鸢乌贼(Sthenoteuthis oualaniensis)隶属于柔鱼科鸢乌贼属，广泛分布在印度洋、太平洋的赤道和亚热带等海域，以印度洋西北部海域的资源量为最大^[1]。前苏联和日本学者^[2-3]曾多次对印度洋鸢乌贼资源进行调查，同时根据种类的发光器、形态特征、肥满度等初步分为大型、中型和小型3个群体，主要是侧重于对其资源量的研究；SNYDER^[4]曾对阿拉伯海鸢乌贼大型群体进行了生物学的初步研究；杨德康^[5]根据中国拖网渔船在亚丁湾海域兼捕的鸢乌贼，从捕捞时间和渔获物的性腺成熟度来分析，认为鸢乌贼由春生群、夏生群和秋生群3个群体组成；我国于2003~2005年对印度洋西北部海域鸢乌贼资源进行调查研究，对其资源密度及其分布、钓捕技术、渔场形成机制与海洋环境因子之间的关系等作了较全面的分析，对其生物学特性也作了初步分析^[6-9]，但是对该海域鸢乌贼的种群及其遗传结构没有作出进一步研究。文章是根据2004~2005年2次对印度洋西北部公海海域(13°N~20°N、59°E~64°E)鸢乌贼资源调查中所采集的鸢乌贼肌肉样本，利用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)检测方法，对该海域鸢乌贼种群及其遗传结构进行研究，为其资源评估、群体数量变动分析提供最基础的资料。

1.   材料和方法

1.1   材料来源

根据2004年9~12月和2005年3~5月2次印度洋西北部公海海域鸢乌贼资源调查结果，在27个站点中共采集鸢乌贼肌肉样本200尾(表 1)，其胴长范围为20.3~53.0 cm，平均胴长为36.7 cm。肌肉样本用75%的酒精固定并保存于4℃的冰箱中备用。根据形态学特征及其空间分布，选取了12个站点48尾鸢乌贼的肌肉样本进行RAPD分析(图 1)。

表  1  印度洋西北部海域鸢乌贼肌肉样品取样时间、地点、样本尾数以及分析的样本尾数

Table  1.  Sampling localities, sampling dates, total numbers and the numbers used for RAPD analysis ofS.oualaniensis in the northwestern Indian Ocean

取样时间 sampling date	经度/°N longitude	纬度/°E latitude	尾数/ind number	RAPD分析尾数/ind numbers used for RAPD analysis
2004-10-11	65.25	12.78	5	0
2004-10-12	63.37	13.45	5	0
2004-10-14	62.55	14.55	5	0
2004-10-15	62.35	16.38	5	4
2004-10-16	62.33	18.93	5	4
2004-10-18	63.00	18.88	5	4
2004-10-21	63.93	18.95	5	4
2004-10-22	63.48	18.47	5	0
2004-10-24	62.83	18.12	5	4
2004-10-25	61.45	17.17	5	0
2004-10-26	61.45	17.72	5	0
2004-10-27	61.50	17.78	10	0
2004-10-31	60.93	16.32	10	4
2004-11-01	60.92	15.57	10	0
2004-11-02	59.42	15.08	10	0
2004-11-06	59.67	13.17	10	4
2004-11-07	60.10	13.33	10	4
2004-11-09	60.92	14.13	10	0
2004-11-10	61.02	14.50	10	4
2004-11-12	60.72	14.42	10	4
2004-11-14	60.78	16.97	10	4
2004-11-15	60.53	16.87	10	0
2004-11-17	60.82	15.87	10	4
2004-11-20	60.45	15.40	10	0
2005-03-27	60.43	13.00	4	0
2005-03-31	60.00	15.00	5	0
2005-04-03	61.05	16.95	6	0
合计 total			200	48

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图  1  遗传多样性分析的样品采集站点

Figure  1.  Sampling localities of S.oualaniensis used for RAPD analysis in the northwestern Indian Ocean

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1.2   试验方法和数据处理

1.2.1   基因组DNA的提取和检测

取肌肉样本25~30 mg加液氮后碾碎，-70℃保存备用。采用基因组DNA纯化试剂盒(SK1252，Sangon公司生产)提取基因组DNA。用Beckman DU-650紫外分光光度计检测DNA的含量，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。检测后的基因组DNA放置于-20℃冰箱中备用。

1.2.2   PCR-RAPD扩增反应及电泳

PCR-RAPD所采用的随机引物由上海Sangon公司合成。扩增反应中体积为25 μL，其中包括10×Taq buffer 2.5 μL，dNTPs(Fermentas公司生产，25 mol·L^-1)0.5 μL，MgCl₂(Fermentas公司生产，25 mmol·L^-1)2.5 μL，Taq DNA Polymerase(Fermentas公司生产，5 μ·μL^-1)0.2 μL，随机引物(Sangon公司生产，50 μmol·μL^-1)0.5 μL，基因组DNA 1μL(50~100 ng·μL^-1)，ddH₂O 17.8 μL。

