鳗弧菌注射对栉孔扇贝免疫活性的影响

樊甄姣, 杨爱国, 吕振明, 刘志鸿

樊甄姣, 杨爱国, 吕振明, 刘志鸿. 鳗弧菌注射对栉孔扇贝免疫活性的影响[J]. 南方水产科学, 2007, 3(6): 52-55.
引用本文: 樊甄姣, 杨爱国, 吕振明, 刘志鸿. 鳗弧菌注射对栉孔扇贝免疫活性的影响[J]. 南方水产科学, 2007, 3(6): 52-55.
FAN Zhenjiao, YANG Aiguo, LV Zhenming, LIU Zhihong. Effects of Vibrio anguillarum on immune activities of Chlamys farreri[J]. South China Fisheries Science, 2007, 3(6): 52-55.
Citation: FAN Zhenjiao, YANG Aiguo, LV Zhenming, LIU Zhihong. Effects of Vibrio anguillarum on immune activities of Chlamys farreri[J]. South China Fisheries Science, 2007, 3(6): 52-55.

鳗弧菌注射对栉孔扇贝免疫活性的影响

基金项目: 

国家高技术研究发展计划(863计划)项目 2003AA603022

详细信息
    作者简介:

    樊甄姣(1978-),女,硕士,实验师,从事贝类免疫学研究。E-mail: fanzj2004@163.com

    通讯作者:

    刘志鸿,E-mail: liuzh@ysfri.ac.cn

  • 中图分类号: S944.4

Effects of Vibrio anguillarum on immune activities of Chlamys farreri

  • 摘要:

    测定了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)注射对栉孔扇贝(Chlamys farreri)胞内活性氧(ROS)含量和过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。结果表明,在注射后5、24、48和72 h各免疫指标都有明显变化;胞内ROS含量在24、48和72 h明显升高,且均高于对照组,形成抛物线趋势,在48 h达到最高;血清中CAT活性均有升高趋势;肝脏中ACP活性在24、48和72 h与注射生理盐水组相比明显升高;栉孔扇贝体内ALP活性有明显升高的趋势,且在注射后24 h活性达到最高,而后有所下降。结果表明,鳗弧菌对栉孔扇贝免疫系统有明显的刺激作用。

    Abstract:

    The content of intracellular ROS and the activities of CAT, ACP and ALP of Chlamys farreri were studied at 5, 24, 48 and 72 h after challenged with Vibrio anguillarum injection. The results showed that the intracellular ROS content of experimental groups were much higher than that of control groups at 24, 48, 72 h. The CAT activities of experimental groups in haemocytes were higher than that of control group but not significantly. The ACP and ALP activities of experimental groups were much higher than that of control group at 5, 24, 48, 72 h. In conclusion, V.anguillarum could influence the immune activities of C.farreri.

  • 弧菌是引起许多海水养殖动物高死亡率的主要病原之一。多数致病性弧菌是海水和底质中的常见菌,研究表明,弧菌的致病性在于他们能产生一些胞外毒素和具有酶作用的物质,如肠毒素、溶血素、凝血素、细胞素等,并伴有致死作用[1]。弧菌致病性研究中,对鳗弧菌Vibrio anguillarum研究较多,其次是溶藻弧菌V.alginolyticus和副溶血弧菌V.parahaemolyticus,弗尼斯孤菌V.furnissii是近几年发现的新致病性弧菌,具有较强的毒力[2]。CHENG和RODRICK[3]用巨大芽孢杆菌(Bacillus megaosomes)感染帘蛤(Mercenaria mercenaria)后,发现可诱导其血淋巴中溶菌酶的释放。NAKAMURA[4]研究表明,扇贝(Patinopecten yessiensis)的血细胞经细菌刺激后可产生或释放活性氧。CHENG[5]用不同的细菌感染氟吉尼亚牡蛎(Crassostrea virginica)后发现,细菌对其血淋巴中酸性磷酸酶等有选择诱导作用。

