Polymorphism study of the mitochondrial DNA D-loop control region sequences from black porgy Acanthopagrus schlegeli, in the costal waters of China
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摘要:
采用聚合酶链式反应(PCR)和直接测序的方法，测定了广西北海、广东深圳和山东青岛3个地理群体共72尾黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)线粒体D-loop第一高变区5′端547~549 bp序列，以探讨黑鲷种群的遗传变异。分析结果表明：72条序列T、C、A、G 4种核苷酸的平均含量分别为30.8%、21.8%、36.3%、11.0%。共检测到55个变异位点，其中转换位点32个，颠换位点19个，缺失/颠换位点1个，插入/颠换位点3个。72个个体具有51种单倍型(haplotype)，单倍型比率为70.8%，黑鲷线粒体D-loop控制区表现出较为丰富的核苷酸多态性。对其所有单倍型依据序列距离使用NJ法构建的亲缘关系树并无明显的系谱分支，没有显示出明显的地理分布族群，说明黑鲷线粒体DNA控制区第一高变区序列无法用于黑鲷种群的鉴别。
Abstract:For inquiring into the genteic diversity and genetic structure of black porgy Acanthopagrus schlegeli, We used polymerase chain reaction (PCR) and direct nucleotide sequencing to analyze the 547~549 bp 5′end of the D-loop region from 72 A.schlegeli samples, which captured from Beihai(Guangxi province), Shenzhen(Guangdong province) and Qingdao(Shandong province). The results show that the A, T, G and C mean contents in those fragments were 30.8%, 21.8%, 36.3%, 11.0%, respectively. There were 55 variable nucleotide positions in those gene fragments, which included 38 transition sites and 13 transvertion sites, 1 insert/ transvertion site and 3 deletion/trasvertion. Comparisons of these 72 partial D-loop sequences revealed 51 mitochondrial haplotypes in A.schlegeli, the haplotype rate was 70.8%. Those indicated that there were rich nucleotide variational polymorphism exited in A.schlegeli. Phylogenetic trees of haplotypes were constructed by NJ method. Neither significant genealogical branches nor geographic cluster were found. It showed that mitochondrial DNA highly variable region sequence is unsuitable to be used as a genetic marker for population identification.
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Keywords:
- Acanthopagrus schlegeli /
- black porgy /
- mitochondrial DNA /
- D-loop /
- genetic polymorphism
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虾青素(astaxanthin)是一种非维生素A原的类胡萝卜素，常温下呈紫黑色结晶粉末，熔点224℃，易氧化且对光敏感，不溶于水，易溶于二氯甲烷、氯仿、丙酮等大多数有机溶剂[1]。虾青素最重要的性质在于它的抗氧化性，其分子结构中具有活泼的电子效应，极易与自由基反应而清除自由基[2-3]，因而被誉为“超级维生素E”和“超级抗氧化剂”。动物试验表明它有抑制肿瘤发生、增强免疫功能等多方面的生物活性和生理功能，在功能食品和医药等方面应用广泛[4]。
近年来出于安全考虑，人们对生产天然虾青素的兴趣大大提高。目前较有前景的天然虾青素生产来源是甲壳类动物的外壳、酵母菌和藻类。由于甲壳类年产量很大，加工厂的废弃物占原料的70%~85%，是提取虾青素的一种良好来源。据报道，2006年全世界约有54万t粉红虾被加工，以平均每吨废弃物可提取出35 g虾青素估计，每年可获取18 900 kg虾青素[5]。
由于天然虾青素在甲壳类壳中的含量非常低，因而传统的提取和精制方法如碱法破壁法、超声波法、层析法等，提取率均较低，难以满足生产和市场需要。
