鲍苗培育阶段有关鲍苗掉板及死亡的研究国内外已有许多报道，Elson & Lockwood^[1]等研究了引起人工养殖红鲍变态幼虫至1 cm幼鲍大量死亡的弧菌，Anguiano-Beltran等人^[2]报道了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)引起红鲍面盘幼虫及4 d龄的幼鲍大量死亡。1997年至1998年初台湾东北角宜兰地区许多养殖场发生附着苗大量死亡的情形，吴萃慧等^[3]发现大量死亡多发生在附苗后1个月当原有硅藻种群濒临被刮食殆尽之时，认为是由于这段期间天气多阴雨，附苗板上所受光照不足以造成硅藻种群大量生长，导致幼鲍缺饵而死亡。Lee等^[4]报道了弧菌导致杂色鲍苗暴发性死亡，温度越高，小鲍越容易受感染，沈士新^[5]认为鲍幼苗死亡与底栖硅藻生长及细菌有关，李国诰等^[6]报道九孔鲍幼苗的病害可能与弧菌有关。

2001年秋季，福建省东山、漳州等地许多鲍养殖场的杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)鲍苗发生大规模掉板死亡事件，许多养殖场甚至颗粒无收。2002春季，该现象蔓延至广东、海南等地，而且有愈演愈烈之势。具体表现为：(1)鲍苗在浮游阶段就沉底死亡，根本不能附着。(2)在整个附着期内，鲍苗从采苗器上逐渐脱落，到最后基本全部死亡。(3)在附着期的某天或几天内，鲍苗突然大量脱落死亡，一般出现于附着后10~20 d左右。(4)鲍苗剥离后在苗池内突然死亡，一般发生于剥离后6~15 d。该文针对鲍育苗期间水中及附着板上细菌数量的变化进行了研究，以期为分析鲍苗大规模掉板死亡提供科学依据。

1.   材料和方法

1.1   采样点

2004年，秋季育苗期的9~11月间，湛江市硇洲鲍鱼种苗试验场。

1.2   水质检测

每天对海水温度、pH、盐度进行测量。

1.3   细菌学监测

监测培苗周期细菌生态：包括培苗池水、附着板(薄膜)和鲍苗；在受精卵下池后第三天开始取样，隔天取样1次。培苗池水包括2类：(a)未经任何处理的常规池水，(b)经过臭氧处理的池水。

(1) 用无菌广口瓶取用20 cm以下池水，加0.01%吐温，摇动30 min，然后分别稀释成最适合的3个浓度梯度。

(2) 取10 cm×10 cm大小薄膜，用无菌剪刀剪碎，放入装有50 mL灭菌海水广口瓶中，加0.01%吐温，摇动30 min，稀释成最适合的3个浓度梯度。

(3) 取5只幼苗，规格2~3 mm，用无菌海水冲洗3次，小型匀浆器进行匀浆，加入1 mL浓度为1%的生理盐水，稀释成最适合的3个浓度梯度。

上述每个浓度梯度分别涂布2216E及TCBS各3个平板，每组3个平行。28℃培养24~48 h，进行总细菌数和弧菌数的计数。

1.4   细菌的分离纯化与鉴定

当薄膜及池底的的鲍苗发生大规模死亡时，2216E及TCBS平板上出现的优势菌落种类非常明显，挑起优势单菌分离纯化，然后接入斜面培养基保种。用BIOLOG细菌鉴定仪鉴定。

2.   结果

2.1   养殖场水质因子结果

养殖池内基本水质在育苗前后未发生较大变化，海水比重在1.020~1.025之间，初期较低，后期有些升高，见图 1；水温也相对稳定，在25~30℃之间，见图 2；pH值也相对稳定，在8.1~8.4之间，见图 3。

