有明显的伪足样胞突，核较大，占细胞2/3以上，被染成深蓝紫色，胞质呈弱碱性而被染成浅蓝色，容易与核的染色混淆(图版Ⅰ-7)。有的在胞质较多的一侧有缺刻，中位或偏于一侧，有时与血栓细胞难以区分，特别是当血栓细胞的长径较短时(图版Ⅰ-8)。大淋巴细胞呈圆形，表面有许多微绒毛突起，核很大，紫色的染色质呈粗网状，几乎占满整个胞质(图版Ⅰ-9)。
单核细胞呈圆形、卵圆形或椭圆形，常有伪足样胞质突起。核呈卵圆形、马蹄形、不规则的多边形，亦有近月牙形等，一般占整个细胞的1/3以上，多偏于一侧，也有位于中央位或略偏于中央位。染色质疏网状，染成紫红色。胞质较丰富，染成淡蓝色，有些略微夹杂浅红色(图版Ⅰ-10~12)。
中性粒细胞的细胞形态多样，呈圆形、卵圆形、椭圆形，以卵圆形居多，边缘常有波纹状小突起。核较大，形状多样，呈圆形、椭圆形、肾形、哑铃形和分叶状等，胞核常占整个细胞的1/4~1/3，偏于细胞的一侧，常与质膜相切。核染成浅紫红色，胞质丰富，染成浅蓝至浅粉红色，其中充满淡紫红色小颗粒。中性粒细胞与单核细胞有时难以区分，但前者胞体较大，胞核较小，不超过整个细胞的1/3，胞核和胞质染色比单核细胞浅(图版Ⅰ-13~15)。
3. 讨论
3.1 血细胞的组成和大小
对白细胞分类计数发现，淋巴细胞最多，大约占白细胞的总数的53%，其次是血栓细胞，大约占24%，嗜中性粒细胞大约占17%，最少的是单核细胞，仅占5%左右，没有发现嗜酸性和嗜碱性粒细胞，可能是此类细胞含量稀少或由于其本身在制作血涂片时容易被破坏所致。陈刚等[5]对军曹鱼血液指标的测定结果与本文有一些差异，作者所测的红血球与白血球的比值较高，前者所测的血栓细胞在白细胞中所占的比率最高(大约61%)，而淋巴细胞(大约17%)与嗜中性粒细胞(大约16%)比率相当，因为本实验用鱼日龄较小，结果上的差异可能与鱼体大小和其生长的环境有关。各类白细胞所占的比例，不同文献报道极不一致[3, 8]，主要反映在淋巴细胞和血栓细胞所占的比例上，至于其他的白细胞则因数量较少而所占比例相差不是很明显。造成淋巴细胞和血栓细胞比例相差悬殊的原因可能有以下几个方面，有的学者在计数时把血栓细胞算在淋巴细胞内，因而淋巴细胞比例显著提高并成为最丰富的白细胞[9]；淋巴细胞对外界环境变化比较敏感，因而采血时鱼体所处的状态不同，就有可能造成种间或个体间的差异[3]。至于各类细胞的大小，与已报道的基本一致，血栓细胞和小淋巴细胞较小，单核细胞和粒细胞较大。有文献报道鱼类红细胞未进一步分化，所以比白细胞要大[10]，但本试验中可以看到大淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞中有些个体大于红细胞。
3.2 血细胞的形态和功能
鱼类成熟红细胞为椭圆形的中心凸出的细胞，与人类和哺乳类动物红细胞的最大区别是具有一个细胞核。幼稚红细胞呈圆形略大于成熟红细胞，胞质及胞核染色均较成熟红细胞略浅。郭琼林等[11]在草鱼血细胞研究中根据红细胞的发生，发现由原红细胞经幼稚红细胞到成熟红细胞，胞体及胞核均由大变小，形态由圆形变为椭圆形，核固缩浓染，军曹鱼稚鱼外周血中所见到的成熟及幼稚红细胞的形态同草鱼的一致。此外，红细胞直接分裂现象也被观察到，但数量甚少，且个体间有差异，与幼稚红细胞的数目也不成比例，说明红细胞主要由造血器官产生后释放入外周血液，红细胞极少数靠直接分裂产生。
血栓细胞在功能上与哺乳动物的血小板一样参与凝血过程，可是两者在形态和来源上却迥然不同。哺乳动物血小板无核，系由骨髓的巨核细胞分离出来的细胞质小块，而鱼类血栓细胞形态和淋巴细胞相似，它的来源还没有定论，在造血器官中未能找到血栓细胞发育的证据[12]。军曹鱼血栓细胞形态多样，有纺锤形、圆锥形、椭圆形和棒状形，有学者认为血栓细胞不可能具有吞噬特性，他们通过质膜上的小孔机械摄入胞外物质而与环境进行交流[13]。但BARBER等[14]认为血栓细胞中的小泡和微管与吞噬作用有关，FERGUSON[15]在石鲽(Kareius bicoloratus)鱼血栓细胞中观察到被吞噬的碳颗粒。以上不同的观点说明血栓细胞的功能可能具有种的差异性，现在还没有证据证实军曹鱼的血栓细胞有无吞噬的功能。
有很多学者将淋巴细胞分为大、小2类分别描述的，但是ELLIS等[13]认为将淋巴细胞分为大小2类是武断的，因为它们代表了同一种细胞的不同功能状态。很多学者也十分赞同将其归为一类进行描述，认为大小淋巴细胞只是体积变化范围较宽而已。通过对军曹鱼稚鱼淋巴细胞形态结构的观察，发现稚鱼淋巴细胞不仅有大小的区别，其形态结构也有明显的差异。大淋巴细胞表面有许多微绒毛突起，而小淋巴细胞表面有明显的伪足样突起；大淋巴细胞核染色稍浅。当处于静息不活跃状态的小淋巴细胞遇到抗原刺激时，将转变成代谢活跃并能进行增殖的大淋巴细胞，此时细胞核增大，染色质变细，胞质增多，重新分裂和分化，进行免疫应答[16]，可见不同的形态结构决定了其不同的功能，它们都是免疫细胞的重要组成部分。