    目前,国内在贝类感染方面已有所研究,如大肠杆菌Escherichia coli[6]和河流弧菌V.fluvialis[7]引起的水解酶、氧化酶和抗菌活力等免疫因子的变化,但有关弧菌感染对栉孔扇贝(Chlamys farreri)免疫活性的影响还未见报道。本文选用栉孔扇贝为实验材料,在注射鳗弧菌感染后,测定了其血清和肝脏抗氧化酶与水解酶活性的变化,并测定了血细胞活性氧含量的变化,以期从免疫方面了解弧菌对扇贝产生毒害的机理,为扇贝健康养殖和疾病防治提供理论依据。

    栉孔扇贝于2006年3月购于青岛太平角海区,壳高3~4 cm,取回后暂养于实验室,投喂金藻和硅藻,1周后进行实验。

    鳗弧菌用2216E培养基于28℃下培养36 h后,用无菌生理盐水洗下,调至浓度为2×108 cell·mL-1,用无菌注射器从闭壳肌注入,每只100 μL,对照组注射等量的无菌生理盐水。分别于5,24,48,72 h时从闭壳肌取血,每次取扇贝10只,一部分加MAS抗凝剂(1 : 1),用于胞内活性氧(ROS)含量的测定;一部分于低温离心20 min,取上清液用于过氧化氢酶(CAT)性测定。同时取肝脏,加入1 : 2(W/V)的0.85%生理盐水匀浆,于低温离心20 min,取上清,用于酸性磷酸酶(ACP)和碱性碗酸酶(ALP)活性测定。

    胞内ROS含量的测定采用ARNAUD和SUELAGH[8]的NBT比色法加以改良。

    CAT活性测定采用周强和曹春艳[9]的方法进行。

    ACP和ALP活性的测定采用KRUZEL[10]的磷酸苯二钠法,酶活力的计算采用金氏单位(每100 mL待测样品在37℃与基质液作用15 min,产生1 mg酚者为1个金氏单位)。

    注射鳗弧菌后,栉孔扇贝胞内ROS含量随注射时间变化如图 1,胞内ROS含量在24、48和72 h明显升高,且均高于对照组,在48 h达到最高。

    图  1  注射鳗弧菌后胞内活性氧含量的变化
    Figure  1.  Changes of intracellular ROS after injection of V.anguillarum

    栉孔扇贝注射鳗弧菌后体内CAT活性随时间变化趋势如图 2所示,与注射生理盐水组相比,血清中CAT活性均有升高趋势。

    图  2  鳗弧菌注射后CAT活性的变化
    Figure  2.  Changes of CAT activity after injection of V.anguillarum

    鳗弧菌感染后,栉孔扇贝体内ACP活性随时间变化趋势如图 3所示。结果表明,肝脏中ACP活性在24、48和72 h与注射生理盐水组相比明显升高。

    图  3  鳗弧菌注射后ACP活性的变化
    Figure  3.  Changes of ACP activity after injection of V.anguillarum

    鳗弧菌感染后,栉孔扇贝体内ALP活性随时间变化趋势如图 4所示。结果表明,鳗弧菌注射后,栉孔扇贝体内ALP活性有明显升高的趋势,且在注射后24 h活性达到最高,而后下降。

    图  4  鳗弧菌注射后ALP活性的变化
    Figure  4.  Changes of ALP activity after injection of V.anguillarum

    CHENG和RODRICK[11]指出,细菌等异源物质进入动物体内,可激发一系列的免疫反应,对于没有产生抗体机构的双壳贝类来说,吞噬作用在其防御机制中就有更为重要的作用。贝类血细胞杀死被吞噬的病原菌等异物的主要机制之一是伴随吞噬引起的呼吸爆发产生的具杀菌作用的氧自由基等活性氧,包括超氧阴离子、羟自由基、单线态氧和过氧化氢。本研究发现,栉孔扇贝在注射鳗弧菌后,胞内ROS含量明显增高,这说明菌注射对栉孔扇贝ROS自由基含量有明显影响,ROS含量的增加有利于杀灭入侵的细菌。但ROS对贝类本身也有毒害作用,须及时清除[12]。CAT可清除过氧化氢,从而保护贝类本身免受伤害,以维持正常生理活动。本试验中CAT活性增强,说明CAT在防御病毒感染过程中发挥了作用。

