金焰笛鲷rDNA基因转录间隔区ITS-1序列分析

徐田军, 刘楚吾, 刘丽, 吴勇

徐田军, 刘楚吾, 刘丽, 吴勇. 金焰笛鲷rDNA基因转录间隔区ITS-1序列分析[J]. 南方水产科学, 2006, 2(5): 61-64.
引用本文: 徐田军, 刘楚吾, 刘丽, 吴勇. 金焰笛鲷rDNA基因转录间隔区ITS-1序列分析[J]. 南方水产科学, 2006, 2(5): 61-64.
XU Tianjun, LIU Chuwu, LIU Li, WU Yong. Sequence analysis of the internal transcribed spacer 1(ITS-1) of ribosomal DNA gene of Lutjanus fulviflamma[J]. South China Fisheries Science, 2006, 2(5): 61-64.
Citation: XU Tianjun, LIU Chuwu, LIU Li, WU Yong. Sequence analysis of the internal transcribed spacer 1(ITS-1) of ribosomal DNA gene of Lutjanus fulviflamma[J]. South China Fisheries Science, 2006, 2(5): 61-64.

金焰笛鲷rDNA基因转录间隔区ITS-1序列分析

基金项目: 

广东省重大科技兴海项目 A200099A01

详细信息
    作者简介:

    徐田军(1982-),男,硕士研究生,从事水产动物分子生物学研究。E-mail:tianjunxu@163.com

    通讯作者:

    刘楚吾,E-mail:swyjs@gdou.edu.cn

  • 中图分类号: Q959

Sequence analysis of the internal transcribed spacer 1(ITS-1) of ribosomal DNA gene of Lutjanus fulviflamma

  • 摘要:

    以特异性引物扩增了金焰笛鲷(Lutjanus fulviflamma)的核糖体第一转录间隔区(ITS-1),扩增产物经克隆后测序,测得ITS-1长度为566 bp。其中A、T、G、C 4种碱基的含量分别为14.1%、16.1%、30.2%、39.6%,G+C(69.8%)含量明显高于A+T含量(30.2%)。将此引物在笛鲷属其他4种鱼类中扩增,发现该对引物有很好的通用性;比较发现在不同种中ITS-1存在着较大的差异,适合将其应用于分子系统学和种质资源方面的研究。

    Abstract:

    The PCR technique was used to amplify rDNA-ITS-1 of Lutjanus fulviflamma, then the purified PCR productions were cloned into T-vector and sequenced by M13+/-primers.As a result, 566 bp nucleotide sequences of rDNA-ITS1 were obtained. The average contents of A, T, G and C were 14.1%, 16.1%, 30.2% and 39.6%, respectively, the contents of GC (69.8%) were obviously higher than those of AT. Using these primers, ITS-1 region can be amplified in other four Lutjanus species, but the lengths of ITS-1 were largely different between different species.

  • 初级生产力的流向(Fate)是当前海洋生态学研究的热点之一。初级生产力以颗粒有机物和溶解有机物2种方式存在于水体。细菌能迅速利用溶解有机物这部分初级生产力,但由于其体积小而不能被大中型浮游动物(体长>200 μm)有效摄食。而微型浮游动物(体长2~200 μm)能大量摄食细菌,自身又是meso级浮游动物(体长约200~2 000 μm)的饵料,从而使得这部分溶解态的初级生产力得以传递到食物网的高层[1]。因此,微型浮游动物在微食物网与传统食物链连接的能量通道中有着重要意义。研究海洋生态系统的营养动力学机制,微型浮游动物的摄食及能量转化是其研究重点之一[2-3]。在一些海区,微型浮游动物能大量摄食浮游植物,在避免赤潮的产生中也扮演重要角色[4-6]。我国学者利用稀释法或荧光标记法研究了胶州湾,东海,香港海域、厦门海域,厦门杏林虾池等水域微型浮游动物对浮游植物的摄食压力[7-14]。研究结果表明,在不同的海域,微型浮游动物对浮游植物的摄食压力存在较大差异。大亚湾是我国目前水域生物多样性保存良好的重要海湾,也是我国重要的亚热带物种种质资源库。“低营养,高生产力”是该湾不同于其它海湾的一个重要特点[15]。近20年来,大亚湾由贫营养状态发展到中营养状态,大亚湾营养限制因子由20世纪80年代的N限制过渡到目前的P限制[16]。在生态环境变化过程中,微型浮游动物在海湾生态系统中的重要性是否发生变化仍未知。有关大亚湾微型浮游动物的研究较少[17],其摄食生态学方面的研究还未开展。

