The establishment of AFLP analysis system in research of armorhead catfish, Cranoglanis bouderius
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摘要:
以珠江长臀(Cranoglanis bouderius)为试验材料,建立了长臀扩增酶切片段长度多态性(AFLP)分析体系,对其分析过程中的DNA提取、双酶切、单酶切、连接、预扩增、选择性扩增、银染等步骤进行了检测,并对反应条件进行了优化。用Pst I/Taq I、EcoR I/Mse I等2组双酶切组合构建长臀的AFLP指纹图谱,条带清晰可辨,扩增信号强,得到清晰的长臀AFLP指纹图谱。
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关键词:
- 长臀 /
- 扩增酶切片段长度多态性(AFLP) /
- 条件优化 /
- DNA指纹
Abstract:AFLP (amplified fragment length polymorphism) analysis system was established in research of Pearl River armorhead catfish, Cranoglanis bouderius. The several steps for AFLP analysis were examined, including DNA extraction, double-restriction endonuclease reaction, single-restriction endonuclease reaction, adadpter ligation reaction, preamplification reaction, selective amplification reaction and Ag-NORs reaction. The AFLP fingerprinting experiments of C.bouderius with primer combination, E+AAG/M+CTG and P+ATT/T+ACA, were performed, which had about 50 clear and bright amplification bands.
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长臀(Cranoglanis bouderius) 隶属鲇形目、长臀科、长臀属,是我国珠江水系特有的名贵经济鱼类,具有重要的开发利用价值[1],在我国被列为易危对象[2]。本研究旨在建立一套适于长臀的扩增酶切片段长度多态性(amplified fragment length polymophism,AFLP)技术体系,为进行长臀的遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建、分子标记等研究奠定基础。
AFLP是ZABEAU等[3]于1993年建立的一种DNA分子标记技术。AFLP技术具有所需DNA量少,可以研究未知序列的DNA,实验结果稳定可靠,重复性强,呈典型的孟德尔遗传的特点[4]。在分子生物学及动、植物育种等领域具有广泛的应用前景,尤其是构建动、植物DNA指纹图谱具有重要价值。
1. 材料与方法
1.1 材料
实验材料长臀取自广东罗非鱼良种场,共30尾。实验鱼活体带回实验室,取全血,柠檬酸-葡萄糖抗凝剂(acid-citrate-dextrose,ACD)抗凝、-20℃保存直到DNA提取。所有引物及接头均购自上海申能博采生物工程公司,经聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE胶)纯化。所用试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 基因组DNA的制备
采用苯酚-氯仿法和试剂盒分别从血液中提取基因组DNA,经琼脂糖凝胶电泳,紫外分光光度仪检测其浓度和纯度,并调整DNA浓度至50 ng ·μL-1,4℃保存备用。
1.3 AFLP分析体系的建立
1.3.1 基因组DNA用量
采用限制性内切酶进行酶切时,在20 μL酶切体系中分别加入50、100、200、300、400 ng基因组DNA,比较不同量DNA的酶切效果。
1.3.2 Pst I单酶切
酶切和连接在同一反应中,总体积为20 μL,其中包括: 10×buffer 2 μL,Pst I 20 U,T4连接酶2U,ATP 1 mmol·L-1,BSA 2 μL,Pst I接头2 μL,基因组DNA,加水至20 μL;37℃保温1 h,20℃保温1 h,5个循环,70℃15 min灭活酶。AFLP-PCR反应25 μL反应体系中含10×buffer 2.5 μL,Mg2+ 1.5 mmol·L-1,引物2 pmol,模板10 ng,Taq DNA聚合酶1 U,dNTP 200 μmol·L-1,反应条件为94℃、1 min,56℃、1 min,72℃、1.5 min,35个循环后72℃、10 min。
1.3.3 双酶切