图  1  养殖池盐度的变化

Figure  1.  The change of Salinsty

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图  2  养殖池水温的变化

Figure  2.  The change of temperature of water

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图  3  养殖池pH的变化

Figure  3.  The change of pH value of water

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2.2   常规育苗过程中细菌数量的变化

受精卵下池后15 d池水中总细菌(2216E培养基)数量一般低于1×10³ cfu · mL^-1)(图 4)，15 d后呈逐渐上升趋势，至30 d后达到最高6×10⁴ cfu · mL^-1；附着板上细菌数量也呈现类似的规律，在14 d内基本维持较低水平，低于后6×10³ cfu · cm^-2，而14 d后逐渐上升，30 d后达到最高，1.2×10⁵ cfu · cm^-2，此时鲍苗(0.1~0.3 mm)出现大量掉板死亡，严重的整池全部死亡，有些薄膜上的底栖硅藻出现大片掉落。在此之后水中及附着板上的细菌数量逐渐下降。

图  4  水中及薄膜上总细菌含量的变化

Figure  4.  The change of number of general bacteria of water and attachment film

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水中弧菌数量(TCBS培养基)一直处于较低水平(图 5)，都低于1×10⁴ cfu · mL^-1，而薄膜上弧菌数量与总细菌数量的变化很相似，30 d后达到最高，2.5×10⁴ cfu · cm^-2。

图  5  水中及薄膜上弧菌数量的变化

Figure  5.  The change of Vibrio in the water and attachment film

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2.3   臭氧处理水后细菌数量的变化

受精卵下池后20 d内池水中细菌(2216E培养基)数量一般低于7×10² cfu · mL^-1(图 6)，20 d后呈逐渐上升趋势，至30 d后达到最高1.7×10⁴ cfu · mL^-1；附着板上细菌数量也呈现类似的规律(图 7)，在20 d内基本维持低于1.5×10⁴ cfu · cm^-2，而20 d后逐渐上升，30 d后达到最高，3.3×10⁴ cfu · cm^-2，之后逐渐下降。

图  6  臭氧处理后池水中细菌含量变化

Figure  6.  The change of number of bacteria of water after ozone treatment

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图  7  臭氧处理后薄膜上细菌含量的变化

Figure  7.  The change of num ber of bacteria on the attachment film after ozone treatment

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2.4   剥离后幼鲍体内细菌含量变化

幼鲍达到2~3 mm后，从附着板上剥离下来，进入中间培育阶段，一般投喂人工饵料。在10~15 d内也容易发生死亡。从图 8可以看出在第9~10 d，鲍苗体内细菌含量达到最高峰，6.5×10⁴ cfu · ind^-1，当天鲍苗出现大量死亡，死亡率高达50%，随即下药，以浓度为3×10^-6的氟哌酸浸泡6 h，连续3 d。在随后的1周内，鲍苗体内细菌含量基本呈下降趋势，鲍苗的死亡也得到控制。

图  8  幼鲍剥离后体内细菌含量变化

Figure  8.  The change of number of bacteria of the juvenile abalone, Haliotis diversicolor Reeve

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2.5   细菌的分离纯化与鉴定

当薄膜上的鲍苗出现大规模死亡时，从TCBS及2216E培养基上的菌落可看出基本只有2种细菌，且数量非常大；剥离后的幼鲍出现死亡时，TCBS及2216E培养基上也只有2种细菌，从菌落形态与大小与上述2种细菌非常一致。经过初步感染后，又从体内分离到相同的细菌，用BIOLOG进行鉴定，为塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)和Vibrio sp.。

