合浦珠母贝(Pinctada fucata)又称马氏珠母贝，广泛分布于广东、广西和海南沿海，是培养海产珍珠的重要贝类。自20世纪60年代人工育苗成功以来，海水珍珠养殖发展迅速。然而近年来，由于多年的人工繁殖生产和养殖环境的恶化，出现了个体小型化、抗病力差、育珠质量低等性状退化现象，海水珍珠质量和单位产量明显下降，给养殖产业造成了重大损失。因此，迫切需要开发养殖优良新品种。分子标记辅助选育已成为遗传育种领域的研究热点之一。利用分子标记对育种材料进行遗传分析，有助于对育种材料的合理选择，减少盲目性，优化育种措施，提高选育效率，从而加快选育进程。对于遗传背景资料较少的育种对象，AFLP分子标记技术是进行遗传分析的重要手段^[1]。

遗传选育主要包括混合选育和家系选育。在家系选育中，目前主要开展了标记在家系中的遗传分离和遗传图谱的构建研究^[2-6]，但对不同家系之间的遗传多样性和遗传结构研究较少^[7-8]。本文对AFLP分子标记在合浦珠母贝3个家系中的遗传及家系的遗传变异进行了比较，以便为选择合适的作图家系以及合浦珠母贝家系育种过程中制定科学合理的选育措施、优化选育策略和遗传多样性监测管理提供依据。

1.   材料与方法

1.1   家系材料

合浦珠母贝家系的构建于2003年在海南三亚南海水产研究所热带水产研究开发中心进行。所用合浦珠母贝亲本材料分别来自印度和我国海南三亚。每个家系选取合浦珠母贝雌雄亲本各1个进行解剖、人工授精，产生全同胞家系。共构建3个家系，分别是印度养殖贝♀×印度养殖贝♂家系，简称印度家系(PII)；三亚野生贝♀×印度养殖贝♂家系，简称杂交家系(PSI)；三亚野生贝♀×三亚野生贝♂家系，简称三亚家系(PSS)。每个家系的幼苗分别在不同的水泥池中培育，然后在海区养殖。取Ⅰ龄贝闭壳肌样品保存于95%乙醇溶液中备用。每个家系采30个子代和双亲个体用于实验分析。

1.2   模板DNA的提取

DNA的提取按SAMBROOK等^[9]并稍作改进^[10]。取20 mg酒精保存的合浦珠母贝肌肉组织于培养皿中洗净，放入1.5 mL高压灭菌的离心管中，加200 μL TEN9细胞裂解缓冲液(Tris-Cl 50 mmol · L^-1，pH 9.0，EDTA 100 mmol · L^-1，NaCl 200 mmol · L^-1)，剪碎后再加TEN9溶液400 μL，混匀后加10% SDS溶液150 μL、蛋白酶K(20 mg · mL^-1)10 μL，摇匀后于56℃消化至澄清。然后分别用等体积的饱和酚、酚: 氯仿: 异戊醇(25:24:1)、氯仿: 异戊醇(24 : 1)抽提，取上清，直至无蛋白相。再加入2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的NaAc(3 mol · L^-1，pH 5.2)于-20℃沉淀DNA 2 h后，离心10 min。弃上清液，沉淀用75%乙醇洗涤2次，室温干燥后加100 μL去离子超纯水溶解。提取的基因组DNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，Biometra紫外分光光度计测定OD₂₆₀和OD₂₈₀，配成20 ng · μL^-1的DNA溶液备用。

1.3   AFLP实验步骤

AFLP的实验步骤基本按VOS等^[11]并略作修改^[12]。基本过程包括基因组DNA(约100 ng)双酶切(MseI和EcoRI)，然后与相应的接头连接，连接产物用于PCR预扩增和选择性扩增分析。预扩增反应体系为20 μL，包括10×PCR缓冲液2 μL，2 mmol · L^-1dNTPs 2 μL，25 mmol · L^-1 MgCl₂ 1.2 μL，EcoRI预扩引物(10 μmol · L^-1)和MseI预扩引物(10 μmol · L^-1)各0.6 μL，Taq酶(5 u·μL^-1)0.1 μL，连接产物1 μL。PCR反应程序为94℃ 2 min，然后20个循环，每个循环包括94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min。选择性扩增的PCR反应体系为20 μL，包括引物(10 μmol · L^-1)各0.5 μL，DNA模板(即稀释10倍后的预扩增产物)5 μL，其它成份与预扩增相同。PCR反应程序为94℃ 2 min，65℃ 30 s，72℃ 1 min，然后10个循环，94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，每个循环退火温度降低1℃，至56℃，再进行30个循环，最后72℃ 5 min。从筛选的选扩引物中用3对引物E-AGG/M-CCA、E-AGG/M-CAA和E-ACC/M-CGC进行选择性扩增。