PCR扩增在GeneAmp PCR System 9700 PCR仪上进行，所有样本对每一个引物都进行1~2次扩增反应。反应条件为经94℃预变性2 min后，接着40个循环，每个循环包括94℃变性15 s，35℃复性60 s，72℃延伸90 s，最后是72℃终延伸10 min，4℃保温。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，凝胶成像系统(genius bio imaging system，GENE公司生产)观察、拍照并记录。

1.2.3   数据处理

根据电泳后记录下清晰的扩增条带进行数据统计，在RAPD图谱中相对位置无条带的用“0”表示，在相对位置有条带的用“1”表示，将RAPD图谱转化成0、1矩阵，利用Popgene 1.31软件计算不同站点鸢乌贼样本的遗传相似度(S)和遗传距离(D)。计算公式为：

式中N_xy为X、Y 2个样本共有的扩增条带，N_x、N_y分别为X、Y样本各自拥有的扩增带。

采用PHYLIP(phylogeny inference package，Ver.3.5)软件包中的NEIGHBOR程进行UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic average)聚类分析。参照恽锐等^[10]的方法，用Shannon多样性指数计算种群的遗传多样性，其平均值即为种群的遗传多样性。计算公式为：

式中p_i为某位点的表型频率，包括有带样本的频率和无带样本的频率，h为该位点的表型多样性，即样本在该位点出现“有带”或“无带”的不确定性。

利用Arlequin 2.0软件进行分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA)，计算其遗传分化指数(G_ST)，G_ST即为种群间的遗传多样性占种群多样性的比例，以检测鸢乌贼种群内和种群间的遗传变异情况的显著性。计算公式为：

式中H_T为种群的总遗传多样性，H_S为种群内平均遗传多样性。

2.   结果

2.1   RAPD扩增结果

PCR-RAPD试验所使用的16个随机引物中，经过筛选，选取扩增条带丰富且稳定性好的8个引物进行分析，引物序列见表 2。每个引物均可得到条带清晰且重复性好的扩增图谱，扩增条带为3~8，其分子量大小为200~1 500 bp。图 2为引物R₈的扩增图谱。

表  2  所用的随机引物及其序列

Table  2.  Primers and their sequence used for RAPD analysis

引物 primers	序列 sequence	引物 primers	序列 sequence
R1	5′-ccatcctacc	R5	5′-ccatggtgtc
R2	5′-acagtaccgcc	R6	5′-aaccgcgtcc
R3	5′-gatggctgtg	R7	5′-ctcaccgtcc
R4	5′-ctccccaact	R8	5′-acggcgtatg

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图  2  随机引物R₈对鸢乌贼肌肉样本的RAPD扩增图谱

1~16号样本来源于18°N~20°N海域

Figure  2.  RAPD electrophoresis pattern of S.oualaniensis muscle samples using primer R₈

No.1~16 sampled from 18°N~20°N in the northwestern Indian Ocean.

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2.2   UPGMA分析

将RAPD图谱转化成0、1矩阵，经过POPGENE 1.31处理，根据NEI^[11]的方法可得出各个样本间的遗传相似性指数(S)和遗传距离(D)。根据遗传距离，利用PHYLIP软件包中的NEIGHBOR程序进行UPGMA聚类分析，得出48尾鸢乌贼样本的聚类图(图 3)。

图  3  基于鸢乌贼样本的遗传距离聚类图

1~16号样本来源于18°N~20°N海域；17~48号样本来源于13°N~18°N海域

Figure  3.  Dendrogram revealed by UPGMA analysis of S.oualaniensis using Nei′s (1972) genetic distance

No.1~16 sampled from18°N~20°N in the northwestern Indian Ocean; No.17~48 sampled from 13°N~18°N in the northwestern Indian Ocean.

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由图 3可知，18°N~20°N海域4个站点的16尾样本聚集在一起，且样本间的最大遗传距离为0.4858，可以推测认为，该海域的鸢乌贼形成一个种群。而在13°N~18°N海域的8个站点的32尾样本中，除第23号样本外，其余样本都聚集在一起，且样本间的最大遗传距离为0.4767，该海域的鸢乌贼也同样形成一个种群。因此，根据UPGMA聚类分析，可以得出在13°N以北的印度洋西北部海域鸢乌贼存在2个不同种群，且2个种群之间的遗传距离为0.1338，遗传相似性指数为0.8748。

2.3   遗传多样性

利用Shannon多样性指数计算印度洋西北部海域鸢乌贼种群的遗传多样性，其平均值即为种群的遗传多样性。计算结果表明，印度洋西北部海域鸢乌贼种群平均每个位点的多样性指数为0.3676±0.1801，由此可以看出其种群的遗传多样性较高，种群分化较大。

2.4   DNA多态性与遗传分化

根据获得的RAPD扩增带，计算种群间的多态位点比例(表 3)，2个种群多态位点比例分别为68.75%和93.75%，这说明印度洋西北部海域鸢乌贼2个种群均保持较高的遗传多样性。以种群内不同扩增图谱类型之间的遗传差异值为基础，计算种群的遗传多样性，18°N~20°N海域鸢乌贼种群的遗传多样性为0.2072，13°N~18°N海域鸢乌贼种群为0.1656，其平均值为0.1864。

