长臀(Cranoglanis bouderius) 隶属鲇形目、长臀科、长臀属，是我国珠江水系特有的名贵经济鱼类，具有重要的开发利用价值^[1]，在我国被列为易危对象^[2]。本研究旨在建立一套适于长臀的扩增酶切片段长度多态性(amplified fragment length polymophism，AFLP)技术体系，为进行长臀的遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建、分子标记等研究奠定基础。

AFLP是ZABEAU等^[3]于1993年建立的一种DNA分子标记技术。AFLP技术具有所需DNA量少，可以研究未知序列的DNA，实验结果稳定可靠，重复性强，呈典型的孟德尔遗传的特点^[4]。在分子生物学及动、植物育种等领域具有广泛的应用前景，尤其是构建动、植物DNA指纹图谱具有重要价值。

1.   材料与方法

1.1   材料

实验材料长臀取自广东罗非鱼良种场，共30尾。实验鱼活体带回实验室，取全血，柠檬酸-葡萄糖抗凝剂(acid-citrate-dextrose，ACD)抗凝、-20℃保存直到DNA提取。所有引物及接头均购自上海申能博采生物工程公司，经聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE胶)纯化。所用试剂均为国产分析纯试剂。

1.2   基因组DNA的制备

采用苯酚-氯仿法和试剂盒分别从血液中提取基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度仪检测其浓度和纯度，并调整DNA浓度至50 ng ·μL^-1，4℃保存备用。

1.3   AFLP分析体系的建立

1.3.1   基因组DNA用量

采用限制性内切酶进行酶切时，在20 μL酶切体系中分别加入50、100、200、300、400 ng基因组DNA，比较不同量DNA的酶切效果。

1.3.2   Pst I单酶切

酶切和连接在同一反应中，总体积为20 μL，其中包括: 10×buffer 2 μL，Pst I 20 U，T4连接酶2U，ATP 1 mmol·L^-1，BSA 2 μL，Pst I接头2 μL，基因组DNA，加水至20 μL；37℃保温1 h，20℃保温1 h，5个循环，70℃15 min灭活酶。AFLP-PCR反应25 μL反应体系中含10×buffer 2.5 μL，Mg²⁺ 1.5 mmol·L^-1，引物2 pmol，模板10 ng，Taq DNA聚合酶1 U，dNTP 200 μmol·L^-1，反应条件为94℃、1 min，56℃、1 min，72℃、1.5 min，35个循环后72℃、10 min。

1.3.3   双酶切

采用EcoR I/Mse I和Pst I/Taq I 2种限制性内切酶组合进行酶切。酶切和连接分2步进行。酶切反应总体积为20 μL，其中包括: 10×buffer 2 μL，BSA 2 μL，基因组DNA，2种限制性内切酶，加水至20 μL；连接反应总体积为20 μL，其中包括10×buffer 2 μL，接头2 μL，酶切产物10 μL，T4连接酶2 U，加水至20 μL。E/M酶切反应条件是37℃、3 h，65℃、15 min灭活酶；连接反应条件是37℃、10 h，70℃、10 min灭活酶，-20℃保存。P/T酶切反应条件是65℃、2 h，加Pst I，37℃、2 h，80℃、20 min灭活酶；连接反应条件是22℃、5 h，70℃、10 min灭活酶，-20℃存。

1.3.4   预扩增

直接取连接产物1 μL预扩增，总体积20 μL，包括: 10×buffer 2 μL，dNTPs 0.4 μL，引物各0.25 μL，Taq酶0.2 μL，Mg²⁺ 1.5 mmol·L^-1，加水至20 μL。混匀后，按如下PCR条件扩增，95℃、3 min，56℃、1 min，72℃、1.5 min，共25个循环。预扩增结束后，产物-20℃保存备用。

1.3.5   选择性扩增

将预扩增产物稀释10倍、20倍、50倍、100倍进行选择性扩增，取1 μL稀释后的预扩增混合液，加入19 μL如下反应液，dNTPs 0.4 μL；引物各0.4 μL；Taq酶0.2 μL；buffer 2 μL；Mg²⁺ 1.5 mmol·L^-1；加水至20 μL。混匀后，按如下PCR条件扩增，95℃、3 min；94℃、1 min；65℃、30 s；72℃、1 min；每个循环退火温度降0.7℃，共12个循环；然后改为94℃、1 min；56℃、30 s；72℃、1 min，共23个循环。产物-20℃保存备用。

