Study on selectivity of different mesh size gillnet for Nemipterus virgatus in South China Sea
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摘要:
金线鱼刺网是南海区的主要渔具之一。根据近年来世界上刺网选择性研究常用的最大似然法原理，应用Normal、Gamma和Lognormal 3种常用的刺网选择性曲线模型，对1992年在南海区进行的45、50、55和60 mm网目尺寸金线鱼刺网捕鱼比较试验的渔获资料作了分析。结果表明，南海区金线鱼刺网的选择性最适合用Lognormal模型曲线公式描述。
Abstract:Nemipterus virgatus gillnet is one of the main fishing gears in South China Sea. According to the theory of maximum likelihood method of gillnet selectivity that rose in resent years, this paper uses the Normal, Gamma and Lognormal selectivity models, which are commonly used to describe gillnet selectivity curve, to analyze the catch data of Nemipterus virgatus from simultaneous fishing with 45, 50, 55 and 60 mm mesh sizes of gillnets in 1992. The results show that Lognormal model equation provide an adequate description for the selectivity curves of Nemipterus virgatus gillnet in South China Sea.
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流式细胞仪(flow cytometry，FCM)是集激光技术、电子技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器，具有灵敏度高、重复性好、特异性强、方法灵活、分析速度快等优点。流式细胞仪主要由4部分组成，液流系统、光学系统、电子系统和分析系统。它只能检测悬浮的单细胞或微粒的信号。其工作原理一般是将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室，用不含细胞或微粒的缓冲液(又称鞘液sheath fluid)在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或微粒高速流动，形成一个圆形的流束(即鞘流)，待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流式细胞仪的检测区域，经激发光激发后产生荧光信号，特征荧光的散射和吸收等信号被光学系统(透镜、光阑、滤片等)收集，并被检测系统和分析系统储存，从而进行分析判断。流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选提取，它通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体，可以产生高频振荡，使液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷，当带电液滴通过电场，在电场的作用下发生偏转，然后落入相应的收集器之中，从而实现细胞分选。
流式细胞仪自20世纪70年代初发明后，越来越多的结合了现代先进的科学技术，使其在临床医学、免疫学、生物学、材料学和药物学等诸多研究领域发挥越来越重要的作用。近些年来，随着人们对贝类研究的深入，流式细胞仪自然变得不可或缺，且其作用也愈来愈明显。
1. 流式细胞仪在贝类血细胞分类中的应用
近年来，国外学者采用流式细胞仪对贝类血细胞进行分类[1-3]，每秒钟可以分析多达几百个血细胞，同时还可以分析血细胞的大小和颗粒性。流式细胞仪在细胞分类及其功能的研究上是一种快速而准确的工具，它不但计数量大, 使统计数据更为准确；并且可避免实验过程中人为或一些主观性因素造成的不确定性和一些假象。
刘东武等[4]用流式细胞仪将中国蛤蜊(Mactra chinensis)和紫石房蛤(Saxidomus purpuratus)2种贝类的血细胞分为透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞3类；ASHTON-ALCOX和FORD[2]、GOEDKEN和GUISE[3]和MICHAEL和SYLVAIN[5]利用同样的方法将美洲牡蛎(Crassostrra virginica)的血细胞分为透明细胞、中间型细胞和颗粒细胞3类；许秀芹等[6]将长牡蛎(Crassostrea gigas)、海湾扇贝(Argopecten irradians)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)的血细胞分为透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞3类。他们的结果相似，只是对细胞的命名略有不同而已。
XUE等[7]采用流式细胞仪测定欧洲扁牡蛎(Ostrea edulis)的血细胞，结果显示可能由3个血细胞亚群组成，这3个亚群分别对应于光镜和电镜分析鉴定的3个亚群，小透明细胞、大透明细胞和颗粒细胞。