选择性扩增产物用5%的聚丙稀烯酰胺胶进行电泳分离、银染，然后统计扩增位点数。有扩增带的个体该位点记为“1”，无带的个体记为“0”。3对引物的记录合并在一起进行统计分析。

1.4   数据处理

统计扩增的位点数，有扩增的个体记为“+”，无扩增的记为“-”。根据亲本标记在子代中的分离情况确定分离方式。如果双亲均有扩增带(+/+)而在F₁代发生分离，则双亲的基因型均为Aa，分离方式为3 : 1；如果双亲的带型为多态(+/-或-/+)而在F₁代发生分离，则双亲的基因型为Aa和aa，其分离方式应为1 : 1；如果亲本的扩增带在F₁代不发生分离，则其中1个亲本的基因型为AA。然后用卡方检验(Chi-square test)来检测AFLP标记的遗传和分离是否符合孟德尔分离规律(显著性水平P=0.05)，并用分离位点数/总位点数计算分离位点比例(S)。

用贝叶斯算法估计隐性等位基因a的频率q^[13]，其计算用AFLP-SURV v1.0^[14]软件进行，显性等位基因A的频率p=1-q。多态位点以等位基因的频率低于(含等于)0.95为准，多态位点比例P_0.05=多态位点数/总位点数。利用所获得的等位基因频率数据，按LYNCH和MILLIGAN^[15]的方法，用AFLP-SURV v1.0软件无偏估计基于等位基因频率的种群(即家系)基因多样性h_S及其方差VarI(个体引起)和VarL(位点引起)、平均基因多样性H_S(即h_S的平均值)及其方差VarI、VarL和VarP(种群引起)、总基因多样性H_T(将3个家系合并为1个群体)、家系之间的遗传分化D_ST(H_T-H_S)和遗传分化指数G_ST(D_ST/H_T)^[16]。用随机排列检验(random permutation test)10 000次重复检测种群间遗传分化指数的显著性。用MEGA 3^[17]构建基于NEI和LI^[18]遗传距离的UPGMA系统树。

2.   结果

2.1   扩增结果和标记的遗传与分离

3对选择性引物E-AGG/M-CCA、E-AGG/M-CAA和E-ACC/M-CGC共产生57个位点(图 1)，各家系扩增位点见表 1。PII共扩增57个位点，分离位点50个，占87.7%，有7个位点不分离(表 1)，占位点总数的12.3%，其亲本表型均为+/+，没有异常分离位点。在50个分离位点中，有35个位点的分离符合孟德尔遗传规律，占分离位点的70.0%，其中父本特有标记6个，母本特有标记6个，双亲共有标记23个，分别占17.1%，17.1%和65.8%。符合孟德尔遗传规律的1：1分离位点有12个，3：1分离的位点23个，分别占分离位点数的24.0%和46.0%，占符合孟德尔遗传规律位点数的34.3%和65.7%。偏离孟德尔遗传规律的位点共15个(其中父本特有标记、母本特有标记和双亲共有标记各有5个)，占分离位点数的30%。其中偏离1：1和3：1的分别有10个和5个。

图  1  用E-ACC/M-CGC引物组合扩增的PII的部分AFLP电泳图谱

左边二道为雌雄亲本，其余为子代个体

Figure  1.  Partial AFLP electrophoretic gel for Indian P.fucata family (PII)amplified using E-ACC/M-CGC primer combination

The first two lanes on the left are female and male parents, respectively.The other lanes represent the F₁ individuals.

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表  1  AFLP分子标记在合浦珠母贝家系内的遗传分离与家系遗传多样性

Table  1.  Genetic segregation and diversity within P.fucata families using AFLP markers

