Determination of tetrodotoxin in Nassarius by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with multi-walled carbon nanotubes purification
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摘要: 建立了多壁碳纳米管(MWCNTs)固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定织纹螺中河豚毒素(TTX)的方法，样品用1%乙酸甲醇溶液提取，调节pH至8.5~9.0后，采用碳纳米管净化处理后上机测定。以乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相，经Amide柱梯度洗脱，以电喷雾离子源正离子模式，多反应监测(MRM)测定，外标法定量。在0.3~50 ng·mL–1质量浓度范围内，相关系数(R)大于0.999，加标回收率为83.7%~91.4%，相对标准偏差为2.3%~8.6%，检测限和定量限分别为0.3 μg·kg–1和1 μg·kg–1。该方法适用于织纹螺中TTX的检测。
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关键词:
- 河豚毒素 /
- 织纹螺 /
- 多壁碳纳米管 /
- 液相色谱-质谱联用检测法 /
- 固相萃取
Abstract: A sensitive and reliable method for determination of tetrodotoxin (TTX) in Nassarius was established using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The sample was extracted by 1% acetic acid-methanol solution, then the pH value was adjusted to 8.5−9.0. After purification with multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs), the sample was subjected to an analytical procedure. The mobile phase containing acetonitrile and 0.1% formic acid solution with a linear gradient elution was utilized to separate TTX on an Amide column. The quantitative analysis was carried out with an external standard method in the multiple reaction monitoring mode using positive electrospray ionization. The calibration curve for TTX was linear (R>0.999) from 0.3 ng·mL–1 to 50 ng·mL–1. The recoveries were 83.7%−91.4% with the RSDs of 2.3%−8.6%. The limits of detection and quantification were 0.3 μg·kg–1 and 1 μg·kg–1, respectively. This method is suitable for determination of TTX in Nassarius.-
Keywords:
- tetrodotoxin /
- Nassarius /
- multi-walled carbon nanotubes /
- LC-MS/MS /
- solid phase extraction
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附着生物广泛分布在海洋、港湾、河口以及江河湖泊和水库中的船底、管道和水中一切设施的表面上。国内外对海洋附着生物的生态已做很多调查研究工作[1-6]，而对人工鱼礁上附着生物的研究报道较少。李勇等[7]对珠江口竹洲人工鱼礁及附近天然岛礁上附着生物群落进行调查，调查共记录附着生物68种，其中优势种为网纹藤壶(Balanus reticulatus)、华美盘管虫(Hydroides elegans)和马氏珠母贝(Pinctada martensi)，但附着生物的季节变化研究鲜见报道。
