低氧环境影响鱼类的生存、生长、繁殖和代谢等生命活动^[1-3]。为适应低氧环境，鱼类在长期进化中形成了一系列的低氧适应机制，由低氧诱导因子 (Hypoxia inducible factor, HIF) 介导的低氧信号传导途径在环境缺氧应答机制中起主导作用^[4]。血红素加氧酶1 (Heme oxygenase 1, HO1) 是血红素降解过程中的起始酶和限速酶，可将血红素降解形成胆绿素、一氧化碳 (CO) 和游离铁，这三种代谢产物均是机体重要的生物效应分子，可以保护细胞免受氧化应激损伤^[5]；ho1是HIF信号通路的靶基因之一，具有重要生物学功能。目前，ho1序列及其表达特征已在多种鱼类中报道，如斑马鱼 (Danio rerio)^[6]、舌齿鲈 (Dicentrarchus labrax)^[7]、卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus)^[8]、团头鲂 (Megalobrama amblycephala)^[9]、南亚野鲮 (Labeo rohita)^[10]等。研究表明，鱼类ho1在低氧刺激下能够为细胞提供保护作用。如鲫 (Carassius auratus) ho1对于抗低氧诱导的细胞凋亡具有重要作用，可保护细胞应对低氧刺激^[11]；ho1可调节金鱼 (C. auratus) 对低氧的呼吸反应^[12]；斑马鱼ho1可通过抗细胞凋亡发挥低氧保护作用^[13]。

梭鲈 (Sander lucioperca) 隶属鲈形目、鲈科、梭鲈属，具有生长速度快、抗病能力强、肉质细嫩、营养价值高^[14]等特点，在欧洲具有较高的市场认可度^[15]。20世纪 90 年代我国梭鲈人工繁育取得成功，目前在东北、西北、华北、华东、华南等地区均有养殖，已成为我国重要的淡水名优养殖鱼类。梭鲈为凶猛性鱼类，性情急躁，应激反应强烈，对低氧极为敏感。研究显示，梭鲈养殖的最佳溶解氧 (DO) 质量浓度为7~9 mg·L^−1[16]，因此在集约化养殖和苗种运输过程中容易发生低氧应激、死亡等现象。目前，关于梭鲈对低氧的耐受性及其适应机制研究报道较少，Baekelandt 等^[17]研究发现，养殖水域的DO质量浓度为4~6 mg·L⁻¹时，梭鲈的采食量和生长速度均降低；Nadine等^[3]报道，在DO质量浓度为3.2 mg·L⁻¹的缺氧环境中，梭鲈头肾中淋巴细胞数量下降，头肾和肝脏中的免疫和应激基因 (包括 fth1、hif1a 和nr3c1) 表达量下调。可见低氧显著影响到梭鲈的生长、免疫调节等重要生命活动，但有关梭鲈低氧应激分子机制的研究尚不多见，血红素加氧酶1在低氧胁迫下的响应机制尚不清楚。本研究通过对梭鲈低氧相关基因ho1的克隆及序列特征分析，探讨了梭鲈ho1在各组织中的表达模式，并检测了低氧、复氧下皮肤、鳃、心、肾、肝、脑中ho1的表达规律，以期为梭鲈养殖、运输等技术研发提供数据支持，同时也为梭鲈耐低氧机制研究、耐低氧育种提供理论参考。

1.   材料与方法

1.1   实验动物

实验用梭鲈来自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所呼兰试验场。选取体格健壮、体表无伤、规格基本一致的1龄梭鲈220尾，体质量 (73±6) g，体长 (200±10) mm，于实验室循环水系统水族箱中暂养7 d，正常投喂配合饲料。暂养期间，保持DO质量浓度大于8 mg·L⁻¹，水温 (18±0.2) ℃。实验前禁食24 h。

