罗非鱼 (Tilapia) 又名非洲鲫鱼，因繁殖量大、适应性强、产量高等优点，成为全球最重要的养殖淡水鱼之一^[1]。2022年我国罗非鱼的总产量高达173.9万吨，较2021年提高了4.59%^[2]。然而，目前罗非鱼多以鲜活消费和初级加工为主，产品附加值较低。鱼糜加工是目前国内外重要的精深加工方式之一，鱼糜制品产量呈逐年上升趋势。但罗非鱼鱼糜的凝胶强度低^[3]，且在加工过程中容易出现凝胶劣化现象，利用传统鱼糜加工方法获得的鱼糜制品的品质较差，阻碍了罗非鱼的高值化利用。因此，改善鱼糜的凝胶强度，是目前罗非鱼鱼糜产业亟需解决的关键技术问题。

借助微生物发酵能够有效改善淡水鱼鱼糜品质^[4]。鱼糜的微生物发酵一般采用乳酸菌作为发酵剂，依靠其产生的有机酸促使鱼糜蛋白的凝胶化形成，同时抑制杂菌生长^[5]。此外，微生物代谢作用使鱼糜中蛋白质、脂肪、碳水化合物等大分子营养物质分解产生氨基酸、脂肪酸、挥发性小分子物质等滋味和气味成分，产生特有的风味^[6]。

由于发酵前鱼糜原料中含有众多杂菌，大多数研究只关注乳酸菌加菌发酵后的品质变化，而忽略了对微生物菌群变化的研究以及这种变化对发酵鱼糜品质的影响^[7-8]。笔者课题组前期利用16S rRNA基因高通量测序技术、现代仪器分析技术、多维统计学等手段，揭示了罗非鱼自然发酵鱼糜品质和风味的形成机制，明确了与发酵鱼糜品质和风味形成相关的关键微生物菌属^[6,9]。同时，从罗非鱼自然发酵鱼糜中筛选到乳酸菌，能够显著抑制鱼糜发酵过程中生物胺的生成，但是对其凝胶强度的改善作用不明显^[10]。因此，本研究以新筛选得到的植物乳植杆菌 (Lactiplantibacillus plantarum) 为发酵菌株，研究了加菌发酵对罗非鱼鱼糜凝胶强度的影响，通过分析微生物菌群和游离氨基酸含量变化，从微生物菌群变化和蛋白质水解角度揭示加菌发酵对罗非鱼鱼糜凝胶强度的改善机制，为开发高品质的罗非鱼发酵鱼糜制品提供重要的技术支撑。

1.   材料与方法

1.1   材料与试剂

鲜活罗非鱼 (500~750 g) 购自广州市海珠区华润万家客村店；发酵菌株植物乳植杆菌 H30-2分离自罗非鱼自然发酵鱼糜^[11]，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC NO. 27465。

PCA培养基和MRS肉汤培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；FastDNA^® Spin Kit for Soil购自美国MP Biomedicals公司；FMOC、邻苯二甲醛、氨基酸标准品购自美国Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈 (色谱纯) 购自德国CNW公司。

1.2   仪器与设备

BJ-JR12台式绞肉机 (福建班吉公司)；IKA-T25组织匀浆机 (德国IKA公司)；Illumina MiSeq PE300测序仪 (美国Illumina公司)；CT3质构仪 (美国Brookfield公司)；Agilent 1100型高效液相色谱仪 (美国Agilent公司)。

1.3   实验方法

1.3.1   植物乳植杆菌的活化培养

保藏有植物乳植杆菌的磁珠保藏管冷冻于−80 ℃冰箱，在无菌环境中从磁珠保藏管中取出2个磁珠，接种于灭菌好的MRS肉汤培养基中，在30 ℃恒温培养箱中厌氧培养24 h，作为植物乳植杆菌的种子液。4 ℃下12 000 r·min⁻¹离心10 min后去除上清液，得到白色菌体沉淀，将菌体沉淀重悬于0.85% (w) 的氯化钠 (NaCl) 溶液中，作为发酵罗非鱼鱼糜的发酵剂。