大亚湾鱼礁区地处亚热带，位于珠江口东侧，面临南海，三面为山地丘陵环抱，是一个山地溺谷型半封闭海湾，水深5~21 m，平均深度11.5 m，透明度大(1.0~18 m)，年温度变化范围为17.60~29.40 ℃，盐度变化范围为29.57~33.51，鱼礁上一年四季都有附着生物繁殖附着。附着生物是人工鱼礁集鱼、诱鱼最主要的生物环境因子之一，又是礁区渔业对象的主要饵料生物，附着生物的种类组成和数量变化直接影响人工鱼礁的生态效应。因此，开展对人工鱼礁上附着生物季节变化规律的研究非常重要，可为人工鱼礁附着生物的进一步研究提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料
2008年5月、7月、10月和12月，分4个季度在广东省大亚湾深圳市杨梅坑人工鱼礁区，对2007年4月投放的表面粗糙的正方体混凝土鱼礁和表面粗糙的三角锥形铁质鱼礁，进行附着生物潜水原位采样(图 1)。2个礁体所在位置相距约22 m，水深约为12 m，周围环境因子基本一致。采样和分析方法均按《海洋调查规范》[8]进行。对礁体上层(水深8 m)、中层(水深9.5 m)和下层(水深11 m)3个水层进行潜水定量采样，每层分别在迎流面和背流面位置各采集3个样品，每个采样位置的采样面积为10 cm×10 cm。样品加入质量分数为5%的福尔马林溶液固定带回实验室进行鉴定分析。
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图 1 混凝土鱼礁和铁质鱼礁附着生物采样位置示意图Figure 1. Sampling stations for biofouling communities on concrete and steel reefs1.2 分析方法
附着生物数量丰度以每平方米出现的个体数表示(个· m-2)，生物量以每平方米生物的质量表示(g · m-2)，同时计算丰富度指数(R)、多样性指数(H′)、均匀度指数(E)和优势度(Y)。
Shannon-Weaner多样性指数公式为：$ H^{\prime}=-\sum_{i=1}^S$Pilog2Pi
Pielou均匀度指数公式为：J=H′/log2S
丰富度指数公式为：$ D=\frac{(S-1)}{\ln N}$
优势种的优势度公式为：$ Y=\frac{n_i}{N} f_i$
根据种类优势度公式计算各种生物的优势度，将Y＞0.006的生物定为优势种。
上述公式中，ni为第i种的数量，N为采集样品中的所有种类总个体数；S为采集样品中的种类总数；P为第i种的个体数与样品中的总个体数的比值(ni/N)，f为该种在各样品中出现的频率。
1.3 统计分析
使用SPSS 16.0进行统计分析。单因素方差分析(ANOVA)使用最小显著差异法(LSD)检验不同季节附着生物群落种类的Y、H′、E和R的统计显著性差异(P < 0.05)，用T-test检验2个样本之间的显著性差异(P < 0.05)。
2. 结果
2.1 附着生物种类组成及生物量的季节变化
春、夏、秋、冬四季调查，混凝土礁体和铁质礁体共鉴定出附着生物116种(表 1)。其中海绵动物2种、腔肠动物9种、扁形动物2种、棘头动物1种、环节动物23种、软体动物57种、节肢动物12种、棘皮动物4种、苔藓虫2种、被囊动物4种。软体动物占鉴定生物种类总数的49%，环节动物占20%。按个体数量计算，三角藤壶(B.trigonus)占据绝对优势，而真蛇尾(Ophiura sp.)、强壮板钩虾(Stenothoe sp.)、乳突皮海鞘(Molgula manhattensis)、渤海格鳞虫(Gattyana pohailnsis)、叶须虫(Phyllodoce laminosa)、须鳃虫(Cirriformia tentaculata)和背裂虫(Opisthosyllis brunnea)是群落的优势种，翡翠贻贝(Perna viridis)、锯额瓷蟹(Pisidia serratifrons)、纹斑棱蛤(Trapezium liratum)等是群落的重要组成部分。
表 1 大亚湾混凝土鱼礁和铁质鱼礁上附着生物种类名录Table 1. Species of fouling organisms on concrete and steel reefs, Daya Bay种类
species混凝土礁体concrete reef 铁制礁体steel reef 春
spring夏
summer秋
autumn冬
winter春
spring夏
summer秋
autumn冬