    在吞噬前、吞噬过程中和吞噬后各种水解酶同样具有重要作用。ACP是巨噬细胞溶酶体的标志酶,在体内直接参与磷酸基团的转移和代谢,在血细胞进行吞噬和包囊反应中,会伴随有ACP的释放[13],CHENG[14]认为,软体动物的ACP主要来源于粒细胞的颗粒体,在酸性环境中,ACP可以通过水解作用将表面带有磷酸酯的异物破坏降解掉。ALP是生物体内的一种重要的代谢调控酶,直接参与磷酸基团的转移,可催化所有的磷酸单酯及磷酸基团的转移反应,与贝类壳角蛋白等蛋白质的分泌相关,并可参与蛋白质的合成,同时也作为软体动物溶酶体酶的重要组成部分,在免疫反应中发挥作用[15]。本试验研究结果发现,栉孔扇贝注射鳗弧菌后体内ACP活性升高,说明鳗弧菌对栉孔扇贝的ACP和ALP活性有明显的刺激作用,激发了扇贝的免疫反应。这与孙虎山等[16]对大肠杆菌感染栉孔扇贝的研究结果相同,但与王淑红等[17]得出的结果不同,这可能是不同贝类对不同病原菌的反应不同,具体原因有待进一步研究。CHENG[18]认为在贝类中发现的这种提高的溶酶体酶实际上为可诱导的“保护性”的体液因子,是贝类在接触细菌后“超级合成”并释放到血清中的结果。尽管如此,由于贝类的溶酶体酶为先天性的,诱导只能提高其合成的数量和活性,并不是从无到有的产生。此外,FENG[19]认为,贝类血淋巴中这种酶的提高除了是一种防御反应外,也可能是一种被动的病理显示。

    试验中对照组注射了与试验组等量的生理盐水,对照组的ROS含量、CAT、ACP和ALP活性均有变化,原因可能有以下2个方面,(1)注射针刺的刺激;(2)因溶液成分与扇贝血淋巴渗透压及化学成分有差异。这2方面的刺激都可能使扇贝发生应激反应,引起呼吸爆发,并产生大量的自由基,从而引起可清除自由基的酶CAT活力的增加;同时吞噬作用加强,对吞噬作用起重要作用的ACP和ALP活力也增强。

  • 图  1   注射鳗弧菌后胞内活性氧含量的变化

    Figure  1.   Changes of intracellular ROS after injection of V.anguillarum

    图  2   鳗弧菌注射后CAT活性的变化

    Figure  2.   Changes of CAT activity after injection of V.anguillarum

    图  3   鳗弧菌注射后ACP活性的变化

    Figure  3.   Changes of ACP activity after injection of V.anguillarum

    图  4   鳗弧菌注射后ALP活性的变化

    Figure  4.   Changes of ALP activity after injection of V.anguillarum

  • [1] 吕贤善, 徐绍基, 王爱明. 溶藻弧菌引起虾病暴发的病原学研究[J]. 海洋渔业, 1992, 14(2): 56-57. https://www.cqvip.com/QK/93342X/199202/770423.html
    [2] 王广和, 沈艳云, 沙培荣, 等. 文蛤弗尼斯弧菌病研究[J]. 微生物通报, 1992, 19(4): 222-225. https://wswxtb.ijournals.cn/wswxtbcn/article/abstract/92040222
    [3]

    CHENG T C, RODRICK G E. Lysosomal and other enzymes in the hemolymph of Crassostrea virginica and Mercenaria mercenaria[J]. Comp Biochem Physiol B, 1975, 52(3): 443-447. doi: 10.1016/0305-0491(75)90159-5

    [4]