1.3.2   罗非鱼发酵鱼糜制备

取罗非鱼背肉并用冷水浸泡冲洗，沥干水分，用绞肉机打成鱼糜，加入5%水、2%食盐、0.5%葡萄糖、0.5%蔗糖 (均为质量分数)。在低温条件下斩拌均匀。鱼糜中加入终菌落总数为1×10⁶ CFU·g⁻¹的发酵菌株作为加菌发酵组 (LP组)，不添加菌株的鱼糜作为自然发酵组 (CK组)。使用手动灌肠机灌入直径为30 mm的塑料肠衣中，然后置于25 ℃恒温培养箱中发酵45 h，分别在第0、第18、第30和第45小时取样分析。

1.3.3   菌落总数和微生物菌群分析

取3.0 g发酵鱼糜，加入27 mL无菌生理盐水，充分匀浆后，取含菌匀浆液，经梯度稀释，涂布于PCA培养基上，在37 ℃培养箱内倒置培养24 h后计数。剩余的含菌匀浆液在4 ℃下12 000 r·min⁻¹离心10 min，获得微生物菌体，采用FastDNA^® Spin Kit for Soil 试剂盒对微生物菌体的总DNA进行抽提。采用16S rRNA高通量测序技术测定微生物菌群组成^[11]。利用上游引物338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') 和下游引物806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 对微生物16S rRNA基因的V3—V4 可变区序列进行 PCR 扩增。产物经纯化和建库后，利用 Illumina MiSeq PE300测序仪进行测序。利用Flash v1.2.11软件将序列进行组装拼接。使用UPARSE v7.0.1090软件在97%相似度条件下进行聚类，利用RDP classifer v2.11软件进行物种注释。

1.3.4   凝胶强度分析

将发酵鱼糜切成2.5 cm高的圆柱体，采用CT3型质构仪分析其凝胶强度^[12]。用直径5 mm的球形探头测定发酵鱼糜的破断力 (g) 和破断距离 (cm)，选用压缩模式，下压位移1.5 cm，触发点负载5.0 g。凝胶强度 (g·cm) 的计算公式为：凝胶强度=破断力×破断距离。

1.3.5   游离氨基酸的测定

取0.5 g发酵鱼糜，加入0.01 mol·L⁻¹盐酸溶液提取游离氨基酸，样品用0.22 μm针头微孔滤膜过膜后，分别与2.5 g·L⁻¹的FMOC溶液和10.0 g·L⁻¹的邻苯二甲醛溶液进行柱前衍生化反应。采用Agilent 1100型高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为ZORBAX Eclipse AAA (4.6 mm×150 mm, 3.5 μm)，流动相A为40 mmol·L⁻¹ 磷酸二氢钠溶液 (pH 7.8)，流动相B为乙腈-甲醇-水 (V∶V∶V=45∶45∶10)。梯度洗脱程序为：100% A、0 min；100% A、1 min；43% A、23 min；0% A、27 min；0% A、34 min；100% A、40 min；100% A、41 min。流速为1.0 mL·min⁻¹，柱温为45 ℃。使用紫外检测器分别在338 nm (0~19 min) 和266 nm (19.01~25 min) 处进行检测。

1.3.6   统计学分析

每个实验重复3次，结果以“平均值±标准差 ($\overline { x}\pm s $)”表示。采用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析，使用多重比较Tukey算法进行差异性检验，数据之间无相同字母为差异显著 (p<0.05)^[13]。利用Pearson分析微生物菌属与发酵鱼糜物化特性间的相关性，然后利用Cytoscape v.3.8.1软件构建相关性网络图^[14]。

2.   结果

2.1   加菌发酵对罗非鱼发酵鱼糜凝胶强度的影响

凝胶强度是评价鱼糜制品品质最重要的物化指标之一。植物乳植杆菌加菌发酵对罗非鱼鱼糜发酵过程中凝胶强度的影响如图1所示。随着发酵时间的增加，自然发酵鱼糜的凝胶强度显著增大。自然发酵45 h后，凝胶强度可达504.7 g·cm；加菌发酵后，凝胶强度在第18 小时即可达810.5 g·cm，但随着发酵时间的增加，其凝胶强度变化不大。结果表明，加菌发酵能够显著加快鱼糜凝胶的形成，从自然发酵的45 h缩短至18 h，且能够产生更高的凝胶强度。

图  1  植物乳植杆菌加菌发酵对罗非鱼鱼糜发酵过程中凝胶强度的影响

注：不同字母表示差异显著 (p<0.05)。

Fig. 1  Effect of L. plantarum addition on gel strength of tilapia surimi during fermentation

Note: Different letters represent significant differences (p<0.05).