winter海绵动物门 Spongla 岡田樽海绵 Sycon okadai + + 荔枝海绵 Tethya aurantium ++ 腔肠动物门 Coelenterata 水螅纲 Hydrozoa 筒状美螅 C.cylindrica + 总状真枝螅 Eudendrium racemosum ++ 双叉薮枝螅 Obelia dichotoma + 珊瑚纲 Anthozoa 石花虫 Telesto sp. + 海鸡头 Nephthea sp. + 侧花海葵 Anthopleura sp. + + ++ + + ++ + + 桂山厚丛柳珊瑚 Hicksonella guishanensis + 滑鞭柳珊瑚 Ellisella laevis + 刺鸡头 Dendronephthya sp. + + + 扁形动物门 Platyhelmintnes 外伪角涡虫 Pseudoceros exoptatus + + + + + + 柄涡虫Stylochus sp. + + + + 棘头动物门Acanthocephala 棘头虫Acanthocephalus + + + + + 环节动物门Annelida 多毛纲Polychaeta 华美盘管虫Semiserpula nanhaiensis ++ + + ++ ++ + 长须沙蚕N.loingior + + + + + + + 雾海鳞虫Halosydna nebulosa + + + ++ + 旋鳃虫Spirobranchus giganteus ++ + ++ ++ + ++ + ++ 须鳃虫C.tentaculata ++ ++ ++ ++ + + + 乳蛰虫Thelepus sp. ++ ++ + ++ ++ + 棒手拟隐鳞虫Hermadionella truncata ++ ++ + + + + 异足索沙蚕Lumbrineris heteropoda + + + ++ + + + 东海刺沙蚕N.donghaiensis + 珠须肌沙蚕Eunice antennata + + + 伪豆维虫Dorvillea pseudorubrovittata + + + + + + 麦缨虫Megalomma vesioulosum + 管缨虫Chone sp. ++ + + + + + 丝缨虫Hypsicomus phaeotaenia ++ + ++ + + ++ + + 多齿沙蚕N.multignatha ++ ++ ++ + ++ ++ ++ + 叶须虫P.laminosa ++ ++ + + ++ ++ + + 玛叶须虫P.malmgreni + + 渤海格鳞虫G.pohailnsis ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ 亚洲哈鳞虫Harmothoe asiatica ++ ++ + ++ ++ + 背裂虫O.brunnea ++ ++ ++ + + ++ ++ + 尖锥虫Scoloplos armiger + 领襟松虫Lysidice collaris + 紫臭海蛹T.pupa + 软体动物门Mollusca 双神经纲Amphineura 网纹鬃毛石鳖Mopalia retifera + + + 腹足纲Gastropoda 史氏背尖贝Notoaomea schrencci + + + + + + 粗糙真蹄螺Euchelus scaber + + + ++ 梯螺Epitonium sp. + 黄口荔枝螺Thais luteostoma + + + + 蛎敌荔枝螺T.gradate + + + + 大沼螺Parafossarulus eximius + 三列笋螺Terebra triseriata + + 红带织纹螺Nassarius succinctus + 黑口滨螺Littorina malanostoma + 西格织纹螺N.siquinjorensis + 愚螺Amathina tricarinata + + + + + 节织纹螺Nassatius hepaticus + + + 珠带拟蟹守螺Cerithidea cingulata + + + ++ + ++ 美丽唇齿螺Engina pulchra + + + + + + 湖北钉螺Oncomelamia hupensis + + + + + 硬结原爱神螺Proterato callosa + + 疣荔枝螺T.clavigera + 杂色笔螺Mitra litterata + + + 丽核螺Pyrene bella ++ + + ++ ++ 瓣鳃纲Lamellibranhia 布纹蚶Barbation decussata + + 泥蚶Tegillarca granosa + + 双纹须蚶Barbatia bistrigata + + + + + + ++ 斑顶须蚶B.signata + + + + 翡翠贻贝P.viridis + + ++ ++ + ++ + 合浦珠母贝P.fucata martensi + 曲线索贻贝Hormomya mutabilis ++ ++ + 海月Placuma placenta + ++ + + + 翘鳞蛤Irus irus + + + + 变化短齿蛤Brachidontes variabilis ++ + ++ + 敦氏猿头蛤Chama dunkeri lischke + ++ ++ ++ + ++ ++ ++ 翘鳞猿头蛤C.lazarus linnarus + 草莓海菊蛤Sprnolylus fragum + 纹斑棱蛤T.liratum + + ++ + + + ++ + 斜纹心蛤Cardita leana + 铃蛤Jouannetia cumingi + 青蛤Cyclina sinensis + 文蛤M.meretrix + + + + 毛偏顶蛤Modiolus barbatus ++ ++ + + ++ + 角偏顶蛤M.metcalfei + 短偏顶蛤M.flavidus + 偏顶蛤M.elongatus + 方形蚶蛤Isognomon nucleus + + + + 细肋肌蛤Musculus mirandus ++ ++ + + + + + + 栉孔扇贝Chlamys sp. + + 华贵栉孔扇贝C.nobilis + 贻贝Mytilus edulis + + 光石蛏Lithophaga teres + + ++ + + + ++ 近江牡蛎O.rivularis + + 褶牡蛎O.plicatula + + + + + + + + 棘刺牡蛎O.echinata + + + + + + 马特海笋Martesia striata + + + + 宽壳全海笋B.dilatata + 嫁䗩 Cellana toreuma + 曲线索贻贝H.mutabilis + 西施舌Coelomaotra antiquata + 节肢动物门Arthropoda 蔓足亚纲Cirripedia +++ +++ 三角藤壶B.trigonus + +++ +++ +++ + +++ +++ +++ 红巨藤壶M.rosa ++ ++ ++ 端足类Amphipoda 中华蜾赢蜚Corophium sinense + + + 强壮板钩虾Stenothoe sp. +++ ++ +++ +++ ++ ++ 日本片钩虾Elasmopus japonicus ++ 尖额麦杆虫C.penantis + 大螯蜚Jassa sp. ++ ++ ++ ++ + 十足类Decapoda 鼓虾Alpheus sp. + + 东海铠甲虾Galathea balssi ++ + ++ + 锯额瓷蟹P.serratifrons ++ + + + ++ + + 光辉圆扇蟹Sphaeroxius nitidus + 双角互敬蟹Hyastenus diacanthus + 棘皮动物门Echinodermata 真蛇尾Ophiura sp. ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ 近辐蛇尾Ophiactis affinis ++ 细雕刻肋海胆Temnotliurus toreumaticus ++ + + + ++ + + 海齿花Comanthus + 苔藓虫Bryozoa 宽松苔虫Caberea lata + + 多室草苔虫Bugula neritina + 被囊动物Ascidiacea 皱瘤海鞘S.plicata + + + ++ 冠瘤海鞘Styela canopus ++ ++ ++ + ++ ++ 乳突皮海鞘M.manhattensis ++ ++ ++ + ++ ++ ++ + 悉尼海鞘A.sydneiensis 注：+.＜100个· m-2；+ +.＜1 000个· m-2；+ + +.＜10 000个· m-2
Note: +.＜100 ind · m-2；+ +.＜1 000 ind · m-2；+ + +.＜10 000 ind · m-22.1.1 混凝土礁体
混凝土礁体附着生物由春季55种、夏季56种、秋季57种和冬季38种附着生物组成，附着生物群落的种类组成在春、夏、秋3个季节变化不明显，但是冬季附着生物组成数明显下降。在所有季节中褶牡蛎为附着生物群落中占据优势地位的种类，其生物量在春、夏、秋和冬季分别占附着生物群落总生物量的33.48%、41.65%、34.41%和51.71%。三角藤壶、褶牡蛎和翡翠贻贝在4季中生物量处于优势地位(表 2)。
表 2 大亚湾混凝土鱼礁和铁质鱼礁上附着生物群落生物量Table 2. Biomass of biofouling communities on concrete and steel reefs in Daya Bayg·m-2 种类
species混凝土礁体concrete reef 铁制礁体steel reef 春
spring夏
summer秋
autumn冬
winter春
