明胶是胶原的局部水解产物，广泛应用于食品、医药及化妆工业。据报道，2006年全球的明胶总产量为28万t，其中中国的产量为3.1万t，且基本上是以牛、猪的皮骨为原料生产的^[1]。近年来，由于疯牛病及口蹄疫对人类健康的影响，哺乳动物胶原蛋白在功能性食品、化妆品及药用产品的应用受到限制，人们开始寻求从水产动物如鱼类组织中提取明胶。然而，鱼类明胶大规模应用于食品工业，一方面要有充足的原料来源以满足明胶的工业化生产，另一方面鱼类明胶必须如同哺乳动物明胶一样，具有良好的流变学性质如凝胶强度、凝胶点及溶点等^[2]。据FAO统计，2005年中国罗非鱼总产量达104万t，企业在加工冻罗非鱼片时，出肉率不足40%，每加工1 t罗非鱼片，约产生2 t的下脚料，留下大量的鱼皮、鱼头及鱼骨等废弃物，其中，鱼皮占了相当大的比例，是提取明胶潜在的原料。目前，工业化生产哺乳动物明胶通常使用酸法或碱法^[3]，该法耗时长。也有报道利用氢氧化钠浸泡提取明胶^[2]，此法用时较短，但仍需2 d以上。此文探讨了采用酸碱二元法提取明胶的工艺条件，旨在缩短罗非鱼皮明胶的提取周期，为工业化制备提供依据。

1.   材料与方法

1.1   材料与仪器设备

新鲜罗非鱼皮由湛江环球水产有限公司提供，经去鳞、清洗、除杂后冷冻至－18℃，备用。

羟脯氨酸及各种氨基酸标准品，Sigma公司产品；835-50型氨基酸自动分析仪，日本日立公司产品；UV-756MC紫外可见分光光度计，日本岛津公司产品；DK-98数显电热恒温水浴锅，余姚市东方电工仪器厂产品；101A2型电热鼓风干燥机，上海实验仪器有限公司产品；Tms-pro质构仪，Food Technology Corperation(U.S.A)产品；此试验所用试剂均为分析纯。

1.2   试验方法

1.2.1   营养成分的测定

参照文献[4]，水分测定采用常压干燥法；灰分测定采用高温灼烧法；粗脂肪测定采用索氏抽提法；粗蛋白测定采用微量凯氏定氮法；总糖测定采用蒽酮比色法。

1.2.2   鱼皮蛋白质的氨基酸组成分析

样品经6 mol · L^-1 HCL水解24 h，采用日立835-50型高速氨基酸分析仪分析17种氨基酸，另取样经5 mol ·L^-1 NaOH水解后，采用同机测定色氨酸含量。

1.2.3   鱼皮胶原蛋白含量的测定

采用分光光度比色法测定^[5]。通过测定鱼皮中羟脯氨酸含量，乘以相应的系数计算胶原蛋白的含量^[6]。

胶原蛋白(%) =羟脯氨酸(%) ×14.7^[7]

1.2.4   鱼皮明胶提取工艺流程

冻罗非鱼皮→解冻、漂洗→浸NaOH溶液→漂洗至中性→稀盐酸浸泡→漂洗至中性→熬胶→过滤→干燥→成品。操作要点：(1)鱼皮预处理解冻鱼皮，晾干剪碎按一定比例浸泡于NaOH溶液中，期间不时搅拌，然后浸泡于稀HCl溶液中，不断加快搅拌，使黑膜基本脱净，然后漂洗至中性，沥干。(2)鱼皮明胶的提取将经前处理过的鱼皮，按鱼皮重1.3倍加入水，恒温条件下熬胶，然后用200目筛过滤得澄清胶液，置于鼓风干燥箱内干燥，得到成品。

明胶得率(%) =干明胶重量(g) /鱼皮原重(g) ×100%

1.2.5   明胶提取试验方法

试验中以明胶得率及凝胶强度为指标，选择浸碱的浓度(A)、浸碱时间(B)及熬胶温度(C)3个因素，每个因素3个水平，按L₉ (3³) 正交表进行试验。正交试验因素水平见表 1。

表  1  正交试验因素水平表

Table  1.  Factors and levels of orthogonal test

	NaOH浓度/% NaOH concentration	处理时间/h treatment time	熬胶温度/℃ extraction temperature
	A	B	C
1	2.0	3.5	55
2	2.5	4.0	65
3	3.0	4.5	75

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1.2.6   鱼皮明胶理化及微生物指标测定

明胶的水分、pH、凝胶强度、菌落总数及大肠菌群等指标测定，参照文献[8]。凝胶强度以勃鲁氏(bloom)表示，在严格规定的条件下，直径为12.7 mm的圆柱，压入含6.67%(W/W)明胶的冻胶表面以下4 mm所施加的力，以g为单位。