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2.2   加菌发酵对罗非鱼发酵鱼糜游离氨基酸的影响

游离氨基酸含量是评价水产品滋味和营养的重要指标，同时也可代表水产品中蛋白质的降解程度。植物乳植杆菌加菌发酵对罗非鱼鱼糜发酵过程中游离氨基酸含量的影响如图2所示。在鱼糜发酵过程中共检测到25种游离氨基酸，其中含量较高的为甘氨酸、丙氨酸、羟脯氨酸和色氨酸。随着发酵时间的增加，罗非鱼自然发酵鱼糜中大部分游离氨基酸的含量逐渐增加，总氨基酸从未发酵的6.22 g·kg⁻¹显著增至发酵末期的8.24 g·kg⁻¹。在添加植物乳植杆菌后，大部分游离氨基酸含量在发酵第18小时显著下降，之后明显增加。与自然发酵鱼糜相比，添加植物乳植杆菌后，大部分游离氨基酸及总氨基酸含量明显降低。值得注意的是，鲜味氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸含量在加菌发酵后显著增加，表明加菌发酵能够改善罗非鱼鱼糜的鲜味。

图  2  植物乳植杆菌加菌发酵对罗非鱼鱼糜发酵过程中游离氨基酸含量的影响

注：CK为自然发酵组，LP为加菌发酵组，后面的数字表示发酵时间。

Fig. 2  Effect of L. plantarum addition on concentrations of free amino acids of tilapia surimi during fermentation

Note: CK represents the natural fermentation group; LP represents the fermentation group with added strain; the number after it represents the fermentation time.

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2.3   加菌发酵对罗非鱼发酵鱼糜中微生物菌群的影响

菌落总数是评价发酵食品的重要指标，在产品质量控制中起到非常重要的作用^[15]。为了评估植物乳植杆菌加菌发酵后鱼糜中微生物的数量变化，研究了发酵过程中菌落总数的变化 (图3)。随着发酵时间的增加，自然发酵和加菌发酵罗非鱼鱼糜中的菌落总数均呈先升后降的趋势，并在第30小时达到最高。与自然发酵鱼糜相比，添加植物乳植杆菌后，发酵鱼糜中的菌落总数显著下降，在发酵末期仅1.9×10⁷ CFU·g⁻¹，明显低于自然发酵鱼糜的1.2×10⁸ CFU·g⁻¹。

图  3  植物乳植杆菌加菌发酵对罗非鱼鱼糜发酵过程中菌落总数的影响

注：不同字母表示差异显著 (p<0.05)。

Fig. 3  Effect of L. plantarum addition on total plate count in tilapia surimi during fermentation

Note: Different letters represent significant differences (p<0.05).

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为了监测鱼糜发酵过程中腐败微生物的生长繁殖情况以及发酵菌株对鱼糜发酵环境的适应情况，分析了加菌发酵后罗非鱼鱼糜中微生物菌群组成的变化情况 (图4)。在罗非鱼鱼糜发酵过程中共检测到18个丰度 >1%的菌属。在自然发酵前，不动杆菌属、巨大球菌属和链球菌属为主要微生物菌属，其相对丰度分别为44.03%、22.61%和14.15%；但是随着发酵的进行，因不适应鱼糜发酵环境，在发酵末期上述3种菌的相对丰度仅有0.01%、0.10%和2.27%。乳球菌属和乳植杆菌属在鱼糜自然发酵前期的相对丰度较低，仅有1.39%和0.01%，随着发酵时间的增加，其相对丰度显著增加并成为优势菌群，在发酵第45小时的相对丰度达55.88%和11.31%，表明这些微生物菌属更适应罗非鱼鱼糜的发酵环境。乳球菌属在鱼茶^[16]、豆腐乳^[17]自然发酵过程中也是主要的发酵菌属。利用植物乳植杆菌加菌发酵后，乳植杆菌属在发酵前期丰度最高 (35.42%)，其次为不动杆菌属 (24.90%) 和巨大球菌属 (19.26%)。随着发酵时间的增加，乳植杆菌属的丰度显著增加，到发酵末期相对丰度达63.71%，表明发酵菌株能够很好地适应鱼糜发酵环境。大部分其他菌属的丰度随着发酵的进行有所下降，而且在发酵末期时所有其他菌属的相对丰度均低于10%，这主要由于大部分腐败微生物不适应鱼糜的酸性发酵环境^[9,18-19]。

