随着中华绒螯蟹Eriocheir sinensis养殖业的迅猛发展，规模化养殖的不断增加，中华绒螯蟹的病害问题开始凸显，成为阻碍这一产业发展的瓶颈。目前，中华绒螯蟹的有些疾病尚无有效的治疗方法，只能以预防为主，但由于对中华绒螯蟹的免疫机制了解甚少，给确定有效的免疫预防措施带来了困难。血淋巴细胞是甲壳动物非特异性免疫防御体系中的重要防线之一，其最重要的免疫防御机能是吞噬作用，动物种类的不同，血细胞的吞噬能力也不同^[1]。有关中华绒螯蟹血细胞吞噬能力研究的报道较少，本文通过体外制备血细胞单层的方法，就中华绒螯蟹血细胞对蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus和鼠红细胞的吞噬能力进行了研究。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

实验动物。中华绒螯蟹，体重40~50 g，健康、无病，购于上海市水产市场，饲养于实验室水族箱中，每日喂食1次，24 h充气，及时换水保持水体清澈。

细菌。蜡状芽胞杆菌(由上海水产大学微生物实验室提供)，实验前接种于营养琼脂斜面，在30℃恒温箱培养24 h，用无菌PBS(pH 7.4)洗涤2次，最后悬浮于van HARREVALD氏液(0.205 M NaCl，0.0054 M KCl，0.0135 M CaCl₂，0.0026 M MgCl₂，0.0022 M NaHCO₃，pH 7.4)^[2]中，制成终浓度10⁸CFU·mL^-1的菌悬液。

鼠红细胞。实验用小白鼠(上海第二军医大学动物实验中心)采用眼球摘除法取血，置于ALSEVER′s氏液(葡萄糖2.05 g，柠檬酸钠0.80 g，柠檬酸0.055 g，氯化钠0.42 g，定溶至100 mL)中，用甲醛固定^[3]并悬浮于van HARREVALD氏液中，制成1%细胞悬液。

1.2   抗凝剂对血细胞存活率的影响

血细胞的吞噬能力受血细胞存活率的影响明显^[4]，在保证血细胞存活率能达90%以上后进行血细胞吞噬实验。

1.2.1   抗凝剂的抗凝时间

以乙二氨四乙酸/柠檬酸(EDTA/Citric)抗凝剂^[5]采集的血淋巴作为对照组，用van HARREVALD氏液配制的不同浓度的半胱氨酸(Sigma公司)溶液作为抗凝剂等比吸取血淋巴后，置于1.5 mL Eppendorf管中，测定血淋巴抗凝的时间。

1.2.2   血细胞的存活率

血细胞单层的制备，参照SMITH和RATCLIFFE^[6]的方法修改后进行，用含有0.5 mL抗凝剂的无菌注射器从中华绒螯蟹的第三步足基部软膜处吸取等体积的血淋巴置于1.5 mL Eppendorf管中，充分混匀后，吸取200 μL抗凝血淋巴滴于凹玻片(预先180℃高温灭菌2 h)上，置于20℃恒温箱中静置30 min以使血细胞贴壁，用van HARREVALD氏液洗涤数次后，显微镜下观察并测定血细胞的存活率。存活率的测定采用台盼蓝排斥法^[7]进行，其基本原理为血细胞存活不被台盼蓝着色，血细胞死亡则被台盼蓝染色成蓝色。取制备的血细胞单层，用van HARREVALD氏液洗涤数次后滴加0.4%台盼蓝染液(国药上海集团)，室温静置3 min，显微镜下观察计数并统计血细胞的存活率。以EDTA/Citric抗凝剂采血制备的血细胞单层为对照组，以含100.0 mg·mL^-1 L-cysteine的van HARREVALD氏液作为抗凝剂采血制备的血细胞单层为试验组，分别测定2组血细胞刚贴壁及培养1 h时血细胞的存活率。

1.3   血细胞体外吞噬能力的测定

血清的制备。参照MCKAY和JENKIN^[8]的方法进行，即用16号针头从中华绒螯蟹的第三步足基部软膜处取血淋巴，置1.5 mL Eppendorf管中，室温静置，待其凝固后置于-20℃冰箱冻存，在室温解冻后离心(5 000 r·min^-1，10 min，4℃)，收集上清液作为血清，置于-20℃冰箱中保存备用。

经血清孵育的细菌和红细胞的制备。参照SMITH和RATCLIFFE^[6]的方法修改后进行，将蜡状芽胞杆菌悬浮于血清中，20℃孵育1 h，van HARREVALD氏液洗涤后制成浓度为10⁸CFU·mL^-1的悬液；鼠红细胞用血清20℃孵育1 h，洗涤后用van HARREVALD氏液制成浓度为1%细胞悬液。

吞噬能力的测定。取制备的血细胞单层，van HARREVALD氏液洗涤数次后，在血细胞单层上分别滴加100 μL的未经血清孵育的或经血清孵育的蜡状芽孢杆菌和鼠红细胞悬液，20℃孵育1 h，van HARREVALD氏液洗涤数次并用10%福尔马林固定10 min，镜检计数。