采用EcoR I/Mse I和Pst I/Taq I 2种限制性内切酶组合进行酶切。酶切和连接分2步进行。酶切反应总体积为20 μL,其中包括: 10×buffer 2 μL,BSA 2 μL,基因组DNA,2种限制性内切酶,加水至20 μL;连接反应总体积为20 μL,其中包括10×buffer 2 μL,接头2 μL,酶切产物10 μL,T4连接酶2 U,加水至20 μL。E/M酶切反应条件是37℃、3 h,65℃、15 min灭活酶;连接反应条件是37℃、10 h,70℃、10 min灭活酶,-20℃保存。P/T酶切反应条件是65℃、2 h,加Pst I,37℃、2 h,80℃、20 min灭活酶;连接反应条件是22℃、5 h,70℃、10 min灭活酶,-20℃存。
1.3.4 预扩增
直接取连接产物1 μL预扩增,总体积20 μL,包括: 10×buffer 2 μL,dNTPs 0.4 μL,引物各0.25 μL,Taq酶0.2 μL,Mg2+ 1.5 mmol·L-1,加水至20 μL。混匀后,按如下PCR条件扩增,95℃、3 min,56℃、1 min,72℃、1.5 min,共25个循环。预扩增结束后,产物-20℃保存备用。
1.3.5 选择性扩增
将预扩增产物稀释10倍、20倍、50倍、100倍进行选择性扩增,取1 μL稀释后的预扩增混合液,加入19 μL如下反应液,dNTPs 0.4 μL;引物各0.4 μL;Taq酶0.2 μL;buffer 2 μL;Mg2+ 1.5 mmol·L-1;加水至20 μL。混匀后,按如下PCR条件扩增,95℃、3 min;94℃、1 min;65℃、30 s;72℃、1 min;每个循环退火温度降0.7℃,共12个循环;然后改为94℃、1 min;56℃、30 s;72℃、1 min,共23个循环。产物-20℃保存备用。
1.3.6 产物电泳检测
用8%的聚丙烯酰胺凝胶结合银染法检测。电泳采用300 V恒压电泳2.5 h;银染按许绍斌等[5]使用的快速银染法进行。
2. 结果与分析
2.1 模板DNA的检测
采用苯酚-氯仿抽提法和试剂盒法提取基因组DNA。从电泳结果看,所提基因组DNA主带清晰,DNA片段在23 kb以上,没有降解(图 1),基因组DNA的光密度值OD260/OD280比值在1.8左右,说明DNA纯度高,蛋白质含量极少,完全能满足AFLP分析对DNA的要求。苯酚-氯仿抽提法提取的DNA浓度差异大,产量不稳定;相比之下试剂盒法提取DNA产量稳定,浓度大,更适合用于AFLP标记分析,但是AFLP标记分析所需DNA量极少(100 ng),从减少费用考虑,苯酚-氯仿抽提法制取DNA用于AFLP标记分析也是完全可行的。
2.2 酶切
AFLP分析一般使用双酶切,即采用稀有碱基切点酶和常见碱基切点酶同时进行消化。酶切时,在20 μL酶切体系中设计基因组DNA用量梯度,比较不同量DNA的酶切效果,从电泳图谱上看,不同量DNA的酶切效果基本一致(图 2)。本试验比较了2种双酶切组合(EcoR I/Mse I、Pst I/Taq I)在长臀中的酶切效果,EcoR I/Mse I组合基因组切点数量多,酶切片段较小,主带消失,呈梯度模糊状,片段大小在50~1 200 bp之间。Pst I/Taq I组合酶切完全,片段大小在100~1 200 bp之间,2种酶切都符合AFLP对酶切片段的要求。此外,实验还进行了Pst I单酶切试验,但酶切片段较大。
图 2 DNA用量梯度EcoR I/Mse I酶切电泳图M. 100bp DNA标记(以下marker相同);1. 50 ng基因组DNA;2. 100 ng基因组DNA;3. 200 ng基因组DNA;4. 300 ng基因组DNA;5. 400 ng基因组DNAFigure 2. The electrophore tic pattern of DNA gradient reaction by EcoR I/Mse I digestionM. 100bp DNA marker (The following maker is same); 1. 50 ng gentics DNA; 2. 100 ng gentics DNA; 3. 200 ng gentics DNA; 4. 300 ng gentics DNA; 5. 400 ng gentics DNA2.3 连接
连接效率的高低主要取决于T4-DNA连接酶的用量、连接温度及连接时间。连接反应中,T4-DNA连接酶的用量以2 U为宜,连接温度一般为37℃,但也需要根据实验调整,如Pst I/Taq I酶切后,使用4 U的T4连接酶,3 h即能完成连接反应。而且,连接温度最好用22℃,过高的连接温度会延长连接时间。
2.4 扩增
AFLP分析中,双酶切使用2次扩增反应,而单酶切只需要一次扩增。在实验中双酶切时,将预扩增产物进行梯度稀释,其选择性扩增产物差别很小(图 3),因此,在实验过程中,一般稀释20倍就足以进行大量选扩。实验中Pst I单酶切长臀的电泳图谱显示单酶切的扩增片段大、数量少,且集中在凝胶的上部,因此,不适用于长臀(图 4)。在进行长臀AFLP分析时,双酶切EcoR I/Mse I、Pst I/Taq I均能得到清晰的电泳图谱(图 5、图 6)。Pst I/Taq I双酶切时,引物P+ATT/T+ACA在珠江长臀中共扩增出44条带,其中8条具有多态性,多态性检测效率为18.2%,EcoR I/Mse I双酶切时,引物E+AAG/M+CTG在珠江长臀中共扩增出64条带,其中22条具有多态性,多态性检测效率为34.3%。P+ATT/T+ACA、E+AAG/M+CTG的指纹图谱扩增带清晰可见,扩增信号强度基本一致,说明AFLP指纹图谱质量很高,从图中还可以看出,片段大小在400 bp以上多态性较丰富,片段在400 bp以下多态性较差。相对来说,Pst I/Taq I酶切扩增带信号强度和分布要好于EcoR I/Mse I双酶切,但EcoR I/Mse I双酶切的扩增条带数和多态性检出率要好。