表  3  印度洋西北部海域鸢乌贼种群多态位点比例与遗传多态性

Table  3.  Proportion of polymorphic loci and genetic diversity of S.oualaniensis populations in the northwest Indian Ocean

内容 content	18°N~20°N种群 population located in 18°N~20°N	13°N~18°N种群 population located in 13°N~18°N
多态位点比例/% proportion of polymorphic loci	68.75	93.75
遗传多态性(平均值±标准差) genetic diversity (Mean±SE)	0.2072±0.1928	0.1656±0.1441

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G_ST是用来判断种群间的遗传分化情况，当G_ST < 0.05时，种群间没有遗传分化；当0.05 < G_ST < 0.15时，种群间的遗传分化程度为中等；当0.15 < G_ST < 0.25时，种群间有高度的分化；当G_ST>0.25时，种群间的分化程度非常高。印度洋西北部12°N以北海域鸢乌贼种群总遗传多样性为0.2375，种群内平均遗传多样性为0.1864，可以得出其种群间遗传分化指数为0.2150，即21.5%的遗传变异来自于种群间，而78.5%来自于种群内。该结果表明，不同种群间在遗传背景上存在较大的差异，且种群内的遗传变异水平较高。

3.   讨论

3.1   关于印度洋西北部海域鸢乌贼种群结构的探讨

通过对印度洋西北部海域鸢乌贼样本的RAPD分析，并根据遗传距离对其进行UPGMA聚类，发现18°N~20°N海域4个站点的16尾鸢乌贼样本聚集在一起，形成了一个种群，而13°N~18°N海域8个站点的32尾鸢乌贼样本聚集在一起，形成了另一个种群。对这2个不同种群的形态学参数进行统计，18°N~20°N海域鸢乌贼胴长为45.4~53.0 cm，平均胴长为48.9±2.81 cm，而13°N~18°N海域胴长为20.3~51.2 cm，平均胴长为36.3±8.03 cm，优势胴长为32.0~42.0 cm。经单因素方差(ANOVA)分析2个种群间的胴长的P=0.00002 < 0.05，差异性显著。陈新军等^[12]认为印度洋西北部海域鸢乌贼分为形态特征存在一定差异性的3个种群：大型种群、中型种群和小型种群，其中大型种群主要分布在18°N以北海域，中型种群主要分布在12°N~18°N海域，小型种群主要分布在12°N以南及赤道附近海域，且这3个种群重叠分布；谷津明彦^[3]也认为该海域的鸢乌贼存在3个不同体型的种群，此文所得出的种群结构与陈新军、谷津明彦等研究的结果基本一致。因此，印度洋西北部13°以北海域鸢乌贼种群在形态学与遗传上都可以被区分为18°N~20°N、13°N~18°N 2个不同的种群。

3.2   印度洋西北部海域鸢乌贼的遗传多样性

Shannon多样性指数表示种群间的多样性占总多样性的比例，可以用来估测遗传多样性在种群内和种群间的分布，即估测种群的遗传分化程度。利用Shannon多样性指数计算出的印度洋西北部海域鸢乌贼的遗传多样性指数为0.3676±0.1801，为较高的水平。由于其遗传多样性水平较高，种群分化较大，从侧面可以说明印度洋西北部海域鸢乌贼2个种群在形态上差别很大的原因。

另外，此研究结果还揭示，与18°N~20°N海域鸢乌贼种群相比，13°N~18°N海域鸢乌贼种群拥有较高的多态性位点比例，而遗传多态性却相对较低(表 3)，这一结果可能与所选用8条RAPD引物有关；笔者因此推测出13°N~18°N海域鸢乌贼可能所受的捕捞压力相对较大，生长速度较快。基于此研究的分析结果，该海域鸢乌贼2个种群间在遗传背景上存在较大的差异，且种群内的遗传变异水平较高，笔者认为，对该海域鸢乌贼资源的规模性开发还处于较合理水平。

3.3   RAPD结果的分析方法

种以下类群包括亚种、品种及地理种群等，遗传分析的目的在于了解遗传多样性、鉴别种群、分析种群间的差异大小和微进化等，多数学者采用2种方法对RAPD结果进行处理并对上述问题进行探讨^[13-15]：(1)寻找种群的特有遗传标记，据此可以鉴别不同的种群；(2)基于遗传相似率的分析，包括相似率比较、遗传距离分析、聚类分析等。此研究在进行RAPD实验过程中未能寻找到用于区分印度洋西北部海域鸢乌贼2个种群的RAPD分子标记，这可能是由于在此次实验中使用引物较少的原因所造成的。因而，此研究选用了第2种分析方法。

RAPD技术能够快速、简便地检测大量基因组DNA的遗传变异，只要采用适当的分析方法，不仅可以用于鉴定头足类资源的品系、种群结构并探讨其进化关系，还可以在探讨头足类种群分化等方面发挥重要作用。