鱼糜的凝胶强度很大程度取决于相邻的肌球蛋白分子间的相互作用，在以60℃为中心，50~70℃范围内，鱼糜会发生凝胶劣化(modori)现象, 据国外学者^[1-4]研究，鲑鱼、鲭鱼、太平洋鳕鱼等鱼肌肉里含有较多的内源性热稳定蛋白酶，在鱼糜生产及冷藏过程中内源性蛋白酶不易失去活性，因此以这些鱼为原料加工成鱼糜将会使鱼糜的肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MHC)分解而造成解胶，进而影响鱼糜凝胶强度。国内孔保华^[3]的研究表明，在鲢鱼加工成鱼糜过程中漂洗前肌肉中组织蛋白酶B(cathepsin B)活性最高，其次是组织蛋白酶L(cathepsin L)和组织蛋白酶H(cathepsin H)。漂洗后cathepsin L活性最高，cathepsin B和cathepsin H较低，漂洗后3种酶累积活性最高是在55℃。

组织蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶大家族，在折叠方式及活性位点氨基酸残基的排列上都类似木瓜蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶抑制剂可与木瓜蛋白酶结合形成可逆的复合物而抑制蛋白酶的活性。为了防止原料鱼肉内源性蛋白酶所引起的鱼糜凝胶强度下降，改善鱼糜品质，科研人员尝试将蛋白酶抑制剂加入鱼糜里。这方面以海水鱼为对象的研究比较多。Izquierdo-Pulido等^[4]和Benjakul等^[5]分别将水稻cystatin应用于太平洋鳕鱼和剑齿鲽鱼糜的加工，以拮抗蛋白酶，这2种鱼是鱼糜生产上常用的鱼类。江善宗^[6]将recombinant chicken cystatin(重组鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂)加入鲭鱼鱼浆，发现在鱼糜加工过程中与未添加抑制剂相比，鲭鱼肌球蛋白被严重水解的情形有所缓解。本研究是利用基因工程技术表达中华鲟半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因，查明来自鱼类的蛋白酶抑制剂对鲢鱼糜肌球蛋白的降解是否有更好的抑制效果，从而为改善淡水鱼鱼糜品质奠定基础。

1.   材料和方法

1.1   试验材料、试剂及主要仪器

1.1.1   试验材料

试验用鲢均购买自广州水产品市场。

1.1.2   试剂

丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺为Fluka公司产品，木瓜蛋白酶(ΜSP/6000/mg)为E.Merch公司产品，甘氨酸为Amresco公司产品，十二烷基硫酸钠(SDS)、β-巯基乙醇、Tris等试剂均为国产分析纯试剂。低分子量标准蛋白质购自中国科学院上海生物化学研究所。

1.1.3   试验设备

HZS-H型水浴振荡器/HZQ-C空气浴振荡器系哈尔滨市东联电子技术开发有限公司产品，水浴锅LKB bromma2219，离心机Sigma1-15，电泳仪美国Bio-Rad mini-protein3，AlphaImager^TM凝胶成像分析系统等。

1.2   试验方法

1.2.1   基因重组cystatin的制备

基因重组中华鲟cystatin酵母菌GS115 (pPICZα-cystatin)由本实验室构建。参照马冬梅^[7]提出的优化条件培养该酵母，添加甲醇到最终浓度0.5%连续诱导3 d，4℃下12 000 rpm离心30 min收集上清，进行SDS-PAGE电泳，检测目标蛋白表达情况。

1.2.2   重组cystatin活性分析

参照周慧等^[8]的方法，每支试管中加入50 μL酪蛋白(5 mg ·mL^-1)和适量的表达产物，37℃温浴10 min后，加入30 μL木瓜蛋白酶(1 mg · mL^-1)，再加入缓冲液M[50 mmol · L^-1 Tris-HCl(pH 7.6), 2 mmol · L^-1半胱氨酸盐酸盐，0.1 mmol · L^-1 EDTA]至终体积300 μL，37℃温浴20 min后，加入考马斯亮兰G-250溶液，混匀，室温放置20 min，测定OD₅₉₅，抑制活性由下面公式反映：

ΔOD₅₉₅= OD₅₉₅- OD₅₉₅'

其中ΔOD₅₉₅表示加入重组cystatin与不加重组cystatin吸光值的差值，每一数据测定2个平行，取其平均值，以不加cystatin只加缓冲液的管作空白对照。绘制抑制活性曲线。