ALLAM等[8]利用流式细胞仪结合细胞化学染色将美洲牡蛎的血细胞分为颗粒细胞、非颗粒细胞(agranulocyte)和小颗粒细胞，将硬壳蛤(Ruditapes philippinarum)血细胞分为颗粒细胞和非颗粒细胞。
2. 流式细胞仪在贝类血细胞功能研究中的
应用近年来一些经济贝类因时常遭受一些寄生虫或病菌的侵袭引起疾病，而贝类的血细胞在防御疾病中扮演了极重要的角色，可通过识别、吞噬、包囊化、氧化消除异物颗粒等功能来执行防御作用，所以，研究血细胞的功能，将帮助我们更好地了解它们的防御机制。
流式细胞仪可通过散射角参数快速地对血细胞进行形态特征分析，同时，可以利用不同的荧光标记对细胞功能进行研究。流式细胞仪克服了形态学观察的主观性，不仅准确性高、重复性好，而且操作简便快速，目前已成为研究脊椎动物血细胞功能的常规手段，但其在贝类研究中尚未得到广泛应用。
吞噬作用是贝类免疫防御的主要方式。石芳芳等[9]采用流式细胞仪技术对栉孔扇贝(Chlamys farreri)和海湾扇贝血细胞吞噬活性进行了测定。通过对缓冲体系的筛选和比较，建立了扇贝血细胞吞噬活性的流式细胞仪检测方法，并应用该技术对2种扇贝血细胞的吞噬活性进行了比较研究。结果发现，在Tris-HCl抗凝剂(TBS)和磷酸盐缓冲液(PBS)体系中，扇贝血细胞的吞噬活性几乎完全受到抑制，在CMPBS(0.1 mol·L-1PBS，pH 7.4；2% NaCl；2% glucose；1.0 mmol·L-1CaCl2；0.5 mmol·L-1MgCl2)体系中细胞吞噬活性略有升高，而在海水缓冲液中细胞吞噬活性最高，其中海湾扇贝和栉孔扇贝血细胞的吞噬率分别达到26.73%和19.89%，且海湾扇贝血细胞的吞噬率显著高于栉孔扇贝。
CHRISTOPHE等10利用流式细胞仪检测重金属对双壳贝类血细胞生存能力及吞噬作用敏感性的影响，来评价几种重金属对贝类血细胞的免疫毒性。
GAGNAIRE等[11]曾用流式细胞仪检测铬、汞等重金属对太平洋牡蛎血细胞内的一些与免疫有关的酶的活性、吞噬作用和死亡率的影响，发现在测试浓度下铬对太平洋牡蛎血细胞没有影响，但24 h孵育后汞却引起太平洋牡蛎血细胞大量死亡。由此得出结论，汞在海洋双壳贝类的免疫调节中起作用。
SOKOLOVA等[12]用流式细胞仪检测了环境中的镉离子对美洲牡蛎的血细胞产生的影响，发现10~100 pmol·L-1镉离子能引发牡蛎血细胞的凋亡，并进一步证实在凋亡过程中发生的ATP产率下降是由于Fe/F1-ATPase和线粒体ADP/ATP或者底物的转运受到抑制造成的。
BEATRICE等[13]利用流式细胞仪研究了温度和盐度对太平洋牡蛎血细胞死亡率和吞噬作用的影响，发现温度和盐度可调节太平洋牡蛎血细胞的吞噬作用，环境变化也可能影响其吞噬作用，且温度越高，太平洋牡蛎血细胞的死亡率也越高。
3. 流式细胞仪在贝类染色体核型分析中的
应用用流式细胞仪可将分离的染色体进行分类、纯化。传统的核型分析在取材、培养、涂片、固定后，用分带技术显示出不同染色体的特征信息，然后再显微照相，放大、剪接、组型。这是一个十分费时且不可避免掺有主观因素的技术。目前，用仪器自动分型的方法，(1)采用图像技术的静态方法，(2)采用流式细胞仪。流式细胞仪除可做染色体分析外还可纯化，得到克隆实验所要求的染色体，这是其他任何技术都无法完成的，为此需设计出专门的特种流式细胞计。
从1975年首次使用流式细胞仪分析染色体起，流式核型分析被证明是一个非常有用的工具，它能快速精确定量地检测染色体数目和结构的畸变；非整倍体和染色体缺失也能很容易被检测到。国外已利用流式细胞仪对人类染色体、细菌人工染色体和植物染色体进行过核型分析，但鲜有用流式细胞仪对贝类染色体进行核型分析的报道。建议应尝试进行此类工作的研究。
4. 流式细胞仪在贝类细胞核DNA含量测
定中的应用在贝类细胞核中，DNA含量是随着细胞增殖周期时相不同而发生变化的，这种现象体现出贝类细胞的生命历程，也是贝类的重要生化过程之一。流式细胞仪可对单个细胞或细胞器的DNA含量进行快速、准确的测定。
吴洪喜等[14]利用流式细胞仪对泥蚶(Tegillarca gransa)、毛蚶(Scapharca subcrenata)、魁蚶(Scapharca broughtonii)血细胞中DNA含量进行测定。结果发现，毛蚶和魁蚶在DNA含量上表现出高度的一致性，泥蚶略高于毛蚶和魁蚶，但也较接近。一般地说，作为遗传物质基础的DNA，在每种生物细胞中的含量是相当稳定的，生物的性状就是依赖于DNA的稳定复制得以实现世代的遗传和延续。
吴洪喜等[15]还利用流式细胞仪分析泥蚶血细胞不同时期的DNA含量变化，结果表明，血细胞已失去分裂功能，不存在周期现象。
5. 流式细胞仪在贝类倍性检测中的应用
贝类多倍体技术在细胞染色体育种技术体系中占有重要地位，而倍性的鉴定是多倍体育种中的一个重要环节。以往人们主要用细胞染色体计数技术进行倍性的检测。但该技术操作复杂，技术要求高且不稳定，耗时长，而且在大多情况下还要杀死取样对象或对其造成较大的生理伤害。由于在杂交多倍体育种中四倍体的珍贵性，需要保持其健康存活状态。因此，其快速的活体倍性检测技术的重要性尤显突出。ALLEN等[16]1983年用流式细胞仪测定了经人工三倍体诱导的鱼类和贝类的倍性，取得了较好的结果。
丁君等[17]利用流式细胞仪测定正常二倍体、三倍体牡蛎和鲍鱼，结果表明，三倍体贝类的DNA含量是正常二倍体的1.5倍。这是由于贝类在胚胎时期人为加入6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)和细胞松弛素B(CB)所致。另外，在试验中还发现在诱导的牡蛎、鲍鱼成体中有嵌合体出现，在经过药物处理的牡蛎幼虫中出现了多倍体和非整倍体现象。
巩宁等[18]将流式细胞仪用于长牡蛎的快速活体倍性检测，结果也发现，三倍体贝类的DNA含量是二倍体的1.5倍。