负压空化法提取技术是一种崭新的提取方法。其原理是利用负压空化气泡产生强烈的空化效应和机械振动，造成目标物颗粒细胞壁快速破裂，胞内物质被释放；同时负压空化效应使细胞膜和壁的通透性加大，提取溶剂得以瞬间进入，大大促进胞内物质向介质释放、扩散和溶解过程，从而使提取过程在极短时间内完成。这种提取方法具有提取收率高、设备简单、易于操作的特点[6-8]。
文章首次采用负压空化法从河虾的虾壳中提取天然虾青素，变废为宝，提高水产品废弃物的综合利用率，为水产品的综合应用开辟新路，并为负压空化法的工业化提取技术提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 试验仪器、材料和试剂
原料为新鲜河虾虾壳，取自河南南阳市白河附近一生产河虾虾仁的冷库车间。
虾壳预处理是用5%盐酸浸泡、水洗除去盐和矿物质及一些水溶性杂质，将虾壳敲碎，离心甩干，备用。
自制空化柱(内径为4 cm，上端连接空气流量计和真空泵，下端配有法兰控制空气进量)；真空泵；空气流量计；离心机。
高效液相色谱仪(Waters 510高压泵；Waters 717自动进样器；色谱柱为Novapak C18柱(Φ4.6×150 mm)或Waters Spherisorb. S5W(5 μm silica)硅胶柱(Φ4.6×250 mm)；Waters 486紫外检测器，二极管阵列检测器(PDA)。
甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷等化学试剂均为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 提取溶剂对虾青素提取率的影响
量取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷各100 mL，分别与10 g虾壳混合，置于空化柱中，进行负压空化提取，时间为30 min，通气量为0.20 m3·h-1，分别取样，样品经12 000 r·min-1离心5 min后采用HPLC检测虾青素的含量。
1.2.2 乙醇浓度对虾青素提取效果的影响
量取50%，60%，70%，80%，90%，100%的乙醇溶液各100 mL，分别与10 g虾壳混合，置于空化柱中，进行负压空化提取，时间为30 min，通气量0.20 m3·h-1，分别取样，样品经12 000 r·min-1离心5 min，HPLC检测虾青素含量。
1.2.3 提取时间对虾青素提取率的影响
量取10 g虾壳，与100 mL 80%的乙醇溶液混合，置于空化柱中，进行负压空化提取，时间为1 h，通气量0.20 m3·h-1，每间隔5 min取样，样品经12 000 r·min-1离心5 min后检测虾青素的含量。
1.2.4 料液比对虾青素提取效果的影响
量取3份10 g虾壳，分别用80%乙醇溶液提取3次(料液比分别为1:10，1:20，1:30)进行对比试验，通气量为0.20 m3·h-1，时间为30 min，收集提取液，浓缩至干，分别用100 mL乙醇溶解，取样，样品经12 000 r·min-1离心5 min后采用HPLC检测虾青素的含量。
1.2.5 通气量对虾青素提取效果的影响
量取5份10 g虾壳，分别与100 mL 80%乙醇溶液混合，置于空化柱中，进行负压空化提取，时间为30 min，选择通气量0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 m3·h-1进行对比试验，分别取样，样品经12 000 r·min-1离心5 min后采用HPLC检测虾青素的含量。
1.2.6 虾青素含量测定
HPLC检测。(1)游离虾青素分析。色谱柱为Novapak C18柱，Φ4.6×250 mm；预柱为Waters；流动相A为甲醇-二氯甲烷-水(50:2:3)；流速0.6 mL·min-1；检测波长478 run。(2)虾青素酯分析。色谱柱为Novapak C18柱，Φ4.6×250 mm；预柱为Waters；流动相B为甲醇-二氯甲烷-乙腈-水(30:9:7:1.4)；流速0.6 mL·min-1；检测波长481 nm。
游离虾青素分析结束时，色谱柱需要用二氯甲烷-甲醇(1:3)冲洗。它能准确测定游离虾青素的含量，但不适用于正己烷配制的样品溶液的分析。虾青素酯分析准确性较差，但可用于正己烷配制的样品溶液。
1.2.7 碱法破壁
取10 g虾壳鲜物料，用pH值为11.8的NaOH溶液处理，温度为40℃，处理2 h后，水洗至溶液呈中性，在4 800 r·min-1下离心10 min，取沉淀部分加入100 mL 80%乙醇溶液浸提l h，取样，12 000 r·min-1离心5 min，样品采用HPLC进行虾青素含量测定。
1.2.8 超声提取
取10 g虾壳鲜物料，加入100 mL 80%乙醇溶液，放入超声机内进行超声提取，时间为35 min，温度为40℃，频率为100 kHz。取样，12 000 r·min-1离心5 min，样品采用HPLC进行虾青素含量测定。
2. 结果和讨论
2.1 提取溶剂对虾青素提取效果的影响
在提取工艺中，应选择对目标提取物溶解度高、价格便宜、毒性低且易回收的提取溶剂(图 1)。由于负压空化提取法在提取时，溶剂在空化柱内会剧烈混旋，负压作用下气流将带走一部分溶剂，此外如果提取溶剂的挥发性较强会导致过多的溶剂进入空气之中，造成环境污染，所以首选挥发性弱的提取溶剂。
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图 1 不同提取溶剂对虾青素提取率的影响1.甲醇；2.乙醇；3.丙西酮；4.二氧甲烷Figure 1. Effect of various solvent on astaxanthin extraction rate1.methanol; 2.ethanol; 3.acetone; 4.dichlormethane目前，虾青素提取中常用的溶剂有二氯甲烷、丙酮、甲醇和乙醇。二氯甲烷的毒性大，挥发性强，且与物料无法互溶，出现分层现象，给物料的装投和处理带来极大不便；丙酮的提取效果较好，但其挥发性较强，毒性也较大，在物料的提取、溶剂的回收过程中，会造成大量污染，且会繁化操作和产品后处理等程序；甲醇和乙醇的效果相当，故选择毒性较低的乙醇作为提取溶剂[9]。
