合浦珠母贝(Pinctada fucata)分布范围广，在中国主要分布于广东、广西、海南及台湾省沿海地区^[1-2]，是海水珍珠养殖的主要贝类，其所产珍珠产量占中国整个海水珍珠产量的95%以上^[3]，具有极高的经济价值，并且所产珍珠为蜚声中外的“南珠”。但不同产地合浦珠母贝所产珍珠质量有所差异，传统上广东湛江的雷州所产珍珠的质量最为上乘，而且雷州被誉为珍珠之乡，并获得了“南珠”原产地认证。造成这种珍珠产地的质量差异的原因目前较少见有报道。合浦珠母贝属于滤食性双壳贝类，水体中的浮游生物和其他悬浮颗粒等都可作为合浦珠母贝的饵料。不同饵料营养价值不同^[4]，不同营养价值的饵料对生理功能的影响也不同，珍珠的形成是外因条件和贝体一系列生理功能作用的结果，因此研究不同海区合浦珠母贝的食物组成及其差异或可为探讨珍珠质量的地区差异提供一定线索，同时为进一步了解合浦珠母贝的摄食生理提供基础数据。

目前贝类的食物组成研究主要用解剖法^[5]，但该方法只能获得即时的摄食信息，对过往的摄食情况和是否同化利用不得而知。而近年来发展起来的脂肪酸标志法则可弥补这一缺陷。脂肪酸标志法通过特定的化合物在生物体内的特异性表达来揭示生物可能摄取的食物^[6-8]。脂肪酸作为生物标志能够真实地反映动物最近一段时期内摄食并实际同化的食物来源状况，具体体现在生物饵料中的脂肪经消费者消化吸收后被分解成脂肪酸并且相对稳定地储存到消费者的组织中，或生物体内含某种特异性、或是某几种高含量的脂肪酸^[9]，这些具有特异性来源的脂肪酸可作为生物标志物来研究生物的食物来源。

国际上已经确定并得到较广泛认可的脂肪酸标志物主要有大型海洋植物、陆源有机质、浮游生物及异养细菌等几类，其中尤以鞭毛藻类、硅藻、细菌以及陆源有机质标志应用较广泛^[10-12]。COOK等^[13]采用脂肪酸标志法研究比较了4种生境中海胆的食物组成情况，结果显示由于潮间带褐藻生长繁盛，在此生活的海胆体内表现出高相对质量分数的C_{18 : 4}(n-3)和C_{20 : 4}(n-6)，表明了海胆对褐藻的高摄食；而C_{18 : 1}(n-9)/C_{18 : 1}(n-7)较低及奇数碳、支链脂肪酸的高相对质量分数显示了底质细菌对扇贝养殖筏架上和泥质潮间带生活的海胆的重要食物贡献。EZGETA-BALIĆ等^[14]分析了不同季节4种经济贝类的脂肪酸标志情况，消化腺脂肪酸分析显示春夏季所有物种主要摄入浮游植物，其次是浮游动物和碎屑，而秋冬季浮游动物和/或碎屑在双壳类动物的饮食中变得更加重要。XU等^[15]联合应用脂肪酸标志法和稳定同位素比值法，比较研究了胶州湾不同生境中滤食性贝类的食物来源差异，发现浮游硅藻、细菌及陆源有机质为湾内栉孔扇贝(Chlamys farreri) 的主要饵料来源，而潮间带贻贝(Mytilus galloprovincialis) 和牡蛎(Crassostrea gigas) 饵料组成中硅藻类贡献最大，其次是鞭毛藻。中国对于脂肪酸标志法研究水生生物的食性有不少报道，而对合浦珠母贝的食性研究较少见到。该研究运用脂肪酸标志法分析海南新村和黎安、广东雷州和徐闻、广西白龙和营盘6个海区养殖的合浦珠母贝的5类食物组成及其差异，并就饵料对珍珠质量的影响进行初步探讨。

1.   材料与方法

1.1   样品采集

2013年9月13日，9月15日，9月24日，9月25日，10月3日和10月4日，在海南的新村和黎安、广东的徐闻和雷州、广西的白龙和营盘6地分别随机取合浦珠母贝(1.5龄)12~16只，样品采集地及基础数据见表 1。将所有的样品去除表面垃圾并清洗干净，放于已过滤海水中暂养24 h排空胃内容物。将暂养后的合浦珠母贝进行解剖，取消化腺组织，冷藏带回实验室，于-80 ℃冷冻保存备用。