1.2   低氧胁迫与恢复试验

取30尾实验鱼，放入密闭水族箱中，用于测试“浮头点”。低氧胁迫前，采用YSI多功能水质分析仪测得DO质量浓度为9.9 mg·L⁻¹，水温18 ℃。停止增氧，观察鱼的活动情况，当实验鱼开始因低氧而浮在水面吞食空气时，则达到“浮头点”，此时水中DO质量浓度为3.5 mg·L⁻¹。因此，本实验将低氧胁迫DO质量浓度设定为3.5 mg·L⁻¹。

取90尾实验鱼平均放至于3个循环水族箱中作为常氧对照组 (DO质量浓度10 mg·L⁻¹)，90尾实验鱼平均放至于3个密闭水族箱中作为低氧胁迫组 (DO质量浓度3.5 mg·L⁻¹)。停止增氧，向水中持续充氮气 (N₂)，使水体DO质量浓度降至3.5 mg·L⁻¹，之后调节氮气 (N₂) 与氧气 (O₂)充入量使水体DO质量浓度保持在 (3.5±0.3) mg·L⁻¹，维持9 h。每间隔15 min用水质分析仪监测水体温度、pH、DO、氨氮 (${\rm{NH}}_4^+ $-N)等。低氧实验结束后，将胁迫组梭鲈转至3个循环可控水族箱中 (DO质量浓度10 mg·L⁻¹)，进行常氧恢复实验，并维持12 h。此次实验均使用直径30 cm、长100 cm的水族箱，且放置1个气石；除水族箱中DO条件存在差异，其他水质条件均一致。

1.3   样品采集和保存

用 MS-222对实验鱼进行麻醉，分别在常氧对照组，低氧胁迫第3、第6、第9小时，常氧恢复第0.5、第1、第2、第3、第6、第9、第12小时，在每个水族箱随机选取3尾鱼，采取皮肤、肌肉、心、肝、肾、肠、脑、鳃组织样本，并迅速投入液氮中冷冻备用。

1.4   总RNA提取及cDNA第一链的制备

将皮肤、肌肉、心、肝、肾、肠、脑、鳃组织样品从液氮罐取出，剪取1~2 mg置于事先加入500 μL Trizol的离心管中，使用手持匀浆仪 (QIAGEN) 匀浆至无颗粒状态，参考Trizol法提取样品总RNA。利用紫外分光光度计 (NanoDrop 8000) 及1.2% (质量分数) 琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度及完整性 (图1)。

图  1  梭鲈各组织总RNA电泳图

Fig. 1  Electrophoresis of total RNA in tissues of S. lucioperca

下载: 全尺寸图片 幻灯片

使用 PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 试剂盒 (TaKaRa) 去除基因组DNA、反转录合成cDNA第一链，于−80 ℃保存备用。

1.5   梭鲈ho1基因全长cDNA的获得

根据NCBI数据库中河鲈 (Perca fluviatilis)、舌齿鲈及其他鲈科鱼类ho1基因的cDNA序列，选择保守区域与梭鲈转录组数据库进行序列比对，获得梭鲈ho1基因的部分cDNA序列。利用Primer 3 Plus软件设计PCR特异性引物 (表1)，以梭鲈鳃组织cDNA为模板，对其开放阅读框 (Open reading frame, ORF) 进行PCR扩增，用 1.2% (质量分数) 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 (图2)，参考胶回收试剂盒 (康为世纪) 纯化目的片段，再连接至PMD-18T载体 (TaKaRa)、转入E. coli DH5α感受态细胞 (TaKaRa)，使用LB培养基 (含氨苄) 筛选阳性克隆，并测序验证。