2.   结果与讨论

2.1   罗非鱼皮基本成分

罗非鱼皮经去鳞后，清洗、沥干，取样进行基本成分分析，结果见表 2。

表  2  罗非鱼皮的一般营养成分

Table  2.  Nutrient contents of the skin of tilapia %

水分moisture	灰分ash	粗蛋白crude protein	粗脂肪crude lipid	总糖total sugar
65.01±0.25	1.17±0.01	33.14±0.03	1.56±0.02	0.05±0.01

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从表 2可知，罗非鱼皮中粗蛋白含量高达33.14%(以湿基计)，与斑点叉尾NFDAA (Ictalurus punctaus)皮基本持平^[9]，均高于淡水鱼鲢(Hypophthalmichthys molitrix)皮(25.9%)、鳙(Aristichthys nobilis)皮(23.6%)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)皮(29.8%)^[10]及波罗的海鳕鱼(Gadus marhua)皮(24%)^[7]，是较好的蛋白质来源原料。

2.2   罗非鱼皮蛋白质氨基酸组成

对罗非鱼皮进行水解，再用氨基酸自动分析仪测定其氨基酸含量，结果见表 3。

表  3  罗非鱼皮蛋白质氨基酸组成

Table  3.  Amino acid composition of the skin of tilapia

氨基酸 amino acid	样品中含量/% content in sample	粗蛋白中含量/mg·g-1 content in crude protein
门冬氨酸Asp	2.16	65.3
苏氨酸*Thr	0.93	28.1
丝氨酸Ser	0.93	28.1
谷氨酸Glu	3.35	101.1
脯氨酸Pro	3.74	112.9
甘氨酸Gly	7.21	217.6
丙氨酸Ala	3.15	95.1
胱氨酸Cys	0.30	9.1
缬氨酸*Val	1.13	34.1
甲硫氨酸*Met	0.82	24.7
异亮氨酸*Ile	0.86	26.0
亮氨酸*Leu	1.37	41.3
酪氨酸Tyr	0.34	10.3
苯丙氨酸*Phe	1.04	31.4
赖氨酸*Lys	1.51	45.6
组氨酸His	0.37	11.2
精氨酸Arg	2.72	82.1
色氨酸*Try	0.06	1.8
总量total	34.57
必需氨基酸 essential amino acid	7.72
注：*. 必需氨基酸 Note：*. essential amino acid

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从表 3中可知，在罗非鱼皮蛋白质的氨基酸组成中，必需氨基酸占氨基酸总量的22.33%，显然不是优质蛋白质。但其中的甘氨酸含量极为丰富，约占氨基酸总量的20%，符合胶原蛋白氨基酸组成特点。可见罗非鱼皮的蛋白质组成主要为胶原蛋白。

2.3   罗非鱼皮胶原蛋白含量

据报道，羟脯氨酸(Hyp)和羟赖氨酸(Hyl)是胶原蛋白的特有组成成分^[11-12]，在其它非胶原蛋白中很少发现。通过测定鱼皮羟脯氨酸含量，即可计算出其胶原蛋白含量。比色法测定罗非鱼皮羟脯氨酸的含量为1.89%，则胶原蛋白含量为27.8%，占其粗蛋白含量的83.9%，与淡水鱼草鱼(77%)、鲤(Cyprinus carpio)、鲫(Carassius auratus)等鱼皮中的含量相似^[13]。因此，利用罗非鱼加工下脚料中的鱼皮提取明胶，是既丰富又经济的原料。

2.4   罗非鱼皮明胶的提取

鱼皮预处理中，浸碱的浓度、时间及熬胶温度对明胶得率及其凝胶强度影响较大。因而选择浸碱的浓度(A)、浸碱时间(B)及熬胶温度(C)3个因素，每个因素3个水平，按L₉ (3³) 正交表进行试验。试验结果见表 4。

表  4  正交设计及结果

Table  4.  L₉ (3³)orthogonal design and result

	A	B	C	得率/% yield	凝胶强度/g gel strength
1	1	1	1	26.2	679
2	1	2	2	24.83	603
3	1	3	3	23.41	558
4	2	1	2	19.07	627
5	2	2	3	23.45	609
6	2	3	1	21.24	669
7	3	1	3	14.06	547
8	3	2	1	16.28	524
9	3	3	2	17.59	474
		得率/% yield
K1	74.46	59.35	63.74
K2	63.76	64.56	61.49
K3	47.93	62.24	60.92
	24.82	19.78	21.25
	21.25	21.52	20.50
	15.98	20.76	20.31
R	8.84	1.74	0.94
		凝胶强度/g gel strength
K1	1 840	1 853	1 872
K2	1 905	1 736	1 704
K3	1 845	1 701	1 714
	613	618	624
	635	579	568
	515	567	571
R	120	51	56
注：A. NaOH浓度；B. 浸碱时间；C. 熬胶温度 Note：A. concentration of NaOH；B. treatment time；C. extraction temperature