表  1  合浦珠母贝采集地及基础生理数据

Table  1  Cultivation locality and biological data of P.fucata

采样日期sampling date	采样点location	温度/℃ temperature	壳长/mm shell length	壳高/mm shell height	壳宽/mm shell width
2013-09-13	新村新村港18°22′N, 109°59′E	27	61.06±1.69	61.06±2.11	24.22±0.97
2013-09-15	黎安黎安港18°23′N, 110°06′E	24	60.54±2.83	61.47±2.37	24.19±1.21
2013-09-24	徐闻丰隆港20°24′N, 109°57′E	23	67.30±1.44	70.40±1.37	24.98±1.04
2013-09-25	雷州流沙湾20°27′N, 109°55′E	23	64.90±2.76	67.53±3.04	21.80±0.94
2013-10-03	白龙珍珠港21°31′N, 108°21′E	27	50.26±2.24	54.36±1.81	18.92±4.29
2013-10-04	营盘北部湾21°28′N, 109°52′E	26	64.35±4.48	67.72±5.37	25.91±1.56
注：壳长、壳宽及壳高均为平均值±标准差 Note：Shell length，shell width and shell height are expressed as X±SD.

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1.2   样品处理

将4只合浦珠母贝消化腺组织合并(n=3)，于冷冻真空干燥机冷冻干燥48 h，干燥后取出用剪子将组织尽量剪碎，密封后于-80 ℃冰箱保存待分析。

1.3   脂肪酸分析

1.3.1   脂肪酸测定

脂肪提取及脂肪酸甲酯化主要参照SAITO^[16]的方法并适当改进。

1) 粗脂肪提取。取冷冻干燥样品0.1~0.2 g于离心管Ⅰ中，加入2 mL氯仿-甲醇溶液[V(氯仿) : V(甲醇)=2 : 1]，密封后以振荡器充分混合，室温下避光静置2~3 h，然后以9 000 r · min^-1离心15 min，离心2次，用1 mL注射器吸取上层溶液到试管Ⅱ中。往离心管Ⅰ中再次加入2 mL氯仿-甲醇溶液，提取、分离同前，并将2次的上清合并。向试管Ⅱ中加入0.5%氯化钙(CaCl₂)1.6 mL，振荡器上混合0.5 min后，在9 000 r · min^-1下离心15 min，离心2次。用10 mL注射器将下层溶液转移到质量为W₁的离心管Ⅲ中，后用氮气(N₂)吹扫至干燥或粘稠油状。用纸巾清洁试管外壁汗渍及灰尘后称量管质量W₂，粗脂肪质量为W₂与W₁之差。后往离心管Ⅲ中充N₂，加盖密封后保存于-20 ℃冰箱。

2) 脂肪酸甲酯化。向试管Ⅲ中加入1 mol · L^-1氢氧化钠(NaOH)-甲醇溶液1.0 mL，震荡混匀并充N₂，然后在60 ℃水浴中振摇皂化至油滴消失(约15~30 min)。取出离心管并加入2.0 mL三氟化硼甲醇溶液(14%)，混匀后再次充N₂并封口，于60 ℃水浴中水浴30 min。趁热加入正己烷(分析纯)2.0 mL，充入N₂后混匀，并继续在60 ℃水浴锅中加热2 min后取出。待试管冷却到室温后加入3.0 mL饱和氯化钠(NaCl)溶液，静置15 min后以注射器吸取上层有机层，经过滤器过滤后盛入1.5 mL棕色进样瓶Ⅰ中，充入N₂，密封保存于-20 ℃冰箱内。

3) GC-MS仪器条件。色谱条件为色谱柱DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度230 ℃；升温程序为110 ℃保持4 min，以10 ℃ · min^-1的速度升温到160 ℃保持1 min，最后以5 ℃ · min^-1上升到240 ℃保持15 min；载气为氦气；流量为1.52 mL · min^-1；采用恒线速度，分流比为1 : 30。质谱条件为离子源温度200 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z 40~550，溶剂切除时间为3 min。

1.3.2   脂肪酸标志物

此研究所选用的脂肪酸标志物种类见表 2。

表  2  主要脂肪酸标志物

Table  2  Main fatty acid biomarkers

来源source	主要脂肪酸标志物main fatty acid biomarker	参考文献Reference
硅藻diatom	C16:1(n-7)/C16:0、EPA[C20:5(n-3)]/DHA[C22:6(n-3)]	[14]，[17]
鞭毛藻类或原生动物dinoflagellates/protozoa	DHA[C22:6(n-3)]	[18]，[19]
大型绿藻或陆生植物chlorophyta/terrestrial plants	∑[C18:2(n-6)+C18:3(n-3)]	[20]，[21]
褐藻phaeophyta	C20:4(n-6)	[22]，[23]
细菌bacteria	C18:1(n-7)/C18:1(n-9)、奇数碳及支链脂肪酸	[24]，[25]