表  1  引物序列

Table  1  Primers used in this study

基因 Gene	目的 Purpose	引物 Primer	引物序列 (5'—3') Primer sequence (5'–3')	退火温度 Annealing temperature/℃
ho1	ORF扩增	ho1-F1	GGAGCCAGAGAAGAAGACTCAG	59.8
		ho1-R1	TGCAGCTCGTTTTCAGTGAC	60.2
ho1	RACE扩增	5'GSP	ACACCGGGGAAGGCGAAGAATGAC	72.0
		5'nGSP	CACTGGGGTGGTTGGAGTTCCTGTC	70.9
		3'GSP	GAGGGCAGGTCCTGGGTCGAATC	71.2
		3'nGSP	ATGGGGCTAAAGGGCAGCGAAGGTC	73.2
ho1	RT-PCR	ho1-F1	CTGTGCTCGCTGTATGAGGT	59.1
		ho1-R1	CCAGTCCTGGCCATAGAAGT	59.2
gapdh	RT-PCR	gapdh1-F	ATGTTCGTCATGGGCGTCAA	60.0
		gapdh1-R	CAGGCCCTCAATGATGACGA	60.0

下载: 导出CSV 

| 显示表格

图  2  梭鲈ho1基因PCR扩增产物电泳图

Fig. 2  Electrophoresis of PCR products of ho1 in S. lucioperca

下载: 全尺寸图片 幻灯片

根据已获得梭鲈ho1基因ORF序列设计RACE (Rapid amplification of cDNA ends) 引物，参考SMARTer^® RACE 5'/3'试剂盒 (TaKaRa) 说明书构建 RACE文库。使用SeqAmp^TM DNA Polymerase (TaKaRa) 试剂盒并结合巢氏PCR法进行 RACE 扩增 (图2)。扩增产物的回收纯化及克隆同以上ORF序列的获得。引物合成及菌落测序均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

测序结果经BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 比对，DNAMAN 软件拼接、分析，最终获得梭鲈ho1基因全长cDNA序列。

1.6   梭鲈ho1基因序列的生物信息学分析

使用NCBI上ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 工具查找各基因开放阅读框，进一步推导出氨基酸序列。使用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) 和NCBI在线工具查找基因的蛋白功能结构域。通过EXPASY (https://web.expasy.org/protparam/) 在线分析软件分析功能域、分子式、理论等电点、信号肽、蛋白疏水性、跨膜结构、蛋白质二级结构等。采用DNAMAN软件进行氨基酸序列多重对比；使用MEGA 7.0软件的邻接法 (Neighbor-Joining method, NJ) 构建系统发育进化树, 其中Bootsrap (1 000次) 得出各分支置信度。

1.7   梭鲈ho1在各组织表达规律分析

为确定梭鲈ho1的组织表达特异性模式，根据已获得ho1基因的编码序列设计RT-PCR (Real-time quantitative PCR) 引物 (表1)，以梭鲈gapdh为内参基因，以上获得各组织的cDNA为模板，使用TB Green^® Premix Ex Taq ^TM II (Tli RNaseH Plus) 试剂盒 (TaKaRa)，ABI 7500 荧光定量 PCR 仪，检测梭鲈ho1基因在常氧对照、低氧胁迫及复氧中各个组织的表达情况，每个样本至少设置3个平行。采用2^−∆∆Ct法^[18]计算目的基因的相对表达量，SPSS 17.0 软件中的单因素方差分析 (One-way ANOVA) 方法对数据进行处理和检验分析，P<0.05表示差异显著。