中华绒螯蟹血细胞对未经血清孵育或经血清孵育的蜡状芽胞杆菌和鼠红细胞的吞噬能力，以吞噬百分率及吞噬指数表示。吞噬百分率＝有吞噬作用的血细胞÷被计数的血细胞总数×100%;吞噬指数＝有吞噬作用的血细胞内总细菌数÷被计数的有吞噬作用血细胞总数。

吞噬试验中，每只蟹平行制备3个血细胞单层，每个血细胞单层随机选取计数100个血细胞测定吞噬率及吞噬指数，每5只蟹为一组。

1.4   数据统计与分析

采用SPSS 13.0 for Windows软件进行统计分析，数据均以平均值±标准偏差表示，差异分析采用t检验，P < 0.05为差异显著，P < 0.01，为差异十分显著。

2.   结果

2.1   抗凝剂对血细胞存活率的影响

2.1.1   抗凝剂的抗凝时间

EDTA/Citric抗凝剂的抗凝效果较好，可抗凝血淋巴凝固时间达60 min以上；以van HARREVALD氏液配制的L-cysteine溶液，在L-cysteine浓度为5.0，10.0，25.0和50.0 mg·mL^-1时，均不能较好地抗凝血淋巴的凝固，在浓度达到100.0 mg·mL^-1时可抗凝血淋巴凝固时间达60 min以上(表 1)。

表  1  抗凝剂对中华绒螯蟹血凝巴的抗凝效果

Table  1.  The effects of anticoagulants on hemolymph of E.sinensis

抗凝剂 anticoagulant	抗凝剂剂量/mg·mL-1 dose	抗凝效果  effect of anticoagulant
		样本1 sample 1	样本2 sample 2	样本3 sample 3	样本4 sample 4	样本5 sample 5
乙二氨四乙酸/柠檬酸抗凝剂 EDTA/Citric anticoagulant	参照文献[5]	－	－	－	－	－
半胱氨酸 L-cysteine	5.0	+	+	+	+	+
	10.0	+	+	+	+	+
	25.0	+	±	+	+	+
	50.0	±	+	±	±	+
	100.0	－	－	－	－	－
注：抗凝剂与血淋巴的体积比为1：1；+. 抗凝剂延长血淋巴发生凝固时间 < 60 min；±. 当时间达到60 min时，血淋巴发生半凝固；－. 抗凝剂延长血淋巴发生凝固时间>60 min Note：Volume rate of anticoagulant and hemolymph is 1：1；+. Time of anticoagulation is no more than 60 min；±. When time of anticoagulation is 60 min, hemolymph can′t completely coagulate；－. Time of anticoagulation is more than 60 min.

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2.1.2   血细胞的存活率

血细胞存活率的测定结果见图 1。以EDTA/Citric抗凝剂采血制备的血细胞单层，血细胞刚贴壁时的存活率为(32.5±6.6)%，培养1 h后，血细胞全部死亡。以含100.0 mg·mL^-1 L-cysteine的van HARREVALD氏液作为抗凝剂采血制备的血细胞单层，血细胞刚贴壁时的存活率为100%，培养1 h后，血细胞的存活率为(92.5±0.9)%。因此，选用含100.0 mg·mL^-1 L-cysteine的van HARREVALD氏液作为抗凝剂制备血细胞单层，测定中华绒螯蟹血细胞的体外吞噬能力。

图  1  单层血细胞的存活率

Figure  1.  Survival rate of monolayer blood cells

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以含100.0 mg·mL^-1 L-cysteine的van HARREVALD氏液作为抗凝剂采血制备的血细胞单层，血细胞接触到玻片的表面后，通过胞质运动迅速贴附并在玻片上伸展开来，培养1 h后，血细胞的存活率可维持在90%以上。绝大部分血细胞的胞质内含有一个明显的细胞核和一些小的颗粒，血细胞呈扁平状，紧密地贴附于玻片上并伸出类似于伪足的原生质突起，伸展后血细胞的直径可达数十微米，具有吞噬能力(图 2)。

图  2  吞噬细菌的中华绒螯蟹血细胞采用Motic显微成像系统拍照，可见紧密贴壁的中华绒螯蟹单层血细胞，细胞长出伪足()紧密贴于玻片表面，胞质中含有少量折光性颗粒(→)，被吞噬的蜡状芽孢杆菌(⇨)以及胞膜表面吸附的蜡状芽孢杆菌(⇒) (标尺=20 μm)

Figure  2.  Morphology of hemocytes of E.sinensis phagocyting bacteria Taking by Motic micro system, spread phagocytic cell containing phagocyted B.cereus and several attached bacteria. Note pseudopodia(), small refractive granules(→), phagocyted B.cereus(⇨)and attached B.cereus(⇒) (scale bar = 20 μm)