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1.4   统计分析

利用计算机NIST 0.5谱库数据库检索、参考各脂肪酸的保留时间，定性出所有的脂肪酸。按面积归一化法进行分析，求得各脂肪酸相对质量分数。检测的数据用平均值表示。用SPSS 19.0软件进行统计分析，差异性检验采用单因子方差分析(ANOVA，Tukey检验)检验，置信水平取95%。

2.   结果

2.1   6个地域合浦珠母贝消化腺粗脂肪质量分数

海南新村和黎安、湛江雷州和徐闻、广西白龙和营盘6地合浦珠母贝消化腺粗脂肪质量分数见图 1，依次为35.18%，24.61%，35.42%，40.67%，34.92%和30.21%。其中湛江徐闻合浦珠母贝消化腺粗脂肪质量分数最高，显著高于海南黎安与广西营盘的，而与新村、雷州及白龙的无显著差异。

图  1  6个地域合浦珠母贝消化腺粗脂肪质量分数不同上标字母表示粗脂肪质量分数差异显著(P < 0.05)，后图同此

Fig. 1  Relative content of crude fat of digestive gland in P.fucata from six sites Different superscript letters indicate significant difference in relative content of crude fat (P < 0.05). The same case in the following figures.

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2.2   6个地域合浦珠母贝消化腺的脂肪酸组成

广西白龙养殖的合浦珠母贝消化腺中均检出18种脂肪酸，海南新村、湛江雷州和广西营盘养殖的合浦珠母贝消化腺中检出19种，而海南黎安与湛江徐闻养殖的合浦珠母贝消化腺中检出20种(表 3)。实验测得新村和黎安养殖的合浦珠母贝消化腺脂肪酸总量显著高于其他4个地域，并且雷州和营盘的合浦珠母贝消化腺脂肪酸总量显著高于徐闻和白龙。对于饱和脂肪酸(SFA)，徐闻和白龙合浦珠母贝消化腺的相对质量分数显著低于其他4个地域。测得新村、黎安及雷州合浦珠母贝消化腺的单不饱和脂肪酸(MUFA)相对质量分数均显著高于其他3个地域，同时徐闻和营盘的合浦珠母贝消化腺MUFA相对质量分数也显著高于白龙。在相对质量分数最高的多不饱和脂肪酸(PUFA)中，雷州合浦珠母贝的相对质量分数显著低于其余5个地域，而新村和白龙的相对质量分数显著高于其余4个地域。

表  3  不同地域合浦珠母贝消化腺脂肪酸组成(相对质量分数，n=3)

Table  3  Fatty acids of digestive gland in P.fucata from different places (fatty acids content)