    NAKAMURA N. In vitro production of hydrogen peroxide by the amoebocytes of the scallop, Patinopecten yessoentis (Jay)[J]. Dev Comp Immunol, 1985, 9(3): 407-417. doi: 10.1016/0145-305X(85)90004-7

    [5]

    CHENG T C. Selective induction of release of hydrolases from Crassostrea viginica hemocytes by certain hacteria[J]. Invertebr Pathol, 1992, 59(2): 197-220. doi: 10.1016/0022-2011(92)90033-Z

    [6] 丁秀云, 翟玉梅, 李光友. 皱纹盘鲍经诱导后血淋巴中一些因子变化的研究[J]. 海洋与湖沼, 1996, 27(4): 362-367. doi: 10.1007/BF02029074
    [7] 李太武, 丁明进. 皱纹盘鲍对河流弧菌-Ⅱ苗免疫的研究[J]. 海洋与湖沼, 1997, 28(1): 27-32. doi: 10.3321/j.issn:0029-814X.1997.01.005
    [8]

    ARNAUD L, SHELAGH K M. Stress-induced immune changes in the oyster Crassostrea gigas[J]. Dev Comp Immunol, 2002: 26(1): 1-9. doi: 10.1016/S0145-305X(01)00067-2

    [9] 周强, 曹春艳. 血清过氧化氢酶的比色测定[J]. 哈尔滨医科大学学报, 2001, 35(6): 473-474. doi: 10.3969/j.issn.1000-1905.2001.06.036
    [10]

    KRUZEL M. Acid phosphatase of potato tubers: purification properties, sugar and amino acid composition[J]. Acta Biochim Pol, 1982, 29(3): 321.

    [11]

    CHENG T C, RODRICK G E. Identification and characterization of lysozyme from the hemolymph of the soft-shelled clam[J]. Biol Bull(Woods Hole, Mass), 1974, 147(2): 311-320. doi: 10.2307/1540451

    [12]

    PIPE R K, PORTE C, LIVINGSTONE D R. Antioxidant enzymes associated with the blood cells and haemolymph of the mussels Mytilus edulis[J]. Fish shellf Immunol, 1993, 3(3): 221-233. doi: 10.1006/fsim.1993.1022

    [13] 翟玉梅, 丁秀云, 李光友. 软体动物血细胞及体液免疫研究发展[J]. 海洋与湖沼, 1998, 29(5): 558-561. https://www.cqvip.com/QK/90072X/19985/3196589.html
    [14]

    CHENG T C. The role of lysosmal hydrolases in molluscan celllar response to immunologic challenge[J]. Comp Pathbiol, 1978, 4(1): 59-71. doi: 10.1007/978-1-4757-1278-0_4

    [15] 孙虎山, 李光友. 硒化卡拉胶和酵母葡聚糖对栉孔扇贝血淋巴中两种水解酶活力的影响[J]. 海洋与湖沼, 2002, 33(3): 245-249. https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/hyyhz200203004
    [16] 孙虎山, 李光友. 大肠杆菌感染后栉孔扇贝血淋巴中7种酶活力的变化[J]. 海洋科学, 1999(5): 40-44. doi: 10.3969/j.issn.1000-3096.1999.05.016
    [17] 王淑红, 王艺磊, 张朝霞, 等. 弧菌和大肠杆菌感染对杂色鲍无细胞血淋巴中几种酶活力的影响[J]. 中国水产科学, 2004, 11(1): 37-40. http://www.fishscichina.com/zgsckx/article/abstract/4472?st=alljournals
    [18]

    CHENG T C. The role of lysosomes in molluscan inflammation[J]. Am Zool, 1983, 23(1): 129-144. doi: 10.1093/icb/23.1.129

    [19]

    FENG S Y. Cellular defense mechanism of oysters and mussels[J]. Am Fish Soc Spec Public, 1988, 18(1): 153-168. https://www.researchgate.net/publication/250198315_Cellular_Defense_Mechanisms_in_Bivalve_Molluscs

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出版历程
  • 收稿日期:  2007-06-13
  • 修回日期:  2007-08-07
  • 刊出日期:  2007-12-04

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