图 3 预扩增产物梯度稀释选扩电泳图谱1. 预扩增产物稀释10倍;2. 预扩增产物稀释20倍;3. 预扩增产物稀释50倍;4. 预扩增产物稀释100倍Figure 3. The electrophore tic pattern of gradient amplification reaction after preamplification1. 10 times diluting of production of preamplification; 2. 20 times diluting of production of preamplification; 3. 50 times diluting of production of preamplification; 4. 100 times diluting of production of preamplification3. 讨论
自1993年以来,已有许多研究者开展了AF LP技术及体系研究,但对不同物种,其AFLP关键技术参数不同,因而使用的体系不尽相同[6-10]。AFLP对DNA的质量要求较高,因而提取高纯度无污染的DNA乃是实验成功的先决条件。被污染或降解的DNA不能扩增出条带或条带可重复性差。有研究者认为,如DNA样品中含有少量RNA或蛋白质成分,不会影响扩增;但是,如其中含多糖或多酚成分,则会严重影响DNA聚合酶的活性,干扰引物与模板的结合,导致扩增失败[4]。本试验比较了苯酚-氯仿抽提法和试剂盒法提取基因组DNA。2种方法所提基因组DNA的主带清晰,DNA片段在23 kb以上,几乎没有降解,完全能满足AFLP分析对DNA的要求,但苯酚-氯仿抽提法提取的DNA浓度差异大,产量不稳定;已有研究表明,个体DNA的浓度一致性对AFLP有重要影响;模板的浓度差异过大,会导致假阳性的比例大增[11],因此,在AFLP分析中,试剂盒法更适于提取DNA。
关于酶切的内切酶酶切种类和方式。在长臀的AFLP分析体系中,本试验尝试了3种酶切方式,EcoR I/Mse I双酶切、Pst I/Taq I双酶切、Pst I单酶切。结果表明,2种双酶切组合均能得到理想的结果,而单酶切的酶切片段过大、数量少,且相对集中,因此,在长臀AFLP分析体系中是不宜采用单酶切方式的。
扩增产物的多少主要取决于待测样品基因组大小和引物3′末端选择性碱基的数目。选择性碱基数一般不超过3个,大于108 bp的基因组DNA可选用3个选择性碱基,105~106 bp的基因组DNA可选用2个选择性碱基,在此范围内每增加一个碱基可减少3/4的扩增带谱;而且随着选择性碱基数目的增加,引物与模板的错配频率也相应增加,扩增特异性下降。当选择性碱基数增加到4个时,有假带现象产生[12],如果选择性碱基数过少,扩增产物太多,则扩增条带过密不易分辨。此外,选择性碱基的组成也会影响扩增片段的数量。一般而言,选择性碱基中C、G含量越高,扩增出的产物数目越少;对富含A、T的生物体基因组来说,用富含A、T选择性碱基的引物能获得更多的扩增片段[12]。在本试验中,由于长臀基因组大小未知,选择“3+3”组合的引物扩增,扩增条带数在50条左右,对长臀的AFLP分析是适宜的。
除了以上讨论的因素外,还有许多因素会影响到试验结果。例如在酶切和连接过程中,酶切一定要彻底,连接要充分,最好将酶切与连接在PCR仪上进行,这样能够精确保温,取得满意结果;在胶的制备中,洗板要干净,涂板一定要均匀,否则胶会在洗板过程中脱落,并且制板过程中还要避免出现气泡,因为胶中的气泡会影响样品的泳动,使条带成锯齿形,影响观察;在染色过程中,AgNO3一定要充分混匀,否则胶板会出现斑点,影响照相;染色时间应掌握在10 min左右,过长会出现“白板”或板的背景过深;显影液的温度往往影响显影的效果,一般4℃左右即可,过低会使胶板显带时间延长,背景变深[13]等。
4. 结论
(1) 长臀AFLP指纹分析时,基因组DNA提取宜采用试剂盒法,如考虑到实验成本,采用苯酚-氯仿抽提法也是可行的。
(2) 连接反应中,T4-DNA连接酶的用量以2 U为宜,连接温度一般为37℃。
(3) 酶切反应应该使用双酶切,EcoR I/Mse I双酶切、Pst I/Taq I双酶切都可行;在实验过程中,一般预扩增产物稀释20倍就足以进行大量选扩;选扩首先使用Touch-down PCR,进行12个循环后,再采用常规PCR方法进行23个循环。
(4) 引物3′末端选择性碱基的数目,选择“3+3”组合对长臀的AFLP分析是适宜的。
本试验旨在建立AFLP用于长臀指纹分析的方法体系,因此,对其分析过程中DNA提取、单、双酶切、连接、预扩增、选择性扩增、银染等关键因素进行了优化,建立了长臀稳定的AFLP分析体系,为进一步进行分子标记研究如遗传多样性、遗传相似性奠定了基础。
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图 2 DNA用量梯度EcoR I/Mse I酶切电泳图
M. 100bp DNA标记(以下marker相同);1. 50 ng基因组DNA;2. 100 ng基因组DNA;3. 200 ng基因组DNA;4. 300 ng基因组DNA;5. 400 ng基因组DNA
