白斑综合症是全球对虾养殖业所面临的危害性最大的病害之一，由对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)感染所致。该病自20世纪90年代初首先在中国台湾地区养殖水域发生以来，已席卷了世界各国的对虾养殖地区，造成了巨大的经济损失，同时也给海洋生态平衡带来了一定的威胁。van HULTEN等^[1]和许雅香^[2]先后通过试验证明了WSSV囊膜蛋白VP28的特异性抗体能中和病毒感染，显示VP28在病毒感染过程中起到非常重要的作用。

最近研究报道证明甲壳类动物具有类似脊椎动物的干扰素系统^[3]和类获得性免疫反应，并且有记忆特性^[4]。这一发现推翻了长期以来人们一直认为的甲壳类动物是没有获得性免疫功能的观念，也为有效预防WSSV的感染提供了新的思路。

此研究正是基于以上事实及研究结果，旨在通过优化含重组WSSV囊膜蛋白VP28编码基因质粒的重组大肠杆菌BL21发酵工艺，从而大规模表达目的蛋白，免疫对虾，有效提高对虾抵抗WSSV感染的能力。

一般情况下，利用重组大肠杆菌BL21表达外源蛋白都使用IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)作为诱导剂，但是因其高成本和对人和动物的毒性，因而不能直接被动物采食，更不能进入食物链，因此，限制了基因工程产品的产业化发展^[5]。为了解决这一问题，使用廉价、无毒的乳糖替代IPTG作为诱导剂诱导重组蛋白的表达，已成为目前研究的热点。同时，葡萄糖作为重组菌高密度发酵的碳源，也存在一定的局限性。笔者尝试将乳糖也作为碳源使用并优化其发酵工艺，亦取得了良好的效果。

1.   材料与方法

1.1   基因工程菌

重组对虾白斑病毒囊膜蛋白VP28工程菌由自身实验室构建，宿主菌为Escherichia coli BL21，即大肠杆菌pET-32a-VP28-BL21。

1.2   培养基

种子培养基用LA培养基，配方为胰蛋白胨10 g · L^-1，酵母浸膏5 g · L^-1，NaCl 10 g · L^-1，氨苄青霉素终浓度100 μg · mL^-1，pH值为6.5。

发酵培养基为牛肉浸膏5 g · L^-1，酵母浸膏5 g · L^-1，NaCl 10 g · L^-1，蛋白胨10 g · L^-1。

1.3   培养方法

1.3.1   菌种活化

20 μL重组大肠杆菌BL21甘油种转接到3~4 mL种子培养基中，30℃，120 r · min^-1摇床培养24 h。之后取菌液划平板，30℃培养，24 h后挑单菌落至装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，转速120 r · min^-1，37℃恒温摇床培养，作为种子备用。

1.3.2   发酵

将培养好的种子液以5%的接种量接种到装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，120 r · min^-1，37℃恒温摇床培养14 h。

1.3.3   不同诱导剂的诱导表达

为比较IPTG和乳糖对表达VP28的影响，于发酵6 h后分别添加IPTG和乳糖诱导表达，使IPTG终浓度为1 mmol ·L^-1，乳糖终浓度为0.68 g · L^-1。至发酵结束，分别取样进行SDS-PAGE电泳检测。

1.3.4   不同碳源对诱导表达的影响

在发酵培养基中分别添加葡萄糖、甘油、乳糖作为碳源(表 1)，发酵6 h后分别向1~5组添加终浓度为0.68 g · L^-1乳糖诱导表达，至发酵结束，以乳糖为诱导剂，比较其对表达VP28囊膜蛋白的影响。由于第6、7组是以乳糖为碳源，所以不再添加乳糖。

表  1  添加不同碳源的发酵培养基

Table  1  Cultural media with different carbon sources

组别 test group	培养基配方 culture media
1	发酵培养基
2	发酵培养基+5 g·L-1葡萄糖
3	发酵培养基+10 g·L-1葡萄糖
4	发酵培养基+5 g·L-1甘油
5	发酵培养基+10 g·L-1甘油
6	发酵培养基+5 g·L-1乳糖
7	发酵培养基+10 g·L-1乳糖