1.3.6   产物电泳检测

用8%的聚丙烯酰胺凝胶结合银染法检测。电泳采用300 V恒压电泳2.5 h；银染按许绍斌等^[5]使用的快速银染法进行。

2.   结果与分析

2.1   模板DNA的检测

采用苯酚-氯仿抽提法和试剂盒法提取基因组DNA。从电泳结果看，所提基因组DNA主带清晰，DNA片段在23 kb以上，没有降解(图 1)，基因组DNA的光密度值OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8左右，说明DNA纯度高，蛋白质含量极少，完全能满足AFLP分析对DNA的要求。苯酚-氯仿抽提法提取的DNA浓度差异大，产量不稳定；相比之下试剂盒法提取DNA产量稳定，浓度大，更适合用于AFLP标记分析，但是AFLP标记分析所需DNA量极少(100 ng)，从减少费用考虑，苯酚-氯仿抽提法制取DNA用于AFLP标记分析也是完全可行的。

图  1  基因组DNA电泳图

a. 苯酚-氯仿抽提法；b. 试剂盒法

Figure  1.  The electrophore tic pattern of genomic DNA

a. Phenol-Chlorofrom exetracting method; b. method of kid

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2.2   酶切

AFLP分析一般使用双酶切，即采用稀有碱基切点酶和常见碱基切点酶同时进行消化。酶切时，在20 μL酶切体系中设计基因组DNA用量梯度，比较不同量DNA的酶切效果，从电泳图谱上看，不同量DNA的酶切效果基本一致(图 2)。本试验比较了2种双酶切组合(EcoR I/Mse I、Pst I/Taq I)在长臀中的酶切效果，EcoR I/Mse I组合基因组切点数量多，酶切片段较小，主带消失，呈梯度模糊状，片段大小在50~1 200 bp之间。Pst I/Taq I组合酶切完全，片段大小在100~1 200 bp之间，2种酶切都符合AFLP对酶切片段的要求。此外，实验还进行了Pst I单酶切试验，但酶切片段较大。

图  2  DNA用量梯度EcoR I/Mse I酶切电泳图

M. 100bp DNA标记(以下marker相同)；1. 50 ng基因组DNA；2. 100 ng基因组DNA；3. 200 ng基因组DNA；4. 300 ng基因组DNA；5. 400 ng基因组DNA

Figure  2.  The electrophore tic pattern of DNA gradient reaction by EcoR I/Mse I digestion

M. 100bp DNA marker (The following maker is same); 1. 50 ng gentics DNA; 2. 100 ng gentics DNA; 3. 200 ng gentics DNA; 4. 300 ng gentics DNA; 5. 400 ng gentics DNA

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2.3   连接

连接效率的高低主要取决于T4-DNA连接酶的用量、连接温度及连接时间。连接反应中，T4-DNA连接酶的用量以2 U为宜，连接温度一般为37℃，但也需要根据实验调整，如Pst I/Taq I酶切后，使用4 U的T4连接酶，3 h即能完成连接反应。而且，连接温度最好用22℃，过高的连接温度会延长连接时间。

2.4   扩增

AFLP分析中，双酶切使用2次扩增反应，而单酶切只需要一次扩增。在实验中双酶切时，将预扩增产物进行梯度稀释，其选择性扩增产物差别很小(图 3)，因此，在实验过程中，一般稀释20倍就足以进行大量选扩。实验中Pst I单酶切长臀的电泳图谱显示单酶切的扩增片段大、数量少，且集中在凝胶的上部，因此，不适用于长臀(图 4)。在进行长臀AFLP分析时，双酶切EcoR I/Mse I、Pst I/Taq I均能得到清晰的电泳图谱(图 5、图 6)。Pst I/Taq I双酶切时，引物P+ATT/T+ACA在珠江长臀中共扩增出44条带，其中8条具有多态性，多态性检测效率为18.2%，EcoR I/Mse I双酶切时，引物E+AAG/M+CTG在珠江长臀中共扩增出64条带，其中22条具有多态性，多态性检测效率为34.3%。P+ATT/T+ACA、E+AAG/M+CTG的指纹图谱扩增带清晰可见，扩增信号强度基本一致，说明AFLP指纹图谱质量很高，从图中还可以看出，片段大小在400 bp以上多态性较丰富，片段在400 bp以下多态性较差。相对来说，Pst I/Taq I酶切扩增带信号强度和分布要好于EcoR I/Mse I双酶切，但EcoR I/Mse I双酶切的扩增条带数和多态性检出率要好。

图  3  预扩增产物梯度稀释选扩电泳图谱

1. 预扩增产物稀释10倍；2. 预扩增产物稀释20倍；3. 预扩增产物稀释50倍；4. 预扩增产物稀释100倍

Figure  3.  The electrophore tic pattern of gradient amplification reaction after preamplification

1. 10 times diluting of production of preamplification; 2. 20 times diluting of production of preamplification; 3. 50 times diluting of production of preamplification; 4. 100 times diluting of production of preamplification

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图  4  长臀基因组DNA的Pst I单酶切电泳图谱

Figure  4.  AFLP pattern of Pst I digestion of genomic DNA from C.bouderius

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图  5  长臀基因组DNA的P+ATT/T+ACA引物扩增图谱