Figure 2. The electrophore tic pattern of DNA gradient reaction by EcoR I/Mse I digestion
M. 100bp DNA marker (The following maker is same); 1. 50 ng gentics DNA; 2. 100 ng gentics DNA; 3. 200 ng gentics DNA; 4. 300 ng gentics DNA; 5. 400 ng gentics DNA
图 3 预扩增产物梯度稀释选扩电泳图谱
1. 预扩增产物稀释10倍;2. 预扩增产物稀释20倍;3. 预扩增产物稀释50倍;4. 预扩增产物稀释100倍
Figure 3. The electrophore tic pattern of gradient amplification reaction after preamplification
1. 10 times diluting of production of preamplification; 2. 20 times diluting of production of preamplification; 3. 50 times diluting of production of preamplification; 4. 100 times diluting of production of preamplification
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[1] 周立斌, 刘晓春, 叶卫, 等. 17β-雌二醇和甲基睾酮对离体长臀脑垂体促性腺激素分泌的影响[J]. 中国水产科学, 2005, 12(2): 113-118. doi: 10.3321/j.issn:1005-8737.2005.02.001 [2] 乐佩琦, 陈宜瑜. 中国濒危动物红皮书-鱼类[M]. 北京: 科学出版社, 1998: 13-19. http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/10428 [3] ZEBEAU M, VOS R. Selective estriction fragment amplification: a general method for DNA finger printing[P]. European Patent Application 94202629. 7 Paris: European Patent Office, 1993. https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=58aa828824f0e6bca48f4f5f573f0820
[4] 万翔, 刘富中, 宋明, 等. 茄子AFLP技术体系的优化与建立[J]. 西南农业大学学报: 自然科学版, 2005, 12(2): 226-229. doi: 10.3969/j.issn.1673-9868.2005.02.021 [5] 许绍斌, 陶玉芬, 杨昭庆, 等. 简单快速的DNA银染和胶保存方法[J]. 遗传, 2002, 24(3): 335-336. doi: 10.3321/j.issn:0253-9772.2002.03.027 [6] 张桂华, 杜胜利. 黄瓜AFLP反应体系的建立[J]. 华北农学报, 2004, 19(2): 10-12. https://cpfd.cnki.com.cn/Article/CPFDTOTAL-EGYP201005001018.htm [7] 王赞, 高洪文孙, 韩建国. 柠条锦鸡儿DNA提取及AFLP反应体系的建立[J]. 草地学报, 2005, 13(2): 126-129. doi: 10.11733/j.issn.1007-0435.2005.02.009 [8] 王文江, 张桂霞, 崔惠英, 等. 柿AFLP银染技术体系的建立[J]. 河北农业大学学报, 2005, 28(2): 9-14. doi: 10.3969/j.issn.1000-1573.2005.02.003 [9] 蔡健, 陆娟, 兰伟. 小麦基因组AFLP技术体系建立的研究[J]. 阜阳师范学院学报: 自然科学版, 2005, 22(2): 25-27. doi: 10.3969/j.issn.1004-4329.2005.02.008 [10] 李升康, 熊远著, 邓昌彦. 家猪AFLP分析体系的建立[J]. 华中农业大学学报, 2003, 22(2): 110-113. doi: 10.3321/j.issn:1000-2421.2003.02.003 [11] 吴俊, 束怀瑞, 张开春, 等. 桃AFLP技术体系的优化及集群分离分析研究[J]. 西北植物学报, 2005, 25(3): 430-435. doi: 10.3321/j.issn:1000-4025.2005.03.002 [12] 李珊, 赵桂. 仿AFLP分子标记及其应用[J]. 西北植物学报, 2003, 23(5): 830-836. doi: 10.3321/j.issn:1000-4025.2003.05.025 [13] 贾璇, 杨文香, 刘大群. 小麦基因组AFLP反应体系的建立[J]. 河北农业大学学报, 2003, 23(2): 55-59. doi: 10.3969/j.issn.1000-1573.2003.02.015