单核细胞存在于所有脊椎动物中，担负着非特异性免疫的重要作用。鱼类单核细胞有较多的胞质突起，胞质中含有较多的液泡和吞噬物，说明它可以进行活跃的变形运动，这在鳜、小点猫鲨(Scyliorhinus canicula)、鲤(Cyprinus carpio)、日本白鲫(Carassius cuvieri)、鲫鱼(C.aumtus)等多种鱼类已得到证实[3, 17-19]。周玉等[20]发现1龄欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)的单核细胞吞噬红细胞现象，证明了单核细胞具有吞噬功能。军曹鱼稚鱼单核细胞胞核形状多样，马蹄状、椭圆状、月牙状等，细胞表面有较多的胞突和胞质中还有较多液泡，说明其有较强的吞噬能力，是非特异性免疫重要组成部分。
军曹鱼嗜中性粒细胞的核大多数是单叶的，也有二叶的，没有观察到三叶的。中性粒细胞存在于所有硬骨鱼类血液中，能做变形运动，参与机体的炎症反应，大多数出现在炎症的初期，其功能可能是产生细胞因子和补充免疫细胞到达损伤处[21]。还有研究证实，斑点叉尾
3.3 外周血细胞与鱼体免疫的探讨
外周血细胞中与鱼体免疫联系最大的是淋巴细胞、粒细胞和单核细胞等，淋巴细胞是鱼体内参与特异性反应的免疫细胞，在免疫应答中起介导细胞免疫且调节免疫应答，在体液免疫中产生特异性免疫因子和免疫球蛋白作用[23]。在外周血液中，淋巴细胞较单核细胞和粒细胞发挥作用迟，在接受疫苗免疫的最初阶段，非特异性的单核细胞和粒细胞最先发挥抗菌作用[24]，粒细胞和单核细胞一方面可以破坏和降解血液中的病原体，另一方面又会被活化并产生更多的抗病因子。在对兴国红鲤(C. carpio. var. singguonensis)进行柱状噬纤维菌免疫后，外周血中的单核细胞和粒细胞在初期数量会代偿性的增加，从免疫中后期开始由于单核细胞大量解体，使其数量急剧下降[25]，单核细胞及粒细胞数目的急剧减少，可能与这2种细胞参与对细菌吞噬作用后解体有关。
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图 1 浅色黄姑鱼脑垂体总RNA的电泳图
M.100 bp DNA分子量标准；1. 脑垂体总RNA
Figure 1. Gel electrophoresis of total RNA from the pituitary gland of N.coibor
M.100 bp DNA marker; 1.total RNA from the pituitary gland of N.coibor
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图 2 pλTripIEx2为模板的PCR产物酶切前、后电泳图
M. 100 bp DNA分子量标准；1. 酶切后的PCR产物；2. PCR产物
Figure 2. Gel electrophoresis of PCR product and digested product
M.100 bp DNA marker; 1.PCR product/EcoR I+NotⅠ; 2.PCR product
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图 3 质粒pcDNA3.1 (+) 及其酶切产物
M. 100 bp DNA分子量标准；1~2. 质粒pcDNA3.1 (+) 酶切后；3. 质粒pcDNA3.1 (+)
Figure 3. Gel electrophoresis of digested and undigested pcDNA3.1 (+) plasmid
M. 100 bp DNA marker; 1~2. pcDNA3.1 (+) /EcoR I+NotⅠ; 3. pcDNA3.1 (+) plasmid
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图 4 双链cDNA的合成电泳图
M. 1 kb DNA分子量标准；1. 双链cDNA
Figure 4. The synthesized dscDNA on 1.1% agarose gel
M. 1 kb DNA marker; 1. dscDNA
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图 5 文库总菌液PCR检测插入cDNA范围电泳图
M1. 100 bp DNA分子量标准；M2. 1 kb DNA marker；1. 总文库菌液PCR产物
Figure 5. Gel electrophoresis of PCR results from the total library plasmids with T7 and BGH-RV primers
M1. 100 bp DNA marker; M2. 1 kb DNA marker; 1. PCR results from the total library plasmids with T7 and BGH-RV primers
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