下载: 导出CSV 

| 显示表格

1.3.5   乳糖作为碳源及诱导剂其添加量对诱导表达的影响

在发酵培养基中分别添加6、8、10、12和14 g · L^-1乳糖作为碳源及诱导剂，比较其对表达VP28囊膜蛋白的影响。

1.3.6   乳清粉作为碳源及诱导剂其添加量对诱导表达的影响

将乳清粉(乳糖含量为74%)用温水充分溶解，3 000 r · min^-1，离心10 min，取上清液。配制成乳糖浓度为100 g · L^-1的母液。在发酵培养基中添加乳清粉母液，使其乳糖终浓度分别为6、8、10和12 g · L^-1；在发酵培养基中添加6 g· L^-1乳糖。比较其对表达VP28囊膜蛋白的影响。

1.4   分析方法

测定培养菌液光密度OD₆₀₀的值，作为菌体生物量的指示；采用Bradford法测定菌体总蛋白质含量；重组产物占菌体总蛋白百分含量的测定，采用将诱导后菌体的全菌总蛋白经SDS-PAGE电泳后通过Bio-RaGelDoc2000凝胶成像系统确定。

2.   结果与分析

2.1   不同诱导剂的诱导表达

分别添加1 mmol · L^-1 IPTG和2 mmol · L^-1乳糖在相同的培养条件下诱导重组蛋白的表达，并于发酵12 h取样进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图 1，乳糖作为诱导剂诱导表达重组蛋白的表达效果与IPTG相似。

图  1  不同诱导剂诱导表达的SDS-PAGE分析结果

M.底分子量蛋白marker；1.IPTG诱导；2.乳糖诱导

Fig. 1  SDS-PAGE analysis of VP28 envelop protein from recombinant E. coli induced with IPTG and lactose, respectively

M.protein ladder; 1.IPTG induced; 2.lactose induced

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   不同碳源对诱导表达的影响

分别在发酵培养基中添加不同量的葡萄糖、甘油、乳糖作为碳源，在乳糖的诱导下，分别对其取样进行分析。由试验结果(图 2、表 2)可知，工程菌pET-32a-VP28-BL21在添加5 g · L^-1乳糖(第6组)和添加10 g · L^-1乳糖(第7组)的培养基中有较高的比生长速率，分别为0.1736和0.1794 h^-1，其中第7组培养基中的比生长速率为最高。而添加葡萄糖作为碳源的2组在发酵6 h后，菌体生长缓慢。由图 3可知，乳糖作为碳源及诱导剂处理组，其诱导表达重组VP28蛋白的表达量明显高于乳糖仅作为诱导剂，葡萄糖、甘油作为碳源处理组和不添加碳源组，且以添加10 g · L^-1乳糖作为碳源处理组为最高。而甘油作为碳源又比葡萄糖作为碳源更利于目的蛋白的表达。因此，选择以乳糖作为碳源的发酵培养基。同时，通过计算可知(图 4)，在不同的培养基中，乳糖作为碳源的发酵培养基中VP28蛋白得率系数也要高于其它处理组。结合图 2和图 4可以推断，不同碳源的发酵培养基中目的蛋白表达量的增高是由菌体数量的增加和VP28蛋白得率系数即单位菌体表达量的增加共同作用的结果。因此，选用乳糖作为发酵培养基的初始碳源及诱导目的蛋白表达的诱导剂。

图  2  不同碳源的培养基重组大肠杆菌的生长情况

Fig. 2  Effect of different carbon sources on the growth of recombinant E. coli

下载: 全尺寸图片 幻灯片

表  2  重组大肠杆菌pET-32a-VP28-BL21在不同培养基的比生长速率

Table  2  Specific growth rate of recombinant E. coli in different cultural media

培养基组别test group	1	2	3	4	5	6	7
比生长速率μ(h-1) specific growth rate	0.1253	0.0907	0.0872	0.1196	0.1579	0.1736	0.1794

下载: 导出CSV 

| 显示表格

图  3  不同碳源对VP28蛋白表达量的影响

Fig. 3  Expression of VP28 from recombinant E. coli by using different carbon sources