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2.2   中华绒螯蟹血细胞的体外吞噬能力

中华绒螯蟹血细胞体外吞噬能力的测定结果见表 2。血细胞对蜡状芽孢杆菌的吞噬试验。血细胞对未经血清孵育的蜡状芽胞杆菌的吞噬率为(5.1±1.4)%，吞噬指数为1.35±0.07。血细胞对血清孵育的蜡状芽胞杆菌的吞噬率(6.1±1.1)%，吞噬指数为1.31±0.14。t检验，未经血清孵育组与血清孵育组，血细胞的吞噬率与吞噬指数无显著性差异。血细胞对鼠红细胞的吞噬实验。鼠红细胞大小约为贴壁后的中华绒螯蟹血细胞的1/2，当血细胞内出现鼠红细胞样结构，即可认为鼠红细胞被吞噬。结果显示，鼠红细胞无论是否经血清孵育，中华绒螯蟹血细胞均不能吞噬鼠红细胞。

表  2  中华绒螯蟹血细胞吞噬能力的测定结果

Table  2.  Results of phagocytosis of E.sinensis monolayer blood cells

吞噬颗粒 phagocyted particles	血清孵育 serum incubation	吞噬率/% percent of phagocytose	P值 P value	吞噬指数 phagocytose index	P值 P value
蜡状芽胞杆菌 Bacillus cereus	未孵育	5.1±1.4	P>0.05	1.35±0.07	P>0.05
	孵育	6.1±1.1		1.31±0.14
鼠红细胞 mouse erythrocytes	未孵育	-	-	-	-
	孵育	-		-
注：数据以平均值±标准偏差表示，样本数n=5 Note：The results present as mean±SD of 5 samples.

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3.   讨论

EDTA/Citric抗凝剂尽管能够有效延长中华绒螯蟹血淋巴体外凝固时间并在体外能较好地维持血细胞的形态^[5]，但其对血细胞体外存活率有较大影响，体外培养1 h后，血细胞全部死亡。MCKAY和JENKTN^[9]指出当L-cysteine浓度达50 mg·mL^-1时，可作为澳洲淡水螯虾Parachaeraps bicarinatus的有效抗凝剂，并成功用于澳洲淡水螯虾血细胞的体外培养。对于中华绒螯蟹血淋巴，当L-cysteine浓度达100 mg·mL^-1时才取得良好的抗凝效果，培养1 h后，血细胞存活率可维持在(92.5±0.9)%，可能L-cysteine在短时间内能满足血细胞的生理需求。

陆宏达^[10]将中华绒螯蟹血细胞分为无颗粒细胞、大颗粒细胞、小颗粒细胞和大小颗粒中间型细胞等4种类型。根据此分类标准，实验中观察到的贴壁能力较强，具吞噬能力的血细胞应属于小颗粒细胞。在其他甲壳动物上，单肢虾Sicyonia ingentis的无颗粒细胞无吞噬活性，小颗粒细胞和大颗粒细胞却具有吞噬活性^[11]；而欧洲出产的淡水螯虾Pacifatacus leniusoulus血细胞的吞噬活性主要见于透明细胞，半颗粒细胞则极少参与吞噬活动^[12]。试验中，在制备的血细胞单层上，可见少量大颗粒细胞的存在，无颗粒细胞由于占总血细胞的比例很小^[13]，使得在制备的血细胞单层中未观察到。此外可以看出，对于不同的甲壳动物种类，显示出吞噬活性的血细胞种类是不同的。

血细胞要吞噬细菌或红细胞首先必须能够先吸附细菌或红细胞，通过原生质突起将细菌或红细胞包围而吞噬入胞内。试验中观察到，中华绒螯蟹血细胞能够吸附并吞噬蜡状芽胞杆菌(图 2)，吞噬率为(5.1±1.4)%；但血细胞尽管能吸附鼠红细胞却不能吞噬，可能由于被吞噬的异物越大，血细胞吞噬异物时需要的能量也越多^[14]。如三叶真蟹Carcinus maenas^[6]和圆背角无齿蚌Anodonata woodiana pacifica^[15]血细胞在体外也能吞噬细菌却不能吞噬红细胞。

哺乳动物白细胞吞噬异物时常要依赖于血清中调理因子，通过血清对吞噬异物的孵育，可增强血细胞对异物的吞噬能力^[16-17]。在甲壳动物上，有学者报道血清孵育能增强血细胞的吞噬能力，如美洲螯龙虾Homarus americanus^[14]；而有的学者则认为血清孵育不能增强甲壳动物血细胞对异物的吞噬能力，如三叶真蟹^[6]。在澳洲淡水螯虾上研究显示，血细胞吞噬绵羊红细胞时，需要依赖于血清对绵羊红细胞的孵育^[9]，但血清孵育却不能增强血细胞对细菌的吞噬率^[18]。本试验结果表明，血清孵育并不能增强中华绒螯蟹血细胞对蜡状芽孢杆菌和鼠红细胞的吞噬能力，可能由于血清中不存在免疫调理因子，或虽然存在调理因子但其并未活化，从而未表现出免疫调理作用，但这还有待进一步验证。