3.   讨论

在杂色鲍工厂化育苗刚刚兴起时，鲍苗匍匐幼体变态前后的培育过程中，部分水池饵料硅藻常会因突发的意外原因脱落消失，严重者采苗器表面几乎透明无藻类色泽；有时整池采苗器上的鲍苗部分脱落，甚至全部脱落死亡。而从2001年秋季发生的鲍苗脱落现象与以往的不一样，有时鲍幼体在浮游阶段就沉底死亡，有时在附苗板上硅藻生长良好时，鲍苗突然大量脱落死亡，大小仅为1~2 mm，一旦从附着板上掉下，即剩下一个空壳，空壳内充满细菌及原生动物。目前从台湾、福建、广东、海南情况来看，发生掉板死亡的情况基本一致，一般在孵化后10~30 d内出现掉板，发病期一般不超过3 d，有时死亡率达100%。鲍苗剥离后在池底也发生大量死亡，情况更为复杂，(1)当天剥离，第二天全池死亡；(2)剥离后5~20 d内，鲍苗已经摄食人工饵料，壳周缘长出了薄薄的绿边，没有任何征兆即发生大量死亡，1 d内死亡率高达50%以上。

在鲍苗附着初期，附着板上的藻类较少，其细菌数量也一直处于较低水平，随着藻类的生长，细菌数量不断增加，到鲍苗出现大规模死亡前后，其细菌数量比初期高2个数量级，此时藻类出现老化死亡，用手摸上去有滑腻感，肉眼可见苗池内薄膜上藻类出现大量脱落，池水中细菌含量随之升高。薄膜上藻类重新生长，其细菌浓度再次升高。

经过臭氧处理过的池水，水中的细菌数量比正常养殖水低1个数量级。而藻种接种过来之前未经任何处理，其上的细菌含量比较高，尤其在经过30 d后，薄膜上细菌数量到达1.7×10⁴ cfu · mL^-1。虽然低于未处理水池中薄膜细菌数量，从观察来看，而鲍苗生长速度也明显小于未处理水。

从试验结果看来，在幼体附着至剥离前这一段时间内，附着板上细菌数量的剧增是鲍苗大规模死亡的重要标志。鲍苗自附着开始，它所附着的薄膜是一个非常复杂的生活环境，有机微粒与微小生物沉积在它的表面，就开始形成所谓的生物膜^[7]，其上的优势生物是硅藻与细菌，还有原生动物。池水在流动或充气翻滚时，用肉眼观看似乎全池水的理化因子都是相同的。实际上，越靠近薄膜表面，这些部位水的运动则越极微，其化学物质的浓度与大水体是极不同的，而且这些化学物质是通过溶液的扩散作用来输送，不是靠水团的交流。

剥离下来的鲍苗(2~3 mm)初期体内细菌含量较低，当其体内细菌数量剧增时，即出现大规模死亡，死亡率最高的达50%，达到6.5×10⁴ cfu · ind^-1，用药物控制后，其细菌数量降低，该现象在5~10 d后又重复出现，再次出现大规模死亡，这与徐力文^[8]的研究结果一致。

目前关于鲍苗的大规模死亡有多种说法。(1)种质退化说。经过十几年的工厂化高密度养殖，在选种、亲鲍培育时没有严格遵循操作规程，有些养殖场用本场亲鲍长期自交导致该品种迅速退化，理由是在出现掉苗的养殖场培育黑鲍苗，则不会出现掉板现象。(2)水质恶化说。有人认为养殖环境的迅速恶化，宜渔水域的减少，赤潮频繁发生，有毒藻类及毒素的存在是导致鲍苗大规模掉板死亡的原因。(3)微生物说。有关病毒的报道只有宋振荣等^[9]在电子显微镜下观察到了28 d鲍龄的幼苗体内有病毒颗粒，并以此推断该病毒为九孔鲍“脱板症”的病原体。我国台湾许多研究人员认为是溶藻弧菌引起的，Godoy^[10]等人在红鲍1 cm幼苗上也分离到弧菌，经过感染试验确定为导致红鲍大量死亡的病原。

从我们的试验来看，细菌是导致鲍苗大规模死亡的主要原因，在未出现掉板死亡的养殖池内，其细菌数量一直处于较低水平；或者是病毒或立克次体等更小型的微生物导致鲍苗的病害，而后继发细菌感染，我们多次的电镜切片均未发现病毒粒子或其他可疑微生物，这个问题值得进一步研究。