2.2 乙醇浓度对虾青素提取效果的影响
如图 2所示，乙醇浓度越高提取效果越好，这是因为在气泡传质的过程中，提取溶剂借助气泡溃灭或收缩时产生的巨大能量，可以透过细胞壁与提取的目标物充分接触；虾青素不溶于水，当乙醇中含水后，虾青素在提取溶剂中的溶解度降低，与虾青素脂肪粒接触时，无水乙醇可以最大限度的溶解虾青素，使提取更充分，但由于工业化生产的特殊要求，提取溶剂的浓度不宜过高，否则将会提高成本，并且给下一步溶剂回收的再利用造成一定的难度。所以选择浓度为80%的乙醇溶液作为提取溶剂，降低成本。
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图 2 乙醇浓度对虾青素提取率的影响Figure 2. Effect of various ethyl alcohol density on astaxanthin extraction rate2.3 提取时间对虾青素提取效果的影响
由图 3可知，随着空化时间的增加，虾青素的提取率成上升趋势，在35 min时上升至最高，之后曲线成下降趋势。虽然空化现象可以产生巨大的能量，但是由于空化柱内细胞的数量也很大，要想使提取效果完全，就要使每一个细胞都受到气泡的冲击，而且还要使每一个细胞内的虾青素都被抽提出来，这样就需要一定的提取时间来使气泡多次作用到每一个细胞[10]。虾青素的不稳定性又决定了提取时间不宜过长，所以在提取35 min后提取溶液中虾青素的含量才会降低，由此确定负压空化法提取虾青素的最佳时间为35 min。
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图 3 不同时间对虾青素提取率的影响Figure 3. Effect of various extraction time on astaxanthin extraction rate2.4 料液比对虾青素提取效果的影响
由图 4可以看出料液比对虾青素的提取有显著影响，料液比1:10的提取效果最差，较料液比1:20提取率低32.3%，因为料液比过小，料液过分粘稠，空化的效果受到影响，造成了虾青素的提取不完全；料液比1:20与料液比1:30的提取效果相当，但提取的料液比过大，溶剂使用量过多，后期固液分离及溶剂回收负载过重，将会延长生产周期，加大成本。因此，选择最佳料液比为1:20。
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图 4 料液比(体积比)对虾青素提取率的影响Figure 4. Effect of material/fluid ratio (V/V)on astaxanthin extraction rate2.5 通气量对虾青素提取效果的影响
由图 5的结果可以知道，最佳通气量为0.20 m3·h-1。通气量的选择要适中，不宜过大或过小，因为当通气量较低时，液相中气含率较小，气泡数量产生较少，气液混旋效果较差，传质表面减少，影响液相与固相间的传质效率；当通气量过大时，传质体系中含气量增加，但空化所需的临界压力减小，同时小气泡的数量减少，空化效果较差，导致传质率降低。
综上所述，虾青素的最佳工艺参数为提取溶剂是80%乙醇溶液，提取时间为35 min，料液比为1:20，通气量为0.20 m3·h-1。
2.6 天然虾青素的提取工艺正交试验
在单因素试验的基础上，确定乙醇浓度、提取时间、料液比、通气量4因素，采用L9 (34)的正交试验，以提取率为指标确定最佳条件，见表 1。
表 1 正交试验结果及分析Table 1. Orthogonal test results and analysis试验号
no.乙醇浓度/%
ethyl alcohol density
A提取时间/min
extraction time
B料液比
material/fluid ratio
C通气量/m3·h-1
ventilation
D提取率/%
extraction rate1 1(70) 1(25) 1(1:15) 1(0.15) 1.26 2 1 2(30) 2(1:20) 2(0.20) 1.44 3 1 3(35) 3(1:25) 3(0.25) 1.37 4 2(80) 1 2 3 1.32 5 2 2 3 1 1.53 6 2 3 1 2 1.65 7 3(90) 1 3 2 1.43 8 3 2 1 3 1.25 9 3 3 2 1 1.30 K K1 1.357 1.337 1.387 1.363 K2 1.500 1.407 1.353 1.507 K3 1.327 1.440 1.443 1.313 R 0.173 0.103 0.090 0.194 由表 1可知，各因素影响极差大小的主次顺序为D>A>B>C，即通气量对提取率的影响最大，乙醇浓度其次，提取时间和料液比对提取率的影响较小。最佳提取工艺条件为D2A2B3C3，即通气量0.20 m3·h-1，乙醇浓度80%，提取时间35 min，料液比1:25。此组合在表 2中未出现，故需做验证试验。而验证试验表明，在最佳条件下，其提取率为1.68%，高于其它组合。
表 2 不同提取方法提取条件的比较Table 2. Comparison of different extraction methods方法
methods提取时间/min
extraction time提取温度/℃
extraction temperature溶剂
solvent碱法破壁提取