Figure  5.  AFLP pattern of the primer P+ATT/T+ACA of genomic DNA from C.bouderius

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图  6  长臀基因组DNA的E+AAG/M+CTG引物扩增图谱

Figure  6.  AFLP pattern of the primer E+AAG/M+CTG of genomic DNA from C.bouderius

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3.   讨论

自1993年以来，已有许多研究者开展了AF LP技术及体系研究，但对不同物种，其AFLP关键技术参数不同，因而使用的体系不尽相同^[6-10]。AFLP对DNA的质量要求较高，因而提取高纯度无污染的DNA乃是实验成功的先决条件。被污染或降解的DNA不能扩增出条带或条带可重复性差。有研究者认为，如DNA样品中含有少量RNA或蛋白质成分，不会影响扩增；但是，如其中含多糖或多酚成分，则会严重影响DNA聚合酶的活性，干扰引物与模板的结合，导致扩增失败^[4]。本试验比较了苯酚-氯仿抽提法和试剂盒法提取基因组DNA。2种方法所提基因组DNA的主带清晰，DNA片段在23 kb以上，几乎没有降解，完全能满足AFLP分析对DNA的要求，但苯酚-氯仿抽提法提取的DNA浓度差异大，产量不稳定；已有研究表明，个体DNA的浓度一致性对AFLP有重要影响；模板的浓度差异过大，会导致假阳性的比例大增^[11]，因此，在AFLP分析中，试剂盒法更适于提取DNA。

关于酶切的内切酶酶切种类和方式。在长臀的AFLP分析体系中，本试验尝试了3种酶切方式，EcoR I/Mse I双酶切、Pst I/Taq I双酶切、Pst I单酶切。结果表明，2种双酶切组合均能得到理想的结果，而单酶切的酶切片段过大、数量少，且相对集中，因此，在长臀AFLP分析体系中是不宜采用单酶切方式的。

扩增产物的多少主要取决于待测样品基因组大小和引物3′末端选择性碱基的数目。选择性碱基数一般不超过3个，大于10⁸ bp的基因组DNA可选用3个选择性碱基，10⁵~10⁶ bp的基因组DNA可选用2个选择性碱基，在此范围内每增加一个碱基可减少3/4的扩增带谱；而且随着选择性碱基数目的增加，引物与模板的错配频率也相应增加，扩增特异性下降。当选择性碱基数增加到4个时，有假带现象产生^[12]，如果选择性碱基数过少，扩增产物太多，则扩增条带过密不易分辨。此外，选择性碱基的组成也会影响扩增片段的数量。一般而言，选择性碱基中C、G含量越高，扩增出的产物数目越少；对富含A、T的生物体基因组来说，用富含A、T选择性碱基的引物能获得更多的扩增片段^[12]。在本试验中，由于长臀基因组大小未知，选择“3+3”组合的引物扩增，扩增条带数在50条左右，对长臀的AFLP分析是适宜的。

除了以上讨论的因素外，还有许多因素会影响到试验结果。例如在酶切和连接过程中，酶切一定要彻底，连接要充分，最好将酶切与连接在PCR仪上进行，这样能够精确保温，取得满意结果；在胶的制备中，洗板要干净，涂板一定要均匀，否则胶会在洗板过程中脱落，并且制板过程中还要避免出现气泡，因为胶中的气泡会影响样品的泳动，使条带成锯齿形，影响观察；在染色过程中，AgNO₃一定要充分混匀，否则胶板会出现斑点，影响照相；染色时间应掌握在10 min左右，过长会出现“白板”或板的背景过深；显影液的温度往往影响显影的效果，一般4℃左右即可，过低会使胶板显带时间延长，背景变深^[13]等。

4.   结论

(1) 长臀AFLP指纹分析时，基因组DNA提取宜采用试剂盒法，如考虑到实验成本，采用苯酚-氯仿抽提法也是可行的。

(2) 连接反应中，T4-DNA连接酶的用量以2 U为宜，连接温度一般为37℃。

(3) 酶切反应应该使用双酶切，EcoR I/Mse I双酶切、Pst I/Taq I双酶切都可行；在实验过程中，一般预扩增产物稀释20倍就足以进行大量选扩；选扩首先使用Touch-down PCR，进行12个循环后，再采用常规PCR方法进行23个循环。

(4) 引物3′末端选择性碱基的数目，选择“3+3”组合对长臀的AFLP分析是适宜的。

本试验旨在建立AFLP用于长臀指纹分析的方法体系，因此，对其分析过程中DNA提取、单、双酶切、连接、预扩增、选择性扩增、银染等关键因素进行了优化，建立了长臀稳定的AFLP分析体系，为进一步进行分子标记研究如遗传多样性、遗传相似性奠定了基础。