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  4  不同碳源的培养基中VP28蛋白得率系数

Fig. 4  VP28 yield coefficient of recombinant E. coli by using different carbon sources

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   乳糖作为碳源及诱导剂其添加量对诱导表达的影响

分别在发酵培养基中添加不同浓度的乳糖作为碳源和诱导剂，从发酵开始分别对其取样分析。由表 3可知，重组大肠杆菌pET-32a-VP28-BL21在乳糖作为碳源的培养基中均有较高的比生长速率，其中乳糖浓度为10 g · L^-1的发酵培养基中的比生长速率最高，达到0.2035 h^-1。由图 5、图 6、图 7可以看出，菌体生长在发酵开始10 h后进入稳定期，而其目的蛋白表达量和VP28蛋白得率系数却在发酵开始12 h时达到最高，因此, 可以认为在发酵10 h后，发酵液中目的蛋白量的增加主要以单个菌体的表达量增加为主。由图 6可知，乳糖浓度为12和14 g · L^-1时所获得的目的蛋白量最低，而且其菌体生长也较缓慢；乳糖浓度为8 g · L^-1的发酵培养基中获得的目的蛋白量最高，为97.36 mg ·L^-1；乳糖浓度为6 g · L^-1的发酵培养基中蛋白表达量略低于8 g · L^-1，为96.99 mg · L^-1。考虑发酵成本，乳糖在发酵培养基中的添加量以6 g · L^-1为宜。

表  3  重组大肠杆菌pET-32a-VP28-BL21在不同乳糖浓度的培养基中的比生长速率

Table  3  Specific growth rate of recombinant E. coli with different lactose concentration in media

培养基乳糖浓度/g·L-1 lactose concentration	6	8	10	12	14
比生长速率μ(h-1) specific growth rate	0.1809	0.1913	0.2035	0.1798	0.1744

下载: 导出CSV 

| 显示表格

图  5  不同乳糖浓度对重组大肠杆菌生长的影响

Fig. 5  Growth of recombinant E. coli with different lactose concentration

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  6  不同乳糖浓度对VP28蛋白表达量的影响

Fig. 6  Expressions of VP28 by recombinant E. coli with different lactose concentrations

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  7  培养基中不同乳糖浓度的VP28蛋白得率系数

Fig. 7  The VP28 yield coefficient of recombinant E. coli under different lactose concentrations

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   乳清粉作为碳源及诱导剂对诱导表达的影响

在发酵培养基中添加乳糖，使其终浓度为6 g ·L^-1；在发酵培养基中添加乳清粉(乳糖含量为74%)，使其乳糖的终浓度分别为6、8、10和12 g ·L^-1。从发酵开始分别对其取样分析。由表 4和图 8可以看出添加乳糖的发酵培养基中菌体的生长较快，比生长速率高于添加乳清粉的几组。由图 9可知，乳清粉也可以诱导重组蛋白的表达，但是表达量低于乳糖，且在发酵13 h时才达到最高表达量，比乳糖诱导推迟1 h。在添加乳清粉的几组中，乳糖终浓度为10 g · L^-1时获得最高表达量，为86.24 mg · L^-1。

表  4  重组大肠杆菌pET-32a-VP28-BL21在不同培养基中的比生长速率

Table  4  Specific growth rate of recombinant E. coli in different cultural media

培养基 cultural media	乳糖/g·L-1 lactose		乳清粉(乳糖含量74%)/g·L-1 whey
	6		6	8	10	12
比生长速率μ(h-1) specific growth rate	0.1495		0.1018	0.1058	0.1124	0.1184

下载: 导出CSV 

| 显示表格

图  8  以乳糖和乳清粉为碳源重组大肠杆菌的生长曲线

Fig. 8  Growth curves of recombinant E. coli with lactose and whey as carbon sources

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  9  以乳糖和乳清粉为碳源对VP28蛋白表达量的影响