脂肪酸fatty acid (FA)		脂肪酸相对质量分数/% fatty acids content
		新村Xincun	黎安Li′an	徐闻Xuwen	雷州Leizhou	白龙Bailong	营盘Yingpan
饱和脂肪酸saturated FA	C14:0	3.44±0.55	3.74±0.30	1.66±0.04	3.67±0.32	0.77±0.29	1.67±0.47
	C15:0	0.38±0.02	0.51±0.07	0.31±0.02	0.24±0.02	0.26±0.02	0.39±0.15
	C16:0	14.60±0.69	14.48±0.63	13.26±1.14	14.13±0.09	13.38±0.55	15.33±1.30
	C17:0	1.19±0.09	1.31±0.01	1.24±0.01	0.25±0.00	0.06±0.01	-
	C18:0	6.49±0.15	6.72±0.17	6.38±0.19	7.86±0.41	7.28±0.28	8.54±0.12
	C20:0	0.47±0.38	0.43±0.14	0.09±0.02	-	-	0.20±0.15
	C22:0	0.31±0.27	0.17±0.05	0.09±0.00	0.72±0.04	0.17±0.03	0.13±0.06
∑SFA/%		26.88±0.39a	27.36±0.85a	22.94±1.07b	26.87±0.61a	21.92±0.62b	26.26±1.21a
单不饱和脂肪酸multiple unsaturated FA	C16:1(n-7)	10.97±0.20	10.67±0.64	8.72±0.25	15.02±0.29	8.30±0.17	10.02±0.26
	C18:1(n-6)	-	1.78±0.06	1.40±0.73	0.45±0.06	-	0.57±0.70
	C18:1(n-7)	2.46±0.17	2.71±0.09	1.75±0.66	0.41±0.01	0.48±0.04	0.53±0.07
	C18:1(n-9)	2.97±0.14	2.10±0.18	2.27±0.03	2.61±0.11	2.43±0.09	2.87±0.89
	C20:1(n-9)	2.07±0.25	2.21±0.29	1.32±0.63	1.31±0.17	1.22±0.38	1.54±0.80
∑MUFA/%		18.47±0.32a	19.47±0.48a	15.46±0.26b	19.80±0.23a	12.43±1.00c	15.53±0.69b
多不饱和脂肪酸poly unsaturated FA	C18:2(n-6)	1.14±0.19	0.45±0.24	0.88±0.04	1.17±0.30	0.59±0.01	1.03±0.49
	C18:3(n-3)	3.50±1.17	0.54±0.06	0.95±0.15	0.89±0.39	1.35±0.10	1.03±0.11
	C20:2(n-7)	0.51±0.17	1.12±0.65	1.90±0.28	0.59±1.07	1.31±0.18	2.26±0.68
	C20:4(n-6)	6.98±0.55	6.53±0.45	6.27±0.76	3.61±0.12	9.08±0.58	5.26±0.70
	C20:5(n-3)	8.67±0.28	8.77±1.13	7.23±0.11	9.40±0.24	8.54±0.33	8.81±1.39
	C22:6(n-3)	11.38±0.76	11.43±0.20	10.32±0.24	8.32±0.04	10.87±0.38	10.56±0.35
∑PUFA/%		32.18±0.78a	28.84±0.08b	27.55±1.77b	23.98±1.37c	31.74±1.22a	28.95±0.91b
支链脂肪酸branched-chain FA	14-iso	0.66±0.04	0.98±0.07	0.86±0.17	0.33±0.03	0.58±0.20	0.12±0.03
	16-iso	1.28±0.28	1.41±0.26	1.06±0.18	0.59±0.14	0.55±0.15	0.78±0.19
脂肪酸总量/% total FA		79.47±2.66a	78.06±1.21a	67.87±1.44c	71.57±1.79b	67.22±1.18c	71.64±1.59b
注：-. 未检测到；不同上标字母表示相对质量分数差异显著(P < 0.05) Note：The symbol "-" indicates that fatty acids contents were not detected. Different superscript letters indicate fatty acids contents are significantly different (P < 0.05).

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2.3   脂肪酸标志物

6个地域合浦珠母贝脂肪酸标志及差异情况见图 2。在雷州养殖区，合浦珠母贝消化腺脂肪酸C_{16 : 1}(n-7)/C_{16 : 0}大于1(1.06)，同时EPA/DHA也较高(1.13)，表现出显著的硅藻类脂肪酸特征。相比而言其他地区合浦珠母贝硅藻类脂肪酸标志相对质量分数比较低，C_{16 : 1}(n-7)/C_{16 : 0}和EPA/DHA均低于1(P < 0.05)。总体来看黎安合浦珠母贝消化腺细菌脂肪酸标志相对质量分数显著高于其他5个地区，C_{18 : 1}(n-7)/C_{18 : 1}(n-9)大于1(1.29)，同时奇数碳/支链脂肪酸相对质量分数高达4.21%(P < 0.05)。新村、黎安、徐闻、白龙及营盘合浦珠母贝消化腺中鞭毛藻类或原生动物脂肪酸标志相对质量分数均显著高于雷州养殖海区(P < 0.05)。新村合浦珠母贝消化腺表现出高优势的大型绿藻或陆生植物脂肪酸标志，高达4.64%，是其他5个地区的2倍多，差异显著(P < 0.05)。白龙养殖的合浦珠母贝消化腺中C_{20 : 4}(n-6)显著高于其余地区，相对质量分数为9.08%，表现出优势的褐藻脂肪酸标志(P < 0.05)。

图  2  硅藻(a)、细菌(b)和鞭毛藻类或原生动物、大型绿藻或陆生植物及褐藻类(c)脂肪酸标志差异

Fig. 2  Difference of fatty acid biomarkers for diatom (a), bacteria (b) and dinoflagellates/protozoa, chlorophyta/terrestrial plants and phaeophyta (c)

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3.   讨论

滤食性贝类的食物来源极其复杂，它可以筛选并摄取其所处环境中所有粒径大小合适的有机质颗粒作为食物来满足自身的能量需求^[26]。研究发现，双壳贝类消化腺是其脂质存储的主要组织^[27]，并且其物质与能量也是由内脏囊(主要包括消化腺组织)流动传输到各组织^[28]，所以该研究选取合浦珠母贝消化腺作为脂肪酸标志的分析材料。文章通过脂肪酸标志法分析发现，硅藻、鞭毛藻类或原生动物、大型绿藻或陆生植物颗粒、褐藻类及细菌等都可能是合浦珠母贝的食物来源，并且不同养殖地区的合浦珠母贝的5类食物来源组成存在差异。