图  4  植物乳植杆菌加菌发酵对罗非鱼鱼糜发酵过程中微生物菌属的影响

注：CK为自然发酵组，LP为加菌发酵组，后面的数字表示发酵时间。

Fig. 4  Effect of L. plantarum addition on microbial community at genus level in tilapia surimi during fermentation

Note: CK represents the natural fermentation group; LP represents the fermentation group with added strain; the number after it represents the fermentation time.

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2.4   加菌发酵改善罗非鱼发酵鱼糜凝胶强度的作用机制

为探究植物乳植杆菌加菌发酵后罗非鱼发酵鱼糜凝胶强度的改善机制，分析了加菌发酵与自然发酵罗非鱼鱼糜在不同发酵阶段凝胶强度与微生物代谢的相关性。如图5-a所示，在发酵第18小时，10个微生物菌属分成2个明显的聚类，包括聚类1 (乳植杆菌属、乳球菌属、气单胞菌属、巨大球菌属、肠杆菌属) 和聚类2 (漫游菌属、链球菌属、摩根菌属、变形杆菌属、普罗威登斯菌属)。聚类1中的微生物菌属与凝胶强度呈正相关，而聚类2中的微生物菌属与菌落总数和大部分游离氨基酸呈负相关。相关性网络图显示，凝胶强度只与乳植杆菌属和气单胞菌属呈显著正相关 (p<0.05)，同时与菌落总数和总氨基酸呈显著负相关 (p<0.05)，这2个菌属特别是乳植杆菌属与大多数游离氨基酸和总氨基酸呈显著负相关 (p<0.05)，表明发酵第18小时加菌发酵鱼糜凝胶强度的增加主要是由这2个菌属的增加抑制了微生物对蛋白质的水解引起。

图  5  加菌发酵与自然发酵罗非鱼鱼糜在发酵第18 (a)、第30 (b)、第45 (c) 小时的凝胶强度、菌落总数、核心微生物菌属和游离氨基酸间的Pearson相关性热图和网络图

Fig. 5  Pearson correlation heatmaps and correlation network maps among gel strength, total plate count, core microbial genera and free amino acids of tilapia surimi after fermentation for 18 h (a), 30 h (b) and 45 h (c) between LP and CK groups

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如图5-b所示，在发酵第30小时，10个微生物菌属分成2个明显的聚类，包括聚类1 (乳植杆菌属、气单胞菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、普罗威登斯菌属) 和聚类2 (乳球菌属、漫游菌属、链球菌属、摩根菌属、巨大球菌属)，聚类1中的微生物菌属与凝胶强度呈正相关，而聚类2中的微生物菌属与菌落总数和大部分游离氨基酸呈负相关。相关性网络图显示，凝胶强度与聚类1中的所有菌属呈显著正相关 (p<0.05)。发酵食品中对品质变化起主要作用的微生物不仅需要有一定相关性，其丰度也要在微生物菌群中占绝对优势^[23-24]。本研究中，由于乳植杆菌属在正相关菌群中的丰度最高，因此该属对鱼糜凝胶强度的形成影响最大。与第18小时相同，第30小时凝胶强度与菌落总数和总氨基酸呈显著负相关 (p<0.05)。聚类1中的微生物菌属，特别是乳植杆菌属与大多数游离氨基酸和总氨基酸呈显著负相关 (p<0.05)，表明发酵第30小时加菌发酵鱼糜凝胶强度的增加主要是由乳植杆菌属的增加抑制了微生物对蛋白质的水解引起的。