家系 family	样本数 no.	位点数 no. loci	分离位点数 no. segregating loci		N	S	P0.05	hS±S.E.	VarI%	VarL%
			1：1	3：1
PII	25	57	12a/10b	23a/5b	7	87.7	100.0	0.434±0.011	52.2	47.8
PSI	25	54	14a/9b	8a/0b	23	57.4	94.7	0.331±0.022	27.6	72.4
PSS	26	53	14a/0b	12a/11b	16	69.8	93.0	0.366±0.019	25.6	74.4
注：N. 不分离位点数；S.分离位点比例；P0.05. 多态位点比例；hS. 家系内的基因多样性；VarI%. 个体差异产生的方差比例；VarL%. 位点差异产生的方差比例；a. 符合孟德尔分离规律的位点数；b. 不符合孟德尔分离规律的位点数 Note：N. number of non-segregating loci；S. proportion of segregated loci；P0.05. proportion of polymorphic loci at 5% level；hS. gene diversity within family；VarI% and VarL%. percentage of variance due to sampling of individuals and loci, respectively；a. loci segregating in Mendelian ratio；b. loci segregating in distortion

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PSI共扩增位点54个，分离位点31个，占57.4%，有23个位点不分离，占位点总数的42.6%，其亲本表型均为+/+，没有异常分离位点。在分离的31个位点中，有22个位点符合孟德尔遗传规律，占分离位点的71.0%，其中1：1分离的有14个，3：1分离的8个，分别占分离位点总数的45.2%和25.9%，占符合孟德尔遗传规律位点数的63.6%和36.4%。在22个符合孟德尔遗传规律的位点中，父本特有标记和母本特有标记各7个，双亲共有标记8个，分别占31.8%，31.8%和36.4%。偏离孟德尔遗传规律的位点9个，全部为1：1分离位点，占分离位点数的28.9%，其中父本特有标记4个、母本特有标记5个。

PSS共扩增53个位点，分离位点37个，占69.8%，有16个位点不分离，占位点总数的30.2%，其亲本表型均为+/+，没有异常分离位点。在分离的37个位点中，有26个位点符合孟德尔遗传规律，占分离位点的70.3%，其中1：1分离的14个，3：1分离的12个，分别占分离位点数的37.8%和32.4%，占符合孟德尔遗传规律位点数的53.8%和46.2%。在26个符合孟德尔遗传规律的位点中，父本特有的标记10个，母本特有的标记4个，双亲共有的标记12个，分别占38.5%，15.4%和46.1%。偏离孟德尔遗传规律的位点有11个，全部为3：1分离位点，占分离位点数的29.8%，且全部为双亲共有标记。

2.2   家系的遗传多样性

3个家系的多态位点(即分离位点)比例为93.0%~100.0%(表 1)。3个家系的基因多样性在0.366~0.434之间，其中PII的多样性为最高，PSI的最低。在PSS和PSI中多样性的方差约25%来自于个体差异，75%来自于位点差异，而在PII中，个体差异和位点差异对多样性的贡献各占50%。

2.3   群体间的遗传结构和遗传分化

3个家系的总基因多样性(total gene diversity)(H_T)为0.460，平均基因多样性(mean gene diversity over population)(H_S)是0.377 ± 0.030；来自于个体差异(VarI)，位点差异(VarL)和家系差异(VarP)的方差比例分别为3.5%、8.2%和88.3%。家系之间的平均遗传差异(D_ST)是0.083±0.000，平均遗传分化指数(G_ST)为0.180；10 000次排列检测表明，观测值与理论值具有显著性差异(P < 0.001)。两两家系间的遗传分化指数范围为0.147~0.214(表 2，下三角)，PII与PSS之间的分化值最小(0.147)，PSI与PSS之间的最大(0.214)。

表  2  合浦珠母贝家系间的遗传分化(下三角)与遗传距离(上三角)

Table  2.  Pairwise G_ST (the lower diagonal) and NEI & LI′s (1979) genetic distances (the upper diagonal) among the three P.fucata families

家系 family	印度贝♀×印度贝♂ Indian P.fucata×P.fucata♂	三亚贝♀×印度贝♂ Sanya P.fucata♀×Indian P.fucata♂	三亚贝♀×三亚贝♂ Sanya P.fucata♀×P.fucata♂
	PII	PSI	PSS
PII	-	0.144	0.121
PSI	0.182	-	0.157
PSS	0.147	0.214	-

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2.4   家系间的遗传距离和聚类分析

NEI氏遗传距离表明，PSS与PSI之间的遗传距离最大(0.157)，与PII之间的最小(0.121)(表 2，上三角)。UPGMA分子系统树显示，2个自繁家系的亲缘关系较近，而PSI与2个自繁家系的亲缘关系较远(图 2)。

图  2  合浦珠母贝家系的UPGMA分子系统树

PII. 印度贝♀×印度贝♂；PSI. 三亚贝♀×印度贝♂；PSS. 三亚贝♀×三亚贝♂

Figure  2.  UPGMA tree of P.fucata families based on NEI & LI′s(1979) genetic distance

