鳙鱼(Aristichthys nobilis)，又名胖头鱼、大头鱼、花鲢、麻鲢，属硬骨鱼纲(Osteichthyes)，鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，鲢亚科(Hypophthal-michthynae)，是我国著名的“四大家鱼”之一；近年来，由于不规范的人工繁殖及人工放流^[1]，致使鳙鱼的品质退化严重，自然水体中鳙鱼的种质资源遭到了不同程度的破坏。为了保护和开发我国这一独特的淡水鱼类资源^[2]，了解和研究其遗传特性，分子生物学技术必将成为鳙鱼遗传分析和品种改良的有力工具之一^[3]，而提取高质量的鳙鱼基因组DNA是进行各种分子生物学研究的基础和前提^[4-5]。

本实验采用苯酚/氯仿抽提法和试剂盒法提取鳙鱼的新鲜的及乙醇保存的肌肉、肝脏、尾鳍基因组DNA，并进行了综合比较分析^[6]。

1.   材料与方法

1.1   实验用鱼及生化试剂

实验所用样品鱼由湖南洞庭水殖公司鱼类良种繁殖场提供，均为该公司人工繁殖的1⁺龄鳙鱼鱼种；生化试剂中琼脂糖(Agarose)由西班牙进口，蛋白酶K(PK)由Merk公司分装，Tris碱由BBI公司分装，以上产品均购自上海生工，其余试剂及耗材均购自北京天为时代科技有限公司。

1.2   材料处理

用消毒过(酒精灯)的解剖工具解剖活鱼，剪取肌肉、肝脏、尾鳍，一部分直接用于基因组DNA提取，另一部分保存在无水乙醇中，4~5 h后更换为95%乙醇4℃冰箱保存备用。

1.3   实验方法

1.3.1   试剂盒法

选用购于北京天为时代科技有限公司的TIANamp Genomic血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，按照使用说明书的步骤进行。

剪取30 mg材料，蒸馏水冲洗, 滤纸吸干，分别放入1.5 mL离心管剪碎；剪碎后离心1 min(10 000 rpm)，去上清。加200 μL缓冲液(GA)振荡15 s至悬浮；加PK(20 mg·mL^-1)20 μL混匀，56℃水浴2~3 h至组织溶解，简短离心；加220 μL裂解缓冲液(GB)振荡15 s，70℃水浴10 min至溶液清亮，简短离心；加220 μL无水乙醇(-20℃预冷)沉淀10 min，简短离心；将全部溶液倒入一个吸附柱(CB3)中，12 000 rpm离心30 s，倒掉废液；加500 μL去蛋白液(GD)，12 000 rpm离心30 s，倒掉废液；加700 μL洗脱缓冲液(GW)，12 000 rpm离心30 s，倒掉废液；加500 μL GW，12 000 rpm离心30 s，倒掉废液；再12 000 rpm离心2 min后，将CB3置50℃烘箱内干燥5~10 min。

将CB3置离心管内悬空加50~100 μL洗脱缓冲液(TE，65~70℃预热)，室温静置2~5 min，12 000 rpm离心30 s，离心后的溶液再放入CB3中，室温放置2~5 min，离心2 min，离心管内的溶液即为DNA溶液，4℃暂存。

1.3.2   常规苯酚/氯仿抽提法

提取过程参照薛宝国^[7]的方法并有所改动；取样100 mg，方法同前，然后加入700 μL STE(10 mM Tris-Cl pH 8.0，1 mM EDTA)裂解液，20 μL蛋白酶K(2 mg·mL^-1)，20 μL SDS(20%)，颠倒混匀。56℃水浴锅中水浴3.5 h以上，凉至室温加18 μL RNase_ A (4 mg·mL^-1)，37℃水浴1 h以上；稍离心后加等体积平衡酚(37℃预热)，颠倒混匀10 min，12 000 rpm离心10 min，使用大口径Tip头取上清液；重复一次，取上清液400~500 μL；加等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀10 min，12 000 rpm离心10 min，取上清液；重复一次；加等体积氯仿/异戊醇(24：1)，颠倒混匀10 min，12 000 rpm离心10 min，取上清液。加2.5倍体积无水乙醇(-20℃预冷)沉淀，-20℃放置30 min以上，12 000 rpm离心5~10 min，移去酒精，加75%酒精200 μL洗涤2次，离心5 min，将离心管倒置于滤纸上自然风干。加100~150 μL TE溶解，4℃暂存。