如图5-c所示，在发酵第45小时，10个微生物菌属也分成2个明显的聚类，包括聚类1 (乳植杆菌属、摩根菌属、巨大球菌属、变形杆菌属、普罗威登斯菌属) 和聚类2 (乳球菌属、漫游菌属、气单胞菌属、链球菌属、肠杆菌属)，聚类1中的微生物菌属与凝胶强度呈正相关，而聚类2中的微生物菌属与菌落总数和大部分游离氨基酸呈负相关。相关性网络图显示，凝胶强度与乳植杆菌属和普罗威登斯菌属呈显著正相关 (p<0.05)，但是由于普罗威登斯菌属的丰度很低，因此影响很小。第45小时凝胶强度与菌落总数和总氨基酸呈显著负相关 (p<0.05)。乳植杆菌属和普罗威登斯菌属，特别是乳植杆菌属与大多数游离氨基酸和总氨基酸呈显著负相关 (p<0.05)，表明发酵第45小时，加菌发酵后乳植杆菌属的增加抑制了微生物对蛋白质的水解，从而导致了鱼糜凝胶强度的增加。

3.   讨论

鱼糜的凝胶特性直接影响鱼糜制品的组织性、保水性及黏结性等品质性能，是衡量鱼糜品质的重要指标^[20]。在鱼糜加工过程中，肌原纤维蛋白特别是肌球蛋白部分区域的肽链发生解离，然后与相邻排列的其他分子之间进行相互链接、聚集和交联，形成较大的蛋白质聚集体，最后形成具有明显凝胶特性的空间三维网络结构^[21-22]。肌原纤维蛋白尤其是肌球蛋白重链的降解，被认为是凝胶劣化的主要原因，而肌原纤维蛋白的降解主要是由蛋白酶水解引起的^[23]。由于海水鱼比淡水鱼更易形成凝胶且不易劣化^[24]，因此目前鱼糜制品的生产原料多以海水鱼为主，且对其种类和新鲜度的要求较高。淡水鱼糜因凝胶强度较低、交联度差、结构发散、易出现凝胶劣化等问题，严重制约了其应用^[20]。一般来说，凝胶强度在300 g·cm以上的鱼糜制品口感良好^[25]。前期研究发现，传统加热法生产的罗非鱼鱼糜制品的凝胶强度仅约200 g·cm^[3]，因此如何提高其凝胶强度，是目前罗非鱼鱼糜加工生产过程中亟需解决的关键技术问题。本研究发现，自然发酵45 h后，鱼糜的凝胶强度超过500 g·cm，能够满足鱼糜制品的生产需求。利用植物乳植杆菌加菌发酵不仅能够显著增加罗非鱼鱼糜的凝胶强度，在发酵第18小时即可达810.5 g·cm，且将发酵时间从45 h缩短至18 h。

罗非鱼发酵鱼糜作为一种发酵食品，微生物菌群代谢对其凝胶强度的影响较大。为了明确加菌发酵后罗非鱼鱼糜凝胶强度改善的原因，进一步总结了植物乳植杆菌加菌后微生物菌群和蛋白质水解变化 (图6)。结果发现，植物乳植杆菌加菌发酵能显著降低罗非鱼鱼糜中的菌落总数，且其中乳酸菌属的比例显著增加，而不动杆菌属、巨大球菌属等腐败微生物的比例显著下降。结果表明，植物乳植杆菌能够显著抑制微生物特别是腐败微生物的生长，使鱼糜产品具有更高的安全性。而且，添加植物乳植杆菌后，大部分游离氨基酸以及总氨基酸含量明显降低，表明加菌发酵能够明显抑制鱼糜中蛋白质的水解，这对于降低鱼糜凝胶劣化、提高鱼糜凝胶强度有重要作用。

图  6  植物乳植杆菌加菌发酵通过抑制蛋白水解改善罗非鱼发酵鱼糜凝胶强度的作用机制

Fig. 6  Improvement mechanism of gel strength of fermented tilapia surimi by L. plantarum through inhibition of protein hydrolysis