    本文利用稀释法,以叶绿素a的浓度来表示浮游植物的浓度,对大亚湾海域5个站位微型浮游动物对浮游植物的摄食压力进行了初步研究,为了解大亚湾生态系统的结构和能量流动提供基本资料和参数。

    2005年3月13日至17日,在大亚湾湾口以内约500 km2的海域设置5个站位(图 1),采用稀释法研究微型浮游动物对浮游植物的摄食压力。

    图  1  大亚湾调查站位图
    Figure  1.  Survey stations in Daya Bay

    微型浮游动物摄食率应用LANDRY等[18]提出的稀释法测量。在各站位采集距表层0.5 m水样,按《海洋监测规范》操作,其中,pH、DO分别用pH计、YSL Model 55溶氧测定仪现场测定,盐度用比重法测定,化学需氧量(COD)用碱性高锰酸钾法测定,DIN用重氮-偶氮法、次溴酸钠氧化法、锌镉还原法测定,无机磷用磷钼兰分光光度法测定。

    微型浮游动物摄食率实验用水样经200 μm筛绢过滤后,一部分水样用0.2 μm滤膜(孔径47 mm)Gelman滤器过滤以获得无颗粒水(particle-free water,PFW),另一部分水样与PFW按2∶0,2∶0.5,2∶1,2∶1.5比例混合,轻轻倒入2 L的磨口玻璃培养瓶中(培养瓶使用前经10%盐酸浸洗10 h,用自来水冲洗干净,每个稀释比例设2个平行样),放入培养箱,在甲板上利用自然海水流动循环培养24 h,使实验条件尽可能接近自然条件。培养期间多次晃动培养瓶,以使微型浮游动物和浮游植物混合均匀。

    培养前,用孔径0.2 μm的滤膜过滤海水1 L,滤膜迅速冷冻保存。在实验室内,滤膜放入具塞刻度试管中用5 mL 90%丙酮,于20℃暗处萃取24 h。上清液用722光栅分光光度计测定吸光值,依据JEFFREY等[19]的改进公式计算叶绿素a的含量。培养24 h后用上述方法采集、测定培养后叶绿素a值。

    稀释法最早由LANDRY等[18]提出,现已成为研究微型浮游动物摄食的常用方法之一。假设海水中浮游植物的生长率为μ,微型浮游动物的摄食率为g,浮游植物处于指数增长期,培养前的浓度为P0,培养后浓度为Pt ,那么Pt= P0e(μ-g) t,其中t为培养时间。方程可表示为:

    $$ \frac{\ln \left(P_t / P_0\right)}{t}=\mu-g $$ (1)

    计算每个培养瓶的浮游植物表观生长率(apparent growth rate,AGR) $\frac{\ln \left(P_t / P_0\right)}{t}$,然后计算实际稀释因子(actual dilution factor,ADF):

    $$ \mathrm{ADF}=P_0\left(X_i\right) / P_0\left(X_0\right) $$ (2)

    其中,P0(Xi)是初始培养处理中Xi组分的浮游植物现存量,Xi=1-无颗粒水占培养水的比例,P0(X0)是初始培养处理中未稀释的浮游植物现存量。实际稀释因子也称稀释度或稀释因子,也可表示为自然海水与混合海水的体积比。微型浮游动物的摄食率(g)和浮游植物的内禀生长率(μ)可用AGR和ADF的线性回归方程获得,其中截距为浮游植物的内禀生长率(μ),斜率为微型浮游动物的摄食率(g)

    微型浮游动物的摄食影响可以用浮游植物净生长率(net growth rate of phytoplankton, NGR)、对浮游植物现存量的摄食压力(Ps)、对浮游植物潜在初级生产力的摄食压力(Pp)表示,计算公式如下:

    $$ \text { NGR }=\mu-g $$ (3)
    $$ P_s=\frac{\left(C_0 e^\mu-C_0\right)-\left(C_0 e^{\mu-g}-C_0\right)}{C_0} \times 100 $$ (4)
    $$ P_s=\frac{\left(C_0 e^\mu-C_0\right)-\left(C_0 e^{\mu-g}-C_0\right)}{C_0 e \mu-C_0} \times 100 $$ (5)

    另外,浮游植物加倍的时间(Td),每天的加倍数(n),公式如下:

    $$ T_d=\ln 2 / \mu $$ (6)
    $$ n=\mu / \ln 2 $$ (7)