extraction alkaline broken-down wall190 40 NaOH(pH=11.8)
80%乙醇溶液(100 mL)
80% ethyl alcohol (100 mL)超声波法
ultrasonic wave35 40 80%乙醇溶液(100 mL)
80% ethyl alcohol (100 mL)负压空化法
vacuum cavitations35 25 80%乙醇溶液(100 mL)
80% ethyl alcohol (100 mL)2.7 负压空化法与常用破壁提取方法的比较
2.7.1 碱法提取与负压空化法提取的比较
根据检测结果，空化提取法的提取效果优于化学破壁法，提取率较碱法破壁提高26.7%。试验发现，碱对虾青素有一定的破坏作用，在使用pH值为11.8的碱液时，虾青素的损失率最小；但这些精确的溶液条件和较短的处理时间将给大规模生产带来一定难度，操作中的微小误差都将会导致提取率的严重降低。负压空化法提取时间短，对提取温度也无特殊要求(表 2)，将原来的破壁提取2步操作合并为一步完成，所以，无论是在提取率还是在操作程序的简化程度方面，负压空化法都是更适合产业化生产的提取方式。
2.7.2 超声提取与负压空化法提取的比较
在提取时间、溶剂以及提取效果3方面，超声提取与负压空化法提取基本相同，但超声法的提取温度要略高于负压空化法超声提取，在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感活性物质失活，噪声令人难以忍受，而且大容量装置声能传递，散热均有困难，因而超声破碎的应用潜力有限。
3. 讨论
文章研究了负压空化法提取虾壳中虾青素的工艺条件对虾青素提取效果的影响，确定了负压空化法提取最佳工艺参数：提取溶剂为浓度80%的乙醇溶液，提取时间为35 min，料液比为1:20，通气量为0.2 m3·h-1。同时将负压空化法与常用破壁提取方法的提取效果和效率进行了比较，结果表明负压空化法优越于其它方法。
负压空化法是一种提取虾青素的新方法, 它运用气泡的空化作用将原有的先破壁、后浸提的2步提取工艺缩短为一步完成, 适用于工业生产。一般认为运用此方法提取虾青素时，材料的细胞壁并没有破碎, 而是其通透性发生了改变, 这样就使存在于脂质中的虾青素通过细胞壁溶解在提取溶剂中, 从而实现了虾青素的高效提取。负压空化法更新了破壁提取的传统方法, 为虾青素的提取工艺提供新的思路。
虾青素作为分布极为广泛的叶黄素，具有独特的着色功能，也能够促进抗体的产生，增强动物的免疫力；在抗氧化性、清除自由基方面，其能力强于β-胡萝卜素；具有水溶性和亲脂性，易溶于二硫化碳、丙酮、苯和氯仿等有机溶剂。因此，虾青素是一种极具潜力的类胡萝卜素添加剂，在食品、饲料、化妆品、医药等领域有着广阔的应用前景。
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图 1 黑鲷线粒体DNA控制区5′端序列(单倍型1)
注：方框表示终止相关的序列，阴影表示终止相关序列的反向互补序列，双线表示重得序列和源序列所在位置，单线表示ETAS
Figure 1. 5′ end sequence of mitochondrial DNA cotrol region of black porgy(haploty 1)
Note: The square frame in diagram denotes termination associated sequences, the shadow means convert-complement sequence with termination associated sequences, the double line means the position of the repeative sequence and homologous sequence, single line means the ETAS
表 2 中国南北海黑鲷品种内单倍型多样性
Table 2 Haplotype diversity of D-loop of black porgy
品种species 样本数sample size 单倍型数number of haplotypes 单倍型百分率percent of haplotypes 单倍型多样性haplotype diversity 深圳Shenzhen 23 17 73.9% 0.9684±0.022 青岛Qingdao 24 15 62.5% 0.9348±0.076 北海Beihai 25 21 84.0% 0.9667±0.029 合计total 72 51 70.8% 0.9787±0.012 
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表 3 黑鲷品种内核苷酸多态性
Table 3 Nucleotide polymorphism of D-loop of black porgy
品种species 样本数sample size 变异位点数number of variation sites 简约信息位点parsimony sites 平均核苷酸差异(K)average number of nucleotide differences 核苷酸多样度(π)nucleotide diversity Tajima′s 深圳Shenzhen 23 28 13 4.877 0.00897 -1.35155 青岛Qingdao 24 25 12 3.833 0.00702 -1.39469 北海Beihai 25 26 13 4.913 0.00903 -1.05981 合计total 72 55 33 4.818 0.00886 -1.78914
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