组织样本总RNA的提取、cDNA第一链的制备，方法参考1.4.1。

2.   结果

2.1   梭鲈ho1基因全长cDNA序列分析

根据基因保守序列的同源扩增法、RACE技术，经克隆拼接，得到梭鲈ho1基因全长cDNA序列。

梭鲈ho1 cDNA序列全长1 256 bp，包括840 bp的开放阅读框、162 bp的5'非编码区 (5'-UTR) 和254 bp的3'-UTR，编码279个氨基酸，在3'-UTR区PolyA上游43 bp处有一个“AATAAA”加尾信号。梭鲈HO1蛋白分子式为C₁₄₁₂H₂₂₅₃N₃₇₇O₄₂₄S₁₂，相对分子质量31.68 kD，理论等电点(pI) 6.04，其中异亮氨酸(Leu)含量最高，占比12.5%。蛋白总平均亲水性为 −0.288，不稳定系数为40.59，说明该蛋白为亲水性不稳定蛋白。经TMHMM和Signal.4预测，HO1蛋白无信号肽位点，N末端第256—第278位氨基酸处有一个跨膜结构域(图3)，前255个氨基酸位于细胞膜内，第279位氨基酸在细胞膜外，说明HO1在细胞中具有跨膜转运的功能。除此之外，SMART在线工具推测出梭鲈HO1还拥有一个Pfam功能结构域(图3)，位于第17—第221位氨基酸，是HO1蛋白发挥其催化功能的区域，也是血红素加氧酶家族共有的保守功能域。

图  3  梭鲈ho1基因cDNA全长序列及推导的氨基酸序列

Fig. 3  Nucleotide and predicted protein sequences of ho1 of S. lucioperca

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   氨基酸序列比对及系统发育进化树的构建

使用Blast在线分析工具对梭鲈ho1编码的蛋白进行同源性搜索，发现不同物种HO1氨基酸序列有较高相似度(图4)，梭鲈HO1与翘嘴鳜 (Siniperca chuatsi)、舌齿鲈、大口黑鲈 (Micropterus salmoides)、大菱鲆 (Scophthalmus maximus)、军曹鱼 (Rachycentron canadum) 同源性分别为91.84%、88.69%、88.11%、87.28%、84.77%。在NJ系统发育进化树中(图5)，梭鲈先与鲈形目鱼类聚在一起，再与鸟纲、两栖纲、爬行纲聚为一支，而哺乳动物则单独聚为另一支。

图  4  梭鲈与其他物种HO1氨基酸同源性比对

Fig. 4  Multiple alignment of HO1 amino acid sequences between S. lucioperca and other species

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  5  基于不同物种HO1氨基酸序列构建的系统发育进化树 (NJ法)

Fig. 5  Phylogenetic tree based on HO1 amino acid sequences of different species (Neighbor-Joining method)

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   梭鲈ho1基因在不同组织的表达模式

利用实时荧光定量PCR技术检测梭鲈ho1基因在组织中 (皮肤、肌肉、心、肝、肾、肠、脑、鳃)的表达情况，结果显示 (图6)，常氧条件下ho1广泛分布于各个组织，但出现明显的组织差异性。ho1在脑中的表达量最高，且相较其他组织呈现极显著性差异 (P<0.01)；其次是肝、肾、鳃、肠，而在皮肤和肌肉中的表达量较少。

图  6  梭鲈ho1在各组织的相对表达量

注：图中数值为“平均值±标准差”(N=3)，不同字母表示组间差异极显著(P<0.01)，后图同此。

Fig. 6  Relative expression of ho1 in different tissues of S. lucioperca

Note: The values are "$ { {\overline X } \pm {\minifont \rm{SD}}}$" (N=3). Different letters indicate extremely significant differences among the tissues (P<0.01). The same below.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   低氧胁迫和复氧对梭鲈ho1表达的影响

在低氧胁迫过程中，ho1在梭鲈皮肤、鳃中的变化更迅速，其表达量极显著升高 (图7-a、7-b)，分别在第3、第6小时迅速升至最高点，而后开始下降；复氧第0.5小时，皮肤ho1持续下降，鳃ho1则显著升高，之后均呈现升高-降低的表达趋势，但鳃组织的相对表达量变化较不稳定；至复氧第9小时，ho1在梭鲈皮肤、鳃中表达量基本可恢复至正常水平。在低氧胁迫前3 h，梭鲈心、肾、肝中ho1无显著性变化 (图7-c、7-d、7-e)，3 h后表达量才开始升高，在低氧第6、第9小时均显著高于正常水平；复氧后均呈现出降低-升高-降低的变化趋势，且极显著高于对照组 (P<0.01)；心、肾中ho1在复氧第6、第9小时后与对照组无显著性差异 (P>0.05)，而肝ho1表达量直至复氧第12小时也未恢复至正常状态，仍与对照组有极显著差异。梭鲈脑中ho1在低氧期间的相对表达量呈降低-升高-降低趋势 (图7-f)，胁迫第3、第9小时的表达量均低于对照组，且差异显著 (P<0.05)；复氧的前3 h，梭鲈脑中ho1先上调再下调；3 h后ho1在脑中表达量逐渐升高，6 h后与对照组无显著性差异 (P>0.05)。