spring夏
summer秋
autumn冬
winter三角藤壶B.trigonus 12 027.33 5 257.67 7 983.67 6 726.00 20 503.33 6 990.00 4 261.67 175 092.67 褶牡蛎O.plicatula 12 329.00 9 487.33 13 389.33 21 132.33 4.67 17 610.67 1 288.67 4 496.67 翡翠贻贝P.viridis 3 448.00 1 439.33 8 463.00 9 125.33 10.35 4 373.33 13 541.33 2 094.00 三角藤壶在春季生长处于高峰期，从春季至夏季生物量由12 027.33 g · m-2降到5 257.67 g ·m-2；褶牡蛎在冬季生长处于高峰期，从冬季至夏季其生物量由21 132.33 g · m-2降到9 487.33 g· m-2；翡翠贻贝也是在冬季生长处于旺盛期，从冬季至夏季其生物量由9 125.33 g · m-2降到1 439.33 g · m-2。
2.1.2 铁质礁体
铁质礁体附着生物由春季群落68种、夏季53种、秋季48种和冬季40种附着生物组成，附着生物群落的种类组成存在较大季节差异。其中，春、夏、秋季三角藤壶、褶牡蛎、翡翠贻贝分别占据绝对优势，其生物量分别占附着生物群落总生物量的63.93%、62.43%、44.96%；而冬季三角藤壶再次占据绝对优势，其生物量占附着生物群落总生物量的92.33%。三角藤壶、褶牡蛎和翡翠贻贝在四季中生物量处于优势地位(表 2)。
三角藤壶在春季处于生长旺季，这一变化趋势与在混凝土礁体上一致，在铁质礁体上三角藤壶冬季生物量仍较高，而其最低生物量出现在秋季；而褶牡蛎在铁质礁体上的生长情况和在混凝土礁体上的生长情况相反，在铁质礁体上其夏季处于生长旺季，而在混凝土礁体上其冬季处于生长旺季；翡翠贻贝秋季生长处于高峰期，到夏季生物量最低，低至10.35 g · m-2，其变化趋势与混凝土礁体基本一致。
2.2 附着生物群落优势度的季节变化
不同季节、不同礁体附着生物的Y值见表 3。对各季节附着生物群落Y排序发现，同一礁体不同季节以及不同礁体附着生物群落种类的优势度序列差异不显著。然而，在春、夏、秋和冬季，三角藤壶在混凝土和铁质礁体上均占据绝对优势，4个季节附着生物群落中Y从高到低的物种依次如下。
表 3 大亚湾混凝土鱼礁和铁质鱼礁上附着生物群落优势种及其优势度Table 3. Dominant species and dominance of biofouling communities on concrete and steel reefs in Daya Bay优势种
dominant species优势度(Y) dominance 混凝土礁体concrete reef 铁制礁体steel reef 春
spring夏
summer秋
autumn冬
winter春
spring夏
summer秋
autumn冬
winter三角藤壶B.trigonus 0.198 3 0.118 4 0.134 4 0.106 1 0.289 9 0.152 6 0.081 9 0.080 5 真蛇尾Ophiura sp. 0.006 8 0.006 8 0.011 1 0.006 8 0.007 4 强壮板钩虾Stenothoe sp. 0.019 3 0.008 5 0.013 9 0.041 2 乳突皮海鞘M.manhattensis 0.006 4 0.006 2 0.010 4 渤海格鳞虫G.pohailnsis 0.007 6 0.006 7 0.006 6 叶须虫P.laminosa 0.006 6 0.008 1 须鳃虫C.tentaculata 0.006 2 0.010 3 背裂虫O.brunnea 0.008 2 0.010 8 翡翠贻贝P.viridis 0.006 6 锯额瓷蟹P.serratifrons 0.006 1 纹斑棱蛤T.liratum 0.008 7 红巨藤壶M.rosa 0.007 4 乳蛰虫Thelepus sp. 0.007 2 冠瘤海鞘S.canopus 0.007 6 2.2.1 混凝土礁体
春季：三角藤壶﹥强壮板钩虾﹥红巨藤壶﹥乳蛰虫﹥真蛇尾﹥叶须虫，6种的重要值之和占群落的77.77%，三角藤壶为群落中的绝对优势种；夏季：三角藤壶﹥背裂虫﹥渤海格鳞虫﹥真蛇尾﹥须鳃虫，5种的重要值之和占群落的71.73%，三角藤壶也为群落中的绝对优势种；秋季：三角藤壶﹥强壮板钩虾﹥冠瘤海鞘﹥翡翠贻贝﹥乳突皮海鞘，5种的重要值之和占群落的73.45%，三角藤壶仍为第一优势种；冬季：三角藤壶﹥强壮板钩虾﹥须鳃虫，3种的重要值之和占群落的73.82%，三角藤壶仍为第一优势种。