Fig. 9  Expressions of VP28 with lactose and whey as carbon sources

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论与结论

3.1   不同诱导剂的诱导表达

乳糖是乳糖操纵子控制的细菌自身系列酶的底物，对乳糖操纵子具有诱导作用^[6]，试验结果证明其诱导结果与IPTG相似，与其他学者的试验结果相同^[7-8]。

3.2   培养基不同碳源对目的蛋白表达的影响

葡萄糖是快速的碳源，已被广泛用作重组菌高密度发酵的碳源，但是其代谢产物乙酸会抑制细胞的生长，影响重组产物的表达。而且高浓度葡萄糖和有机酸的积累会促进丢失质粒细胞的生长，降低质粒的稳定性^[9-10]；同时，含有lac启动子的表达载体都需要cAMP激活蛋白的参与，才能最大程度诱导lac启动子，而细胞在含有葡萄糖的培养基中生长时，cAMP活性会受到抑制^[11]。在此试验中可以看到，以葡萄糖作为碳源的培养基中菌体生长缓慢，目的蛋白表达量也低于产酸量较少的甘油作为碳源的处理组。而直接使用乳糖作为发酵培养基的碳源及诱导表达的诱导剂时，所获得的表达量则明显高于甘油作为碳源的处理组。因此，选用乳糖作为碳源更利于重组蛋白的表达。

3.3   乳糖作为碳源及诱导剂其添加量对目的蛋白表达的影响

在发酵培养基中分别添加不同浓度的乳糖作为碳源及诱导剂，笔者发现在一定范围内，乳糖浓度越高，重组蛋白的表达量越高，但是随着乳糖浓度的增加，其表达量有所下降。这说明乳糖的加入量有一个最佳范围，乳糖添加过多，非但不能使诱导更充分，反而可能对菌体生长和产物的表达产生抑制。

高浓度乳糖导致表达量下降可能是由于2种因素造成的：(1)添加的乳糖一部分被分解为葡萄糖与半乳糖，作为碳源供给细菌生长；另一部分乳糖进一步异构化为异乳糖，诱导外源蛋白的合成^[12]。因此，高浓度乳糖分解会产生较多的葡萄糖和半乳糖，葡萄糖的降解物阻遏效应便表现出来，lac阻遏蛋白抑制了乳糖操纵子的启动，导致重组基因不表达^[13]。(2)由乳糖操纵元的表达调控机理可知，由于乳糖透过酶的转运作用，乳糖得以进入细菌，从而诱导更多的β-半乳糖苷酶以及乳糖透过酶的产生。乳糖的转运以及酶的合成都是耗能的过程。因此，高浓度的乳糖会造成菌体质子推动力的消耗，从而“分散”了菌体的能量，影响了细菌的生长^[7-14]。因此，乳糖的添加量并非越高越好。

在试验中笔者也发现，当目的蛋白表达量达到最高之后，如果继续发酵，目的蛋白的表达量反而会降低。造成这种现象的因素有2个：(1)单位菌体的表达量也开始下降(图 4、图 7)；(2)因为发酵后期一些菌体自溶释放出大量蛋白酶会使一部分蛋白被降解，从而导致目的蛋白产量降低^[15-16]。因此，发酵时间不宜过长，应在培养13 h后结束发酵。

3.4   乳清粉作为碳源对目的蛋白表达的影响

乳清粉是生产干酪或干酪素时，用酶或酸把牛奶中的酪蛋白凝固分离后剩下的副产品。乳清粉中的主要成分是乳糖，以及少量的乳清蛋白和灰分^[17]。为了降低发酵成本，笔者希望可以使用乳清粉代替乳糖作为发酵培养基的碳源和诱导剂。由于乳清粉含有少量蛋白质，会影响对重组蛋白的检测和计算，因此，将乳清粉充分溶于温水后，采用高速离心的方法将蛋白质除去。

试验证实，乳清粉可以作为碳源并且可以诱导重组蛋白表达。但是其菌体比生长速率明显低于乳糖作为碳源的对照组。目的蛋白表达量也低于乳糖作为诱导剂的对照组，且达到最高表达量的时间比乳糖作为诱导剂推迟了1 h。同时可以看到，乳清粉的添加量在一定范围内，乳糖浓度越高，重组蛋白的表达量越高，但是随着乳糖浓度的增加，其表达量也有所下降。