PII. Indian P.fucata♀×P.fucata♂; PSI. Sanya P.fucata♀×Indian P.fucata♂; PSS. Sanya P.fucata♀×P.fucata♂

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3.   讨论

由于在子一代作图群体中显性标记只有1 : 1分离的类型可用于图谱构建，因此，检测显性标记在家系中的遗传特性非常重要。本研究中，PSI在分离位点比例最低的情况下，其1 : 1分离标记的比例(45.2%)却较2个种群内交配家系的高(PII 24.0%，PSS 37.8%)。在植物的品系间以及种间杂交家系也发现较高比例的1 : 1分离标记^[19-22]。表明利用地理隔离较远或性状差异较大的种内杂交家系进行遗传图谱构建具有较高的作图效率。此外，PII的少数位点在另2个家系中未出现扩增带，如果进行更多的AFLP扩增，将会出现更多的各自家系特有的带，这些带的组合可用于家系之间的标识和鉴别, 表明AFLP标记技术在家系鉴别方面具有较好的应用前景。

3个家系的多态位点比例高达93.0%以上，其中PII高达100.0%，最低是PSS，与随机群体的情况(91.8%~97.3%)相似^{[12, 23]}, 但分离位点比例的情况略有不同，最高仍是PII(87.7%)，最低却是PSI(57.4%)。本研究结果也表明，分离位点比例和多态位点比例的结果完全不同，对于显性标记来说分离位点比例实际上是一种表型的比例，容易误为多态位点比例，而真正的多态位点比例是根据等位基因的频率来界定的。因为即使一个位点所有个体都有扩增带，由于其基因型为AA或Aa，并不能直接判定2个等位基因的频率，因此不能简单认为该位点就是单态位点。也正因为扩增带的基因型的不确定性，显性标记的等位基因频率是根据无扩增带(aa)的基因型频率来估计的。估计方法主要有3种：aa基因型频率直接开方、LYNCH和MILLIGAN^[15]修订法和贝叶斯模拟法^[16]。直接开方容易过低估计a的频率，从而导致多态位点比例偏低，使多态位点比例等同于表型比例。

3个家系的遗传多样性指数平均为0.377，与我国的合浦珠母贝野生种群(0.373)和养殖种群(0.374)的平均遗传多样性差不多，其中PII的遗传多样性(0.434)较高，PSI较低(0.331)，PSS的遗传多样性(0.366)与本地自然种群(0.362)相似^{[12, 23]}。表明F₁代家系的遗传多样性未明显变化。遗传分化分析表明，3个家系群体间的遗传分化较大且显著(P < 0.001)，家系间的遗传差异为14.7%~21.4%，平均为18.0%(G_ST=0.180)，比三亚贝和印度贝的选育品系之间的遗传分化要大(9.9%~17.3%，未发表资料)，美洲牡蛎(Crassostrea virginica)的情况与之类似(AFLP ϕ_PT=6.2%~25.5%)^[24]。但在不同地理的合浦珠母贝种群之间，遗传分化指数只有0.8%~4.0%^[12]，养殖群体与野生群体之间也只有0.39%~1.93%^[23]。从多样性的方差来源看，PII个体之间的差异较大，占其方差的50%以上，而其余2个家系的只占25%左右，而位点引起的方差占75%左右。在中国、日本和澳大利亚合浦珠母贝种群的遗传变异中，也发现种群内基因多样性大部分来自于位点的变异^[10]。而对于家系之间，个体和位点之间的差异所起的作用较小，而家系之间的遗传差异起主要作用(占88%)。因此，在育种过程中对不同家系的遗传多样性和遗传分化进行跟踪检测是十分必要的。

PII与PSS的遗传距离最小，而PSI与2个种群内家系的距离较大，聚类分析也表明PII与PSS的亲缘关系较近；而PSI与之较远。表明PSI具有不同的遗传特性，是种群杂交优势的遗传基础。BOPPENMAIER等^[25]研究认为，在一定范围内亲本间的遗传距离越大，杂种优势越明显。很多研究表明，太平洋与印度洋之间种群的遗传差异显著^[26]。因此，印度的合浦珠母贝种群与太平洋种群之间的遗传差异应该比较大。由此也导致它们的杂交群体应该具有较好的杂交优势。印度贝与三亚贝混合选育群体的生长观察表明，杂交群体的生长速度确实明显高于亲本种群。这些结果与BOPPENMAIER等^[25]的观点相符，也为合浦珠母贝不同地理种群杂交育种以利用杂种优势提供了理论依据。