BUDGE等^[29]研究发现当∑[C_{18 : 2}(n-6)+C_{18 : 3}(n-3)]相对质量分数大于2.5%时即认为所研究对象对陆源有机质有明显的摄入。该研究结果显示，海南新村养殖的合浦珠母贝的该指标高达4.64%，显著高于其他地区，表明其摄入了部分陆生植物，可能与新村港周围都是较陡的山地其陆源植物较多有关。新村贝类养殖区毗邻南湾猴岛，岸边生长的灌木类及乔木类植物的树叶脱落腐解随水流进入港内，成为新村港内合浦珠母贝的有机质来源之一。同时高含量的∑[C_{18 : 2}(n-6)+C_{18 : 3}(n-3)]也是大型绿藻的特征，所以大型绿藻碎屑的贡献也不可忽视，还需更详细的研究来进一步确定。通常粒径>1.0 μm的细菌能为双壳贝类所利用，并且细菌类含氮量高，是双壳贝类理想的氮源。该研究发现黎安合浦珠母贝体内具有较高的细菌脂肪酸标志，表明黎安合浦珠母贝摄食了含大量细菌的悬浮颗粒物，与CHENG和LOPEZ^[30]的研究结果一致。湛江徐闻养殖的合浦珠母贝体内DHA及C_{20 : 4}(n-6)相对质量分数较高，可能摄食了富含DHA的鞭毛藻类(主要有金藻门、裸藻门、隐藻门和甲藻门)、原生动物以及标志C_{20 : 4}(n-6)的褐藻类的碎屑。湛江雷州地区生长的合浦珠母贝体内被检5类食物来源中硅藻显著高于其他地区。此外，徐闻养殖的合浦珠母贝处于流沙湾内的流沙港，而雷州养殖的处于流沙湾外，可见湾内与湾外的食物来源也具有显著性差异。在广西，除了鞭毛藻类或原生动物外，白龙海区的贝体中褐藻类脂肪酸标志物[C_{20 : 4}(n-6)]相对质量分数显著高于其他地区，这可能是由于贝滤食了褐藻这种大型藻类脱落及腐解的碎屑作为有机质来源之一，但海洋软体动物体内C_{20 : 4}(n-6)的来源比较复杂，它可能还标志着一些硅藻类、某些特定的细菌^[31]等，因此贝体内C_{20 : 4}(n-6)的准确来源还需更进一步的研究。

合浦珠母贝主要用于生产珍珠，但不同产地的珍珠质量有所不同。在中国普遍认为雷州所产珍珠质量最好，且养殖规模也一度最大。不同产地珍珠质量的差异是否与所摄食的饵料不同有关，目前尚缺乏研究予以证实。JOUBERT等^[32]研究发现微藻饵料浓度会影响珍珠贝壳的生长，同时对珍珠形成相关的壳基质蛋白矿化基因起到调控作用。薛桂英^[33]研究发现不同种类、不同浓度的藻类对珍珠形成相关基因的表达影响不同。该研究结果显示不同地区合浦珠母贝的饵料组成存在差异，其中雷州合浦珠母贝粗脂肪质量分数较高，检测出的脂肪酸种类最多，其摄食的硅藻也显著高于其他地区。硅藻是双壳类最优质的饵料，优良的饵料有利于生理功能的发挥和贝类的健康生长，从而促进珍珠形成相关基因的表达和生化矿化作用，因此饵料质量对珍珠质量可能存在一定影响。但其影响程度如何以及作用机制等值得进一步深入研究。

综上可知，贝类的食物来源组成与其养殖环境密切相关，因此该研究中6个不同地区养殖群体食物构成的差异，可能主要取决于其养殖环境的不同。同时，合浦珠母贝的食物来源丰富，硅藻类、细菌、鞭毛藻类或原生动物、大型绿藻碎屑或陆生植物颗粒及褐藻类的碎屑等都可为合浦珠母贝同化利用，这就为合浦珠母贝养殖中的饵料配制提供了多种可供选择的原材料，甚至为合浦珠母贝的工厂化养殖模式的建立提供了必要的理论依据。此外，也为探究不同地区珍珠贝对食物的选择性差异与所育珍珠质量的潜在关系奠定了基础。