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根据表 4极差R的大小判断，各因素对罗非鱼皮明胶得率影响主次关系为A>B>C，即浸碱浓度对得率影响最大，其次是浸碱时间，最适宜条件为A₁B₂C₁；对凝胶强度而言，影响的主次关系为A>C>B，适宜条件为A₂B₁C₁。

对正交试验结果进行方差分析，结果见表 5、表 6。

表  5  得率的方差分析

Table  5.  Variance analysis on gel yield

变异来源 error sources	SS	DF	MS	F	F0.05
A	118.768	2	59.384	8.554	19.00
B	4.542	2	2.271	< 1	19.00
C	1.482	2	0.741	< 1	19.00
误差error	13.884	2	6.942
总变异 total error	138.678	8
注：A. NaOH浓度；B. 浸碱时间；C. 熬胶温度 Note：A. concentration of NaOH；B. treatment time；C. extraction temperature

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表  6  凝胶强度的方差分析

Table  6.  Variance analysis on gel strength

变异来源 error sources	SS	DF	MS	F	F0.05
A	24 538.89	2	12 269.45	12.16	19.00
B	4 224.23	2	2 112.12	2.09	19.00
C	5 920.89	2	2 960.45	2.93	19.00
误差error	2 017.56	2	1 008.78
总变异 total error	36 701.56	8
注：A. NaOH浓度; B. 浸碱时间; C. 熬胶温度 Note：A. concentration of NaOH；B. treatment time；C. extraction temperature

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熬胶温度影响到胶原分子3股螺旋的次级键及部分肽键的断裂，随着温度的升高，胶原分子的单链、少量聚合体进入溶液，胶原转变为明胶。因此，明胶的提取温度一般要高于胶原纤维的收缩温度。但过高的温度会影响到明胶的性质。从方差分析结果来看，各因素不同水平间对罗非鱼皮明胶得率及凝胶强度影响不显著，即碱液浓度在2%~3%，对明胶得率影响不大；提取得到的明胶外观状态A₂优于A₁，故选择A₂(2.5%)；结合凝胶强度结果，B₁优于B₂。温度在55~75℃间，对得率指标影响不显著，因此，选择C₁水平，即55℃。综合上述分析，最终确定的最佳工艺条件为A₂B₁C₁。即罗非鱼皮在2.5% NaOH浸泡3.5 h，然后用0.02% HCl处理3 h，去尽黑膜，再在55℃下熬胶提取明胶。

验证试验结果与分析一致，罗非鱼皮的明胶提取得率为26.5%，明显高于草鱼皮(19.2%)^[14]及鳕鱼皮的明胶得率(12.3%)^[7]。

2.5   罗非鱼皮明胶理化及微生物指标

对根据上述确定的提取工艺制得明胶, 对其理化及微生物指标进行测定，结果见表 7、表 8。

表  7  罗非鱼皮明胶理化指标

Table  7.  Physicochemical properties of fish skin geltin

凝胶强度/g gel strength	粗蛋白*/% crude protein	水分/% moisture	灰分/% ash	pH	透明度/mm transparency
631	82.43	8.97	0.63	5.9	355
注：*粗蛋白含量=N×5.51[15] Note：*The conversion factor for calculating the content of crude protein is 5.51.

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表  8  罗非鱼皮明胶理化及微生物指标

Table  8.  Microorganisms in fish skin geltin

粘度/mPa·s viscosity	水不溶物/% insoluble solids	菌落总数/CFU·g-1 number of bacteria	大肠菌群coliform group
6.1	0.1	1.34×105	阴性

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凝胶强度是衡量明胶质量的一个重要指标，其价格与用途都与此有关。一般来说，鱼类明胶的凝胶强度比哺乳动物明胶低^[2]。罗非鱼皮在适宜的条件下提取的明胶，其凝胶强度为631 g，经含水量修正后计算的凝胶强度(含水量为12%)为468 g，优于国家标准GB6783-94皮食用明胶的B型A级，也明显高于黄鳍金枪鱼(Thunnus albacares)皮明胶(426 g)^[2]、斑点叉尾NFDAA鱼皮明胶(415 g)^[9]、草鱼皮明胶(267 g)^[14]、牛皮及猪皮明胶(分别216和295 g)。这是因为明胶来源于胶原，胶原的特征影响其明胶的性质。罗非鱼是热带鱼，其明胶有较高的凝胶强度，与GÓMEZ-GUILLÉN等^[16]的报道相一致。

3.   结论

罗非鱼皮中含有丰富的蛋白质，其主要成分为胶原蛋白，约占鱼皮粗蛋白的83.9%，氨基酸组成中甘氨酸含量约占氨基酸总量的20%；罗非鱼皮提取明胶较适宜的工艺条件是: 在2.5% NaOH浸泡3.5 h，然后用0.02% HCl处理3 h，去尽黑膜，并在55℃条件下熬胶，提取得率为26.5%；所得明胶的粗蛋白含量为82.46%，凝胶强度高达468 g，其它各项理化指标均优于B型A级皮食用明胶标准。因此，罗非鱼将是制备明胶的良好来源。