1.4   DNA样品浓度、纯度及质量检测

1.4.1   紫外分光光度计检测

对2种方法提取的DNA溶液稀释50倍，在Biophotometer生物分光光度计(Eppendorf)上直接测定并记录DNA样品的浓度、光密度OD₂₆₀值、OD₂₈₀值及光密度比A_260/280值。

1.4.2   琼脂糖凝胶电泳检测

0.8%的琼脂糖凝胶[含EB 0.5% (m/v)]电泳检测DNA样品的质量，电压5 V·cm^-1，使用Lambda DNA× EcoRI+Hind III Marker作为标准；当溴酚蓝指示带距胶末端2 cm处时停止电泳，Gel-Pro Analyzer凝胶成像系统下观察拍照。

2.   结果与分析

2.1   分光光度检测结果

分析2种方法对新鲜样品的不同组织DNA溶液共55个样品(表 1)，试剂盒法得到的样品纯度要好，其中A_260/280介于1.80左右的有8个样品，占样品总数的67%，但是浓度偏低；而常规苯酚/氯仿抽提法得到的DNA样品浓度较高，但是纯度不够好，A_260/280值在1.80左右的占总样品数的57%，特别是肝脏，没有一个样品的A_260/280达到1.8以上，最高值也只有1.75，显示其纯度较差。2种方法对乙醇保存组织所提取DNA的浓度差异不大(表 2)，2种方法得到的肝脏DNA浓度都较高，所有样品中的最高值1 020 μg·mL^-1也在肝脏，但是纯度不理想，A_260/280明显低于1.8。

表  1  新鲜组织基因组DNA的检测结果

Table  1  Testing results of genomic DNA from fresh tissue

材料 material	试剂盒法 extraction kit method				苯酚/氯仿抽提法 Phe/Chl method
	肌肉 muscle	肝脏 liver	尾鳍 caudal fin		肌肉 muscle	肝脏 liver	尾鳍 caudal fin
A260/280浓度/μg·mL-1 concentration	2/4* 98.8** (115~321)	1/2 175.7 (100~341.4)	5/6 200.55 (129.5~430)		8/20 253.67 (100~304.1)	2/5 380.2 (155.5~1 004.9)	15/18 476.31 (160~1 086.3)
注：* 分子代表A260/280值在1.80左右样品数，分母代表所测该组织DNA样品总数(表 2同)；** 值为平均值，括号内为所测样品范围值(表 2同) Note：* The numerator represents the sample number of A260/280 amount which is about 1.80 and the denominator represents the total number of the samples (Same as Tab. 2). ** The numbers denote the average amount and numbers in brackets denote the concentration range of the DNA samples (Same as Tab. 2).

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表  2  乙醇保存组织基因组DNA的检测结果

Table  2  Testing results of genomic DNA from the tissue kept in ethanol

材料 material	试剂盒法 extraction kit method				苯酚/氯仿抽提法 Phe/Chl method
	肌肉 muscle	肝脏 liver	尾鳍 caudal fin		肌肉 muscle	肝脏 liver	尾鳍 caudal fin
A260/280浓度/μg·mL-1 concentration	2/4* 333.75** (122.5~450)	0/2 690 (360~1 020)	3/5 348.75 (145~525.5)		12/15 389.7 (115~798)	0/5 595.7 (124.6~1 000.5)	14/15 455 (128.25~975.25)

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2.2   苯酚/氯仿抽提的基因组DNA电泳检测结果

0.8%琼脂糖凝胶检测不同方法保存的组织基因组DNA部分图谱见图 1。DNA分子量大小基本一致，接近23 kb，说明是完整的基因组DNA，其中部分样品有拖尾现象，如图中7、10、12号等，分析可能是DNA有所降解；图的部分点样孔中有滞留的亮带，这是蛋白质没有抽提干净的结果。由图可以比较用不同方法保存的组织所提取的基因组DNA是有差别的，从新鲜组织提取的DNA电泳带较淡，显示其浓度要低，但是这一现象在肝脏出现了意外，结果恰好相反，本方法能够由新鲜肝脏组织提取出基因组DNA(图中6、8号)，而经过乙醇保存的肝脏却很难得到满意的结果。如图中5和7号，7号电泳条带不成型，且拖尾严重；5号样品虽然有带，但是蛋白质含量高，不适合进行下面的实验。这样的结果可能与3种组织的成分不同有关。