图  7  急性低氧胁迫与常氧恢复下梭鲈ho1在组织中表达变化

Fig. 7  Expression of ho1 in S. lucioperca under acute hypoxia stress and normoxia recovery

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论

3.1   梭鲈ho1序列特征生物信息学分析

目前对血红素加氧酶1的作用及其分子机制的研究已取得一定进展，但主要集中于肿瘤、癌症等人类疾病，近年来水产动物中的HO1研究也日益受到关注。本研究在梭鲈中克隆得到ho1的cDNA序列，并进行生物信息学分析。梭鲈ho1全长1 256 bp，包括840 bp的ORF、162 bp的5'-UTR和254 bp的3'-UTR，共编码279个氨基酸，为亲水性不稳定蛋白。梭鲈HO1蛋白有一个Pfam功能结构域，是血红素加氧酶家族共有的保守功能域^[19]，也是HO1发挥其催化功能的区域；同时HO1蛋白的N末端有一个跨膜结构域，具有跨膜转运功能。有报道称，人HO1的C端被裂解后，可转移到细胞核内，参与由氧化应激介导的表达调控^[20]，梭鲈HO1可能有着与之相似的功能。氨基酸序列比对发现，梭鲈与河鲈、鲤 (Cyprinus carpio)、智人 (Homo sapiens) 等不同物种的 HO1序列有较高相似度；系统发育进化树也表明梭鲈HO1与翘嘴鳜、舌齿鲈和大口黑鲈的氨基酸序列相似性分别为91.84%、88.69%和88.11%，与鲈科鱼类亲缘关系最近，与哺乳动物亲缘关系最远。蛋白结构及同源性分析皆显示梭鲈ho1在进化上具有一定的保守性，推测ho1基因在不同物种间可能发挥着相似的生物学功能。

3.2   梭鲈ho1在不同组织的表达分析

基于ho1属于低氧应激基因，参与哺乳动物多种生理病理调节过程，近年来有关鱼类ho1与环境低氧适应的研究也相继被报道。利用RT-PCR检测ho1在梭鲈脑中的相对表达量最高，在皮肤、肌肉中最少，这与斑马鱼ho1的有关报道一致^[6]。有研究报道，哺乳动物脑组织中血红素加氧酶1蛋白水平较高^[21]，这也提示ho1可能还具有维持神经元稳态和保护神经元免受应激损伤的作用；但是舌齿鲈脑中ho1表达活性则较低，说明脑组织中血红素加氧酶1的基因表达模式具有较大的物种差异性^[7]。ho1在梭鲈肝脏中也具有高表达特性，而在大多数不直接参与红细胞或血红蛋白代谢的皮肤、肌肉中表达水平较低，这与哺乳动物的研究结果一致^[22]，可能是因为肝脏是血浆中血红蛋白、血红素摄取和降解部位^[23]。Lu等^[24]还发现，草鱼 (Ctenopharyngodon idella) ho1主要在免疫器官中表达，并在抗菌免疫和炎症调节中发挥作用。