混凝土礁体三角藤壶在春、夏、秋和冬季始终占据绝对优势地位；在春、秋和冬季，强壮板钩虾处于第二位的优势地位；而在夏季，背裂虫占据第二位的优势地位；红巨藤壶仅在春季群落中出现，且成为主要优势种；真蛇尾在春季和夏季为群落的主要优势种，而在秋季和冬季则成为优势度很低的伴生种；须鳃虫在夏季和冬季为群落的主要优势种，而在春季和秋季则成为伴生种；乳蛰虫和叶须虫仅在春季成为优势种；渤海格鳞虫仅在夏季成为优势种；冠瘤海鞘、翡翠贻贝和乳突皮海鞘仅在秋季成为优势种。
2.2.2 铁质礁体
春季：三角藤壶﹥强壮板钩虾﹥真蛇尾﹥渤海格鳞虫﹥乳突皮海鞘﹥锯额瓷蟹，6种的重要值之和占群落的88.55%，三角藤壶为群落中的绝对优势种；夏季：三角藤壶﹥背裂虫﹥叶须虫﹥真蛇尾﹥渤海格鳞虫，5种的重要值之和占群落的77.66%，三角藤壶为群落中的绝对优势种；秋季：三角藤壶﹥乳突皮海鞘﹥纹斑棱蛤，3种的重要值之和占群落的71.33%，三角藤壶为第一优势种；冬季：三角藤壶﹥真蛇尾，2种的重要值之和占群落的70.04%，三角藤壶为第一优势种。
铁质礁体三角藤壶在春、夏、秋和冬季始终占据绝对优势地位；真蛇尾在春、夏和冬季为群落的主要优势种，在秋季则成为伴生种；乳突皮海鞘在春季和秋季所处的优势地位明显高于夏季和冬季；渤海格鳞虫在春季和夏季的优势地位基本一致，而在秋季和冬季则成为伴生种；强壮板钩虾和锯额瓷蟹仅在春季成为优势种，在夏、秋和冬季则成为伴生种或偶见种；背裂虫和叶须虫在夏季成为优势种；纹斑棱蛤则仅在秋季成为优势成分，而在其他季节仅作为伴生种或偶见种存在。
2.3 附着生物群落多样性的季节变化
混凝土礁体和铁质礁体上附着生物群落多样性，即物种R、H′和E的季节变化见图 2。混凝土礁体群落的物种R以秋季群落最高(4.12)，春季次之(3.94)，夏季再次之(3.91)，冬季最低(2.67)，冬季R显著低于其他3个季节。群落的物种H′和E的变化趋势趋同，即夏季表现最高，分别为0.244和0.063，秋季次之，分别为0.243和0.042，而H′春季比冬季高，分别为0.236和0.228；E春季和冬季基本一致，分别为0.041和0.039，然而，H′和E 4个季节不存在显著差异。
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图 2 人工鱼礁混凝土礁体和铁质礁体附着生物群落多样性指数的季节变化a.混凝土礁体；b.铁质礁体Figure 2. Seasonal variation of diversity indexes of biofouling communities on concrete and steel reefsa.concrete reef; b.steel reef铁质礁体群落的物种R在春、夏、冬和秋季依次降低，分别为3.78、3.65、3.44和3.22。群落的物种H′在春季(0.223)表现最低，在冬季(0.236)表现最高。然而，R、H′和E 4个季节不存在显著差异。
混凝土礁体和铁质礁体相比，附着生物群落的R、H′和E之间不存在显著性差异。
3. 讨论
3.1 人工鱼礁附着生物种类成分和其生物量的季节变化
混凝土鱼礁和铁质鱼礁全年各月都有生物附着，各种生物在各季的附着有断续现象，在附着生物附着期的3种类型4种形式中[8]，人工鱼礁隶属于第二种类型，即全年各季附着，但各季的附着量不一样。
不同类型的附着期主要是由于生物本身内在的繁殖周期不同所致，而这种周期变化与环境的水温关系最大。三角藤壶、真蛇尾、强壮板钩虾、乳突皮海鞘、渤海格鳞虫、叶须虫等种类全年都可以附着，但各季的附着量不一样。这与前人的研究结果即附着生物的繁殖、附着季节与温度具有相关性一致[9-12]。
该试验由于条件有限，仅对混凝土鱼礁和铁质鱼礁的附着生物情况进行了调查。结果表明，2种材料礁体上出现的附着生物种类主要有三角藤壶、真蛇尾、强壮板钩虾、乳突皮海鞘、渤海格鳞虫、叶须虫、须鳃虫、背裂虫、翡翠贻贝、锯额瓷蟹、纹斑棱蛤、红巨藤壶、乳蛰虫、冠瘤海鞘等。大量研究表明人工鱼礁上附着的生物主要有藤壶、多毛类和双壳类等[13-16]，该研究结果与以往研究结果一致。2种材料在附着生物种类组成以及生物量上具有相似性，但也具有一定的季节差异。如三角藤壶在混凝土礁体和铁质礁体上均在春季处于生长旺季，而褶牡蛎在铁质礁体上的生长情况和在混凝土礁体上的生长情况正好相反，在铁质礁体上其夏季处于生长旺季。这一现象主要是因为每种附着生物都有自己的适温范围和分布区域，这是由各自适宜生存的环境条件所决定。SANDROCK等[17]报道了人工鱼礁上的附着生物存在明显的季节变化，季节性在附着初期阶段是一个至关重要的决定因素。冬季附着生物种类和生物量少，秋季和夏季附着生物种类和生物量增加。
3.2 附着生物群落种群优势度的季节变化