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添加微生物发酵剂后，发酵食品在发酵过程中品质和微生物群落结构会发生明显变化。通过构建加菌发酵与自然发酵组间的微生物-品质相关性网络可以有效揭示加菌后微生物菌群变化诱导的品质变化机制。目前，多数组间相关性研究仅关注发酵末期的相关性分析，而忽略了对整个发酵过程的研究，导致无法全面、准确地揭示加菌发酵的影响机制^[26-27]。因此，为探究植物乳植杆菌加菌发酵后罗非鱼发酵鱼糜凝胶强度的改善机制，本研究进一步分析了加菌发酵与自然发酵罗非鱼鱼糜在不同发酵阶段下凝胶强度与微生物代谢的相关性。结果发现，在18、30、45 h的发酵期间，凝胶强度一直与菌落总数和总氨基酸呈显著负相关，表明加菌发酵后微生物菌落总数降低及蛋白质水解程度下降是鱼糜凝胶强度增加的主要原因。仅乳植杆菌属与菌落总数、总氨基酸一直呈显著负相关，表明加菌发酵后乳植杆菌属的增加，即植物乳植杆菌生长繁殖，是鱼糜中微生物特别是腐败微生物降低以及蛋白质水解程度下降的主要原因。相似的研究也表明，植物乳植杆菌代谢产生的有机酸可以抑制腐败微生物的生长和产蛋白酶能力^[28-29]。同时，仅乳植杆菌属与凝胶强度一直呈显著正相关，且该属在整个起作用的菌群中占绝对高的比例，表明加菌发酵后植物乳植杆菌是增加鱼糜凝胶强度的主要作用微生物。值得关注的是，虽然乳植杆菌属与大多数氨基酸呈显著负相关，却与谷氨酸和天冬氨酸一直呈显著正相关，表明乳植杆菌属代谢是加菌发酵鱼糜鲜味氨基酸增加的主要原因。内源蛋白酶水解破坏肌原纤维蛋白的结构是导致鱼糜凝胶特性下降的主要原因^[30-31]。除了内源蛋白酶外，腐败微生物分泌的蛋白酶是发酵食品中的主要蛋白酶来源，用以满足腐败微生物的生长和繁殖^[32]。整个发酵时期的相关性结果表明，植物乳植杆菌加菌发酵主要通过抑制其他微生物特别是腐败微生物的数量以及对蛋白质的水解作用，来改善罗非鱼发酵鱼糜的凝胶强度。

4.   结论

植物乳植杆菌加菌发酵显著改善了罗非鱼鱼糜的凝胶强度，在第18小时即可达810.5 g·cm，明显高于自然发酵第45 小时 (504.7 g·cm)。加菌发酵能够明显抑制鱼糜中蛋白质的降解，大部分游离氨基酸及总氨基酸含量明显降低，但谷氨酸和天冬氨酸的含量却显著增加，表明加菌发酵能够改善罗非鱼鱼糜的鲜味。罗非鱼鱼糜在自然发酵和加菌发酵过程中共检测到18个丰度 >1%的菌属，不动杆菌属、巨大球菌属和链球菌属为原料鱼中主要微生物菌属，随着发酵的进行大部分菌属的丰度有所下降，乳球菌属和乳植杆菌属分别为自然发酵和加菌发酵的主要菌属，在发酵末期的相对丰度分别达到55.88%和63.71%。自然发酵和加菌发酵罗非鱼鱼糜中的菌落总数随着发酵的进行均呈先升后降的趋势，加菌发酵能够显著抑制微生物特别是腐败微生物的生长，其菌落总数显著下降。不同发酵时间的相关性分析显示，凝胶强度在整个发酵时期与菌落总数和总氨基酸呈显著负相关；仅乳植杆菌属与菌落总数和总氨基酸一直呈显著负相关而与凝胶强度呈显著正相关，表明植物乳植杆菌加菌发酵主要通过抑制其他微生物，特别是腐败微生物的数量以及对蛋白质的水解作用，来改善罗非鱼发酵鱼糜的凝胶强度。

综上，植物乳植杆菌作为一种发酵剂可以显著提高鱼糜的凝胶强度，抑制腐败微生物的生长，具有开发高品质的罗非鱼鱼糜发酵制品的应用潜力。