图  1  苯酚/氯仿抽提法提取的DNA电泳图

1~4. 肌肉；5~8. 肝脏；9~12. 尾鳍; 1、3、5、7、9、11号为乙醇保存样品; 2、4、6、8、10、12为新鲜组织样品

Fig. 1  Electrophoresis pattern of genomic DNA by Phe/Chl method

Note: 1~4. muscle; 5~8. liver; 9~12. caudal fin No.1, 3, 5, 7, 9 and 11 are stored in alcohol, and the others are fresh orgnizations.

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2.3   试剂盒法抽提的基因组DNA电泳检测

0.8%琼脂糖检测试剂盒提取的基因组DNA部分样品(图 2)，由图可见，3、4和8号亮度高，说明其浓度大，但是有拖尾现象，也显示出DNA有所降解；另1~4号点样孔中还有微量蛋白质的痕迹；电泳结果与紫外分光光度法检测的结果基本一致。试剂盒提取的DNA结果也与苯酚/氯仿抽提法的结果一致，不同方法保存的不同组织之间有差异，但是没有后者明显。

图  2  试剂盒法提取的部分基因组DNA电泳图

注：1~4. 尾鳍；5~6. 肌肉；7~8. 肝脏；其中1、3、5、7为乙醇保存样品，2、4、6、8为新鲜组织样品

Fig. 2  Electrophoresis pattern of genomic DNA by Kits

Note: 1~ 4. caudal fin; 5~6. muscle; 7~8. liver; No.1, 3, 5 and 7 are stored in alcohol, and the others are fresh orgnizations.

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3.   讨论

DNA作为分子生物学研究的基础，其提取方法多种多样。酚/仿抽提法、甲酰胺解聚法、异丙醇沉淀法、试剂盒快速抽提法、SDS裂解法^[8-9]等均能有效获得大分子基因组DNA。在本实验中，采用试剂盒法和苯酚/氯仿/异戊醇抽提法提取3种组织的基因组DNA；2种方法取材和消化过程基本一致，由于试剂盒不需要进行反复的抽提，操作简便，耗时短；但是样品取材少，DNA得率低；苯酚/氯仿/异戊醇抽提法相对成本低，在实验过程中，每隔30 min上下颠倒摇动几次，动作尽量轻柔，可以减少DNA断裂的机会；吸取上清时使用200 μL大口径平口Tip头，使用20 μL移液枪少量多次抽取，也可以获得高质量DNA；而且该方法得率高，适于大量提取。

要得到完整的基因组DNA，选择材料很重要，本实验选取3种材料肌肉、肝脏和尾鳍，由电泳图可知，均有比较满意的结果，但是肌肉和肝脏中含有较多的各种蛋白，增加了消化的难度，而且取肌肉和肝脏就不可避免的要杀鱼，而剪取尾鳍就不存在这一问题，由于只要取少量的软尾鳍尖，在短时间内就可以复原，不会对鱼体造成太大的伤害，特别是对于研究珍稀鱼类的遗传结构非常有利。在本实验中，从尾鳍条提取的DNA浓度和纯度都是最令人满意的；但是在DNA溶液的保存过程中也发现，尾鳍DNA最容易降解，其中的原因还有待于进一步分析。

实验材料的保存方法^[10]也是获得良好结果的关键，2种方法对新鲜组织提取的DNA均不同程度出现了拖尾现象，但是用乙醇固定保存后的样品就避免了这一缺点。由于新鲜组织含有血液、体液和黏液蛋白，给样品的消化增加了难度，同时新鲜样品中的水分降低了裂解液的浓度；本实验中对材料进行了2次处理，先用无水乙醇快速固定，4~5 h后再更换为95%的乙醇长久保存，从而尽可能保证了样品中的DNA不被降解。但是，经过乙醇保存的肝脏样品提取的DNA质量却很差，这可能与肝脏含有较多的糖类有关。