3.3   低氧胁迫和复氧对梭鲈ho1基因表达影响

在探究梭鲈血红素加氧酶1对低氧的生理响应中发现，ho1的表达变化与组织类型有关。低氧胁迫前期，梭鲈呼吸频率增加，而ho1在与呼吸有关的组织——皮肤、鳃中也最先作出响应，其相对表达量快速升高，分解血红素速率加快；但梭鲈心、肝、肾中ho1在低氧胁迫3 h后才显著上调。有研究报道，低温低氧条件下，金鱼呼吸频率、鳃化学感应神经上皮细胞中ho1表达量显著提高^[25]；Li等^[26]发现，热应激时梭鲈肌肉、鳃中热休克蛋白70 (Heat shock protein 70, Hsc70) 水平的变化比其他组织更快；也有研究表明，低氧胁迫下鲢 (Hypophthalmichthys molitrix)、青海湖裸鲤 (Gymnocypris przewalskii) 心、肝、肾的超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶 (Catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (Glutathione peroxidase, GSH-Px)活性快速升高^[27-28]。因此，在低氧应激前3 h，ho1主要在梭鲈皮肤、鳃中发挥作用，可以通过调节气体交换、能量代谢、物质循环等过程，来保护机体免受氧化应激损伤；此时心、肝、肾组织或许主要通过提高抗氧化酶活性来抵御低氧应激。持续低氧3 h后，梭鲈ho1在皮肤、鳃中逐渐下调，而在心、肝、肾中则开始显著上调；可能是持续低氧导致梭鲈鳃组织受损，ho1也无法正常行使其抗应激保护功能；多项研究显示，低氧胁迫可使舌齿鲈^[29]、卵形鲳鲹^[30]鳃组织发生病变，并影响其生理功能。因而低氧刺激3 h后，ho1主要在梭鲈心、肝、肾中发挥转录调控作用，可能参与调节其磷酸化途径、提高细胞自噬能力来保护组织免受损伤^[31-33]。梭鲈脑则与其他组织不同，在低氧胁迫第3、第9小时，ho1的表达受到短暂抑制，这与Guan等^[9]报道的低氧可使团头鲂脑ho1的表达量降低的研究结果类似；说明在低氧胁迫下，ho1在梭鲈脑中具有独特的调节机理，但是否与脑细胞的凋亡机制有关还需深入研究。

在常氧恢复阶段，梭鲈皮肤、心、肝、肾ho1的相对表达量均在复氧0.5 h内迅速下降，之后均再次升高，说明这些组织通过持续高表达ho1来补偿或缓冲由常氧恢复而造成的应激，使生物体尽快恢复至稳定状态以发挥正常的生理功能^[34]。复氧第12小时，肝ho1的表达水平仍高于对照组，说明长时间低氧对梭鲈肝组织产生的氧化应激影响较大，但是否引起肝损伤，还有待深入探讨；其他组织在复氧第12小时后ho1相对表达量基本可恢复至正常，与胁迫前无显著性差异，这与低氧对鱼类组织学、抗氧化酶活性的研究结果相一致^[35-37]。梭鲈鳃ho1在复氧过程中表现出复杂的变化，在恢复伊始，ho1表达量迅速升高又降低，可能是水体DO突然增多，直接提高了鳃瓣上皮细胞氧气的摄入量，需要更多的血红素降解产物参与氧气的运输，形成了一定的应激性变化；但1 h后，梭鲈显然未完全恢复，再次上调ho1的表达以避免因常氧应激造成的组织损伤，使鳃组织尽快恢复以维持机体各项生理机能的正常运转。

综上所述，梭鲈ho1具有较高的保守性，与其他硬骨鱼类高度同源。ho1在梭鲈多个组织中广泛表达，但响应低氧应激时具有组织及时间差异性。低氧刺激前3 h，梭鲈ho1主要在皮肤、鳃中发挥作用，其变化更灵敏；低氧胁迫3 h后，ho1主要在梭鲈心、肝、肾中发挥转录调控作用，且低氧刺激对梭鲈肝组织ho1的表达产生了较大影响。