1.2.3   鱼糜样品的制作

将鲜活鲢鱼体洗净，去鳞、头、尾及内脏，除去胸腹腔黑膜，采集鱼肉，将鱼肉经过2次预冷的蒸馏水漂洗，纱布沥干，添加相当于鱼肉质量3%的NaCl，用组织捣碎机擂溃5 min (每开动1 min停30 s以防止过热)，样品取出后分成3份，2份添加重组cystatin至终浓度分别为0.0107、0.0215 mg · g^-1鱼肉，在研钵内搅拌均匀作为试验组，另一份未加cystatin的作为对照组。

1.2.4   温浴处理

样品分别装于离心管，在55℃分别温浴15, 30, 45和90 min，然后煮沸30 min, 4℃低温保存。其中1管未加cystatin的对照不经温浴，直接煮沸处理。

1.2.5   SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

按参考文献[9]的方法并略作改动。取少量温浴处理样品在12%分离胶进行SDS-PAGE。恒定电压185 V，45 min后取出凝胶放入0.25%考马斯亮兰R-250染色2 h，用脱色液(甲醇：冰醋酸：双蒸水=25：5：70)脱色干净。

1.2.6   凝胶扫描及图像处理

SDS-聚丙烯凝胶电泳凝胶使用Alphainnotech公司的AlphaImager^TM系统扫描并进行图像处理。该系统含AlphaeaseFC^TM软件。

2.   实验结果

2.1   重组cystatin在酵母中的表达

重组cystatin在酵母中的表达见图 1。通过Bradford法测定表达上清总蛋白含量及凝胶薄层扫描分析SDS-PAGE凝胶，测得目标蛋白的表达量约为200 mg · L^-1。

图  1  SDS-PAGE检测诱导的重组菌

1.诱导3 d的重组cystatin；2.对照诱导(3 d)；M.低分子量标准蛋白

Figure  1.  SDS-PAGE detect the expression of GS115 (pPICZαA-cystatin) induced

1.cystatin-pPICZαA-GS115 induced 3 d; 2.pPICZαA-GS115 induced 3 d; M.low molecular weight protein marker

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2.2   重组cystatin活性测定

重组cystatin对木瓜蛋白酶活性的抑制结果见表 1。

表  1  重组cystatin对木瓜蛋白酶活性的抑制效果

Table  1.  The inhibitory effect of cystatin to papain

样品号 sample no.	缓冲液/μL buffer	酪蛋白/5 μg·μL-1 casein	木瓜酶/1 μg·μL-1 papain	cystatin /μg	OD595	$\overline{\mathrm{OD}_{595}}$	ΔOD595
0	230	50	20	0	0	0.452	0.000
1	226	50	20	0.86	0.487	0.491	0.039
2	226	50	20	0.86	0.495
3	224	50	20	1.29	0.484	0.483	0.031
4	224	50	20	1.29	0.483
5	222	50	20	1.72	0.516	0.501	0.049
6	222	50	20	1.72	0.487
7	220	50	20	2.15	0.487	0.506	0.054
8	220	50	20	2.15	0.526
9	218	50	20	2.58	0.526	0.511	0.059
10	218	50	20	2.58	0.496
11	224	50	20	3.01	0.528	0.533	0.081
12	224	50	20	3.01	0.538
注：缓冲液为0.05 mmol · L-1 Tris-HCl (pH7.6)，0.1 mmol · L-1 EDTA，2 mmol · L-1半胱氨酸盐酸盐 Note: Buffer is 0.05mmol · L-1 Tris-HCl (pH7.6), 0.1 mmol · L-1 EDTA, 2 mmol · L-1 cysteine hydrochloride monohydrate solution.