    各站位的水温变化较小,盐度总体上呈近岸向湾口递减的趋势。叶绿素a的高值区出现在湾北部的S1(6.55 μg·L-1),低值区则出现在湾东部的S7(0.70 μg·L-1),叶绿素与盐度的时空变化特点较相似。S1、S4站的COD值最高,这可能与沿岸施工及港口排污等等有关。各测站的环境参数见表 1

    表  1  各测站的表层环境参数
    Table  1.  Environmental parameters at stations
    站位
    stations
    水深/m
    depth
    盐度*
    salinity
    水温/℃
    temperature
    叶绿素a/μg·L-1
    Chl-a
    化学需氧量/mg·L-1
    COD
    S1 5.8 32.21 15.4 6.55 6.73
    S4 10.5 32.09 15.6 2.45 7.05
    S7 10.0 31.82 15.2 0.70 6.20
    S8 10.1 32.09 15.2 1.93 6.66
    S11 18.0 31.69 15.3 1.70 6.80
    注:* 统一校正到17.5℃时的盐度
    Note:* Salinity is standardized to 17.5℃.
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    稀释实验的结果见表 2,实验期间,S1和S11站浮游植物的生长率大于微型浮游动物的摄食率,而S4、S7和S8站浮游植物的生长率则小于微型浮游动物的摄食率。

    表  2  大亚湾微型浮游动物的摄食结果分析
    Table  2.  Analysis on the results of grazing of the microzooplankton in Daya Bay
    站位
    stations
    采样水深/m
    sampling depth
    R2 μ/d-1 G/d-1 NGR/d-1 %Ps %Pp Td/d n/d-1
    S1 0.5 0.61 0.90 0.88 0.02 144 99 0.77 1.30
    S4 0.5 0.90 0.59 0.96 -0.37 111 138 1.17 0.85
    S7 0.5 0.76 1.14 1.74 -0.6 258 121 0.61 1.64
    S8 0.5 0.53 0.16 0.67 -0.51 57 330 4.33 0.23
    S11 0.5 0.45 0.51 0.33 0.18 47 70 1.36 0.74
    注:R2. 由表观生长率[ln(Pt/P0)]与实际稀释因子(ADF)得到的回归直线中的相关因子;μ. 浮游植物内禀生长率;g. 微型浮游动物摄食率;NGR. 浮游植物净生长率;%Ps. 对浮游植物现存量的摄食压力;%Pp. 对浮游植物潜在初级生产力的摄食压力;Td. 浮游植物数量加倍所需的时间;n. 每天浮游植物加倍的数量
    Note:R2. correlation coefficient;μ. instantaneous growth rate of phytoplankton;g. ingestion rate of microzooplankton;NGR. net growth rate of phytoplankton;%Ps. percentage of phytoplankton standing crop ingested by microzooplankton;%Pp. percentage of phytoplankton potential production ingested by microzooplankton;Td. time of doubling;n. times per day
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    S1站浮游植物现存量最高,其生长率也较高,且大于微型浮游动物的摄食率,浮游植物的实际生长率为正值(0.02),浮游植物的生物量很可能会增加。

    S4站浮游植物的现存量、生长率、微型浮游动物的摄食率等各项指标值均处于5个站对应指标值的中间水平。

    S7站浮游植物的生长率最高,但其现存量最低,微型浮游动物的摄食造成此现象的主要原因之一。在5个站位中,S7站微型浮游动物的摄食率是最高的,微型浮游动物对浮游植物现存量的摄食压力高达258%。S7站微型浮游动物的摄食对浮游植物潜在生产力的压力并不是最高,这预示着微型浮游动物对浮游植物的摄食作用有减小的趋势。浮游植物的生长是多种生物活动综合作用的结果,并不仅仅取决于微型浮游动物的摄食,该站浮游植物现存量仅需0.61 d(14 h左右)即可翻倍,但由于微型浮游动物的摄食,其现存生物量仍很低。可见,在S7站,微型浮游动物的摄食起着重要作用。

    S8站浮游植物初始现存量较高,但浮游植物的生长率和微型浮游动物的摄食率都较低,微型浮游动物对浮游植物现存量的摄食压力最小(57%),但潜在初级生产力的摄食压力却最大。与S7站相反,该站浮游植物现存量翻倍所需的时间最长,为4.33 d。

    S11站回归方程的相关系数R2较低,这可能与实验过程中一个培养瓶取样失败使实验数据缺失一个有关,该站浮游植物的现存量及生长率均处于中等水平,但微型浮游动物的摄食率最小,浮游植物的净生长率(NGR)为0.18,对浮游植物现存量和潜在生产力的摄食压力都是最小的,分别为47%,70%,但此站浮游植物现存量翻倍所需的时间却较长,这可能与该站的营养盐或其它因素有关,具体原因有待于今后进一步研究。