虽然在各季节中附着生物群落的主要优势种有相同之处，如三角藤壶在春、夏、秋和冬季始终占据绝对优势地位，但其重要值却存在一定的差异，说明它在群落的功能地位有一定的变化；同样，许多种类在不同季节均有出现，但它们在群落中的功能地位亦存在很大的差异，如混凝土礁体上真蛇尾在春季和夏季为群落的主要优势种，而在秋季和冬季则成为优势度很低的伴生种。物种优势度在不同季节的变化说明其在群落中的功能和地位的改变。然而，该研究调查的结果表明，附着生物群落尚未形成显著的优势度变化。该研究结果与以往研究所认为的不同季节的优势种存在区别、同时各优势种的附着量随着季节的变化而上下波动[18-21]的结论一致。
3.3 附着生物群落多样性的季节变化
种类多样性是一种群落生态组织水平独特的可测定的生物学特征。种类R、H′和E都是种类多样性的描述指数，它们从不同侧面度量群落的物种及其数量组合的关系，目前已广泛应用于群落时空变化的分析研究。群落在种类组成、结构、功能和动态上产生的分化，都与群落的多样性密切相关，并在其多样性指数上得以表现[22-23]。混凝土礁体上附着生物群落多样性季节变化不显著，而铁质礁体上附着生物群落R冬季显著低于春、夏、秋季，H′和E没有明显的季节变化。
从图2可以看出，混凝土礁体附着生物种类H′夏、秋两季较高，这与多数种类为高温暖水种有关。夏季和秋季，随着种类的增加，E也相应较高，表明所增加的种类，其生物量都较大，使得各物种的生物量比较均匀，优势种的数量仍占有明显的优势。群落种类组成有较高的多样性，表明群落在该段时间过程中维持物种间及其数量关系的相互组合的能力以及群落的抗变能力强。铁质礁体附着生物种类R春季最高，其H′和E却最低；而在冬季附着生物R、H′和E均较高，表明附着生物群落冬季也较稳定。
混凝土礁体和铁质礁体相比，附着生物群落的R、H′和E没有显著的差异，说明这2种礁体材料对附着生物群落尚未产生影响。目前，对不同礁体材料上附着生物群落的研究较少，因此该研究没有进行比较。
该研究分析了人工鱼礁(混凝土鱼礁和铁质鱼礁)附着生物群落的季节变化，但人工鱼礁区的环境、附着生物附着季节和演替时间长短、优势种等均是影响群落种类组成的重要因素，而其中彼此的相关性、变化规律和影响程度则有待更为深入的研究和探讨。
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图 1 不同上样液的pH对回收率的影响
Figure 1. Influence of pH on recovery of tetrodotoxin in sample solution
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图 2 空白样品和10 μg·kg–1加标阴性样品经碳纳米管净化后的MRM图谱
a. 空白样品；b. 加标样品
Figure 2. MRM chromatograms of 10 μg·kg–1 spiked sample cleaned up by carbon nanotubes
a. blank sample; b. spiked sample
表 1 梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution condition
t/min 流动相A/%
mobile phase A流动相B/%
mobile phase B0 95 5 1.0 40 60 3.0 40 60 3.2 95 5 5.0 95 5 
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表 2 TTX的多反应监测条件
Table 2 Conditions of multiple reaction monitoring for tetrodotoxin
分析物
analyte母离子/(m/z)
parent ion子离子/(m/z)
daughter ion锥孔电压/V
cone voltage碰撞能量/eV
collision energyTTX 320.1 161.9 35 35 302.0* 35 20 注：*. 定量离子 Note: *. quantitative ion
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表 3 样品加标回收率与相对标准偏差
Table 3 Recovery of standard addition and relative standard deviation for tetrodotoxin
n=5 添加水平/μg·kg–1
added amount回收率/%
recovery相对标准偏差/%
RSD1 91.4 2.3 10 83.7 3.4 100 84.8 8.6
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