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以加入抑制剂的量为横坐标，ΔOD₅₉₅为纵坐标，制作重组cystatin对木瓜蛋白酶的抑制活性曲线(图 2)。

图  2  重组cystatin抑制活性曲线

底物：木瓜蛋白酶；反应时间：20 min；反应温度：37℃；缓冲液：50 mM Tris-HCl(pH 7.6)，2 mM半胱氨酸盐酸盐，0.1 mM EDTA

Figure  2.  The curve of cystatin inhibitory activity

Substrate: papain; reaction period: 20 min; reaction temperature: 37℃; buffer: 50 mM Tris-HCl(pH 7.6), 2 mM cysteine hydrochloride monohydrate, 0.1 mM EDTA

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抑制作用曲线分析表明：在3 μg以内，随cystatin含量增加，抑制活力也成比例增强，显示很好的线性关系，曲线方程为y=0.0234x+0.0059(r²=0.9176)。

2.3   鱼糜样品SDS-PAGE电泳结果

2.3.1   重组cystatin对鲢鱼肌球蛋白的保护作用

实验结果表明与未加cystatin对照相比较，添加cystatin量0.0107 mg · g^-1鱼肉的，MHC变化区别不明显；添加量为0.0215 mg · g^-1鱼肉的，MHC变化结果较明显，其电泳扫描图见图 3。

图  3  重组cystatin对鲢鱼肌球蛋白的保护作用

1.未加cystatin未经55℃温浴; 2~5.未加cystatin在55℃温浴15, 30, 45和90 min；6~9.加cystatin在55℃温浴15, 30, 45和90 min；10.低分子量标准蛋白；MHC肌球蛋白重链；AC肌动蛋白

Figure  3.  Electrophoresis profile of recombinant cystatin protection to myosin of silver carp

1.no cystatin and not heated in 55℃; 2~5.no cystatin heating for 15, 30, 45 and 90 min; 6~9.added cystatin and heating for 15, 30, 45 and 90 min; 10.low range protein molecular markers; MHC.myosin heavy chain; AC.actin

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2.3.2   AlphaeaseFC^TM软件分析SDS-PAGE结果

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶经AlphaeaseFC^TM分析，得到2条主要蛋白带(MHC和AC)在整个泳道蛋白中占的百分比，数据见表 2。

表  2  AlphaeaseFC^TM软件分析电泳凝胶结果

Table  2.  AlphaeaseFC^TM soft analysis of the SDS-PAGE gel output  %

	肌球蛋白重链含量MHC content of myosin heavy chain			肌动蛋白含量AC content of actin
	未加 cystatin no cystatin	添加 cystatin added cystatin		未加 cystatin no cystatin	添加 cystatin added cystatin
0	56.7			33.4
15	51.0	52.7		24.4	19.6
30	38.9	46.5		24.6	29.2
45	30.9	43.8		39.0	29.5
90	26.3	30.1		37.0	28.8

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2.3.3   MHC含量变化趋势图

根据表 2的数据做出添加cystatin与未添加cystatin鱼糜中MHC含量随温浴时间变化趋势图见图 4。

图  4  MHC含量变化趋势图

Figure  4.  MHC content change curve

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3.   分析与讨论

由图 3可以直观地看出，未经55℃处理直接煮沸30 min样品其肌球蛋白重链(MHC)条带最宽，即含量最高，表明鱼糜加工时快速通过内源性蛋白酶最适作用温度带时，肌球蛋白重链降解最少。未加cystatin样品随着在55℃温浴时间延长，MHC条带逐渐变窄，而肌动蛋白(AC)条带逐渐变宽。表明肌球蛋白重链逐渐被降解成小分子量寡肽。而添加了cystatin的样品虽然也有同样趋势，但MHC下降的幅度较为平缓，表明添加cystatin后肌球蛋白受到一定的保护，第9泳道的样品AC含量与第8泳道相比反而有所下降，原因可能在于加热时间过长，cystatin已经失活，据马冬梅^[10]研究，重组cystatin的活性随着温度的升高而降低，在70~80℃之间活性下降的最快，到90℃以上基本就没有活性了，也有可能是AC处于长时间高温亦有所降解。

AlphaeaseFC^TM软件处理结果从数量上支持上述结论。未加cystatin且未经55℃处理直接煮沸的样品MHC含量占总蛋白的一半多(56.7%)，未加cystatin的样品随着在55℃温浴时间增加，MHC含量从51%下降至26.3%，下降曲线几乎成为一条直线。添加cystatin的样品在45 min内随着温浴时间增加，MHC变化平缓，45~90 min期间下降较快，可能是cystatin失活所致。

4.   展望

由实验结果可知，重组cystatin对鱼糜加工过程中肌球蛋白重链具有保护作用。因此将它作为添加剂应用于鱼糜加工，可以弥补凝胶化过程中鱼糜弹性的降低，改善鱼糜的品质，生产出高质量的鱼糜，为淡水鱼作为鱼糜加工的原料消除一个严重的缺陷。