    浮游生态系中浮游植物与浮游动物的摄食关系研究是海洋生态系统中一个关键的过程研究。浮游动物的摄食受各营养阶层组成粒级结构的影响。在大细胞浮游植物占优势的海区,浮游植物被中型浮游动物摄食的经典食物链较重要,而在以小细胞植物为主的生态系统中,则以微型浮游动物对小细胞的浮游植物及细菌摄食的微食物环为主。近年来发现微型浮游生物在海洋生态系统中扮演重要角色,浮游动物摄食研究的重点就转向了微型浮游动物的摄食研究[18, 20-25]。评估微型浮游动物的摄食对浮游植物现存量的影响,对了解有害微藻水华发生的动力学机制有重要意义。

    总体来讲,微型浮游动物的摄食速率、对浮游植物现存量的摄食压力由近岸区向湾中部呈增加趋势,在S7、S8站达到峰值,然后再向湾外呈减少趋势。若不考虑S7(由于浮游植物的初始浓度较低,微型浮游动物的摄食压力估计值可能偏高),其余4个站的研究结果与最优摄食理论(optimal foraging theory)相符合,摄食者对被摄食者的清除率(clearance rate,相当于本研究中的摄食率)随着被摄食者的浓度增加会达到一个最大值,但随后就降低(图 2)。在S1站,虽然浮游植物现存量最大,但摄食率却低于S4站。这反映微型浮游动物在控制浮游植物生长方面有重要作用,但若浮游植物的密度过高时,浮游动物是无法控制浮游植物生长的,具体阈值有待进一步研究。

    图  2  微型浮游动物摄食与叶绿素a浓度的关系
    Figure  2.  The relations between grazing rate of microzooplankton and the concentration of chlorophyll a

    由于缺乏本海区的有关微型浮游动物研究的历史资料,难以进行纵向比较。与其它海区比较(表 3),大亚湾微型浮游动物的摄食压力处于较高水平;与国内海区相比,比胶州湾、香港东部海域、厦门海域高,与渤海、东海海域大致相当。

    表  3  不同海区微型浮游动物的对浮游植物潜在初级生产力摄食压力
    Table  3.  Comparasion of microzooplankton grazing pressure on potential primary production
    海区
    sea areas
    对浮游植物潜在初级生产力的摄食压力
    grazing pressure on primary production (%Pp) /d-1
    参考文献
    citation
    旧金山湾San Francisco Bay 44~722 [20]
    墨西哥湾Gulf of Mexico 30 [21]
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    法国比斯开湾BiscayBay, France 73~136 [23]
    加拿大北部琼斯海峡Jones Sound,NWT 40~114 [24]
    加拿大北部巴芬湾Baffin Bay,NWT 37~88 [24]
    华盛顿沿岸Washington coast 17~52 [22]
    新西兰沿岸NZ coast 20~194 [25]
    南极普里兹湾Prydz Bay,Antarctic 4~60 [11]
    渤海Bohai sea, China 95~319 [10]
    胶州湾内Jiaozhou Bay, China 53~93 [7]
    胶州湾外Outside Jiaozhou Bay, China 74~84 [7]
    东海East China Sea 74~203 [26]
    香港东部海域East of Hong Kong water 79 [8]
    香港西部海域West of Hong Kong water 127 [8]
    厦门海域Xiamen water, China 52~102 [13]
    厦门杏林虾池Xiamen Xinglin Shrimp Ponds, China 37~194 [12]
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    在大亚湾,微型浮游动物对初级生产有着重要的调控作用。近年来的研究表明,病毒在微食物环中也起着重要作用,病毒的存在使得微食物环的能流和物质循环更趋向复杂。今后,应进一步加强微食物环及大型浮游动物对微型浮游动物摄食的研究,因为微型浮游动物使碳通量减小,而大型浮游动物是碳通量的主要贡献者[27]

  • 图  1   金焰笛鲷的ITS-1 PCR产物

    1~4. 金焰笛鲷4个个体的扩增产物; M. 分子量标记

    Figure  1.   PCR product of ITS-1 of L.fulviflamma

    1~4. L.fulviflamma; M. DNA ladder

    图  2   金焰笛鲷ITS-1核苷酸序列

    Figure  2.   Nucleotide sequence of ITS-1 from L.fulviflamma

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图(2)
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出版历程
  • 收稿日期:  2006-06-02
  • 修回日期:  2006-07-16
  • 刊出日期:  2006-10-19

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