阙华勇等[19]利用流式细胞仪对长牡蛎进行倍性检测，结果表明，利用四倍体产生的精子均可以完成大批量二倍体卵子的受精。其杂交后代的受精率、幼虫生长和变态等各项主要技术指标，接近对照的二倍体幼虫。尤其重要的是，杂交后代从幼虫直至变态后的稚贝、幼贝，均为100%的三倍体。
6. 流式细胞仪在贝类研究中的应用前景
流式细胞仪在贝类血细胞分类、血细胞功能研究、贝类染色体核型分析、贝类倍性检测方面均具有广阔的应用前景，流式细胞仪还将会应用到贝类生殖与遗传研究中。此外，传统的流式细胞技术和先进的成像技术结合诞生的图像流式细胞仪，其图像处理能力可与荧光显微镜相比，其发展和运用必然极大地推动贝类分子水平的研究。
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图 1 45、50、55和60 mm刺网捕获的金线鱼叉长分布
Figure 1. Fork length distribution of Nemipterus virgatus catch of gillnet with mesh sizes 45, 50, 55 and 60 mm
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图 2 45、50、55和60 mm金线鱼刺网的Lognormal选择曲线
Figure 2. Lognormal selectivity curve of Nemipterus virgatus gillnet with mesh sizes 45, 50, 55 and 60 mm
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图 3 遭遇网具的金线鱼叉长分布
Figure 3. The population fork length of Nemipterus virgatus encountered gillnet
表 1 45、50、55和60 mm刺网的金线鱼渔获组成
Table 1 The catch composition of Nemipterus virgatus for mesh sizes 45, 50, 55 and 60 mm gillnet
叉长/mm fork length 网目尺寸 mesh size 45 mm 50 mm 55 mm 60 mm 120 1 0 0 0 125 47 1 0 0 130 28 0 0 0 135 74 1 0 0 140 75 7 0 0 145 70 26 3 0 150 66 133 3 0 155 21 100 44 2 160 14 93 97 1 165 2 5 142 48 170 4 7 48 123 175 2 11 10 68 180 0 2 4 22 185 0 1 1 21 190 0 0 1 13 195 0 1 2 4 200 0 0 1 6 205 0 0 2 3 210 0 0 0 2 合计 total 404 388 358 313 
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表 2 刺网选择曲线模型
Table 2 Models of selectivity curve of gillnet
模型 model 选择曲线 selectivity curve 参数 parameters Normal $S_{l m}=\exp \left[\frac{-\left(l-k_l m\right)^2}{2 k_2 m^2}\right]$ (k1, k2) Gamma $S_{l m}\left[\frac{l}{(\alpha-1) k m}\right]^{\alpha-1} \exp \left(\alpha-1-\frac{l}{k m}\right)$ (α, k) Lognormal $S_{l m}=\exp \left[-\left(\ln \frac{1}{\mathtt{m}}-\mathtt{μ}\right)^2 / 2\mathtt{б}^2\right]$ (μ, б)
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表 3 金线鱼刺网选择曲线模型的估算
Table 3 The estimation of selectivity curves of gillnet for Nemipterus virgatus
模型 model 参数 parameters G df G/df Normal (k1，k2)= (3.0 663，0.0 389) 522.36 55 9.5 Gamma (α，k)=(247.4 036，0.0 124) 481.18 55 8.7 Lognormal (μ，б)=(1.1 148，0.0 633) 463.13 55 8.4
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表 4 金线鱼刺网的最大选择叉长和最大渔获叉长
Table 4 Fork length of largest selectivity and largest catches of gillnet for Nemipterus virgatus
网目尺寸 mesh size 45 mm 50 mm 55 mm 60 mm 最大选择叉长/mm fork length of largest selectivity 137.1 152.4 167.6 182.9 最大渔获叉长/mm fork length of largest catches 146.5 150.5 164.5 168.5
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