Molecular characteristics and expression analysis of AQP1a from Trachinotus ovatus under acute salinity stress
-
摘要: 水通道蛋白(aquaporin，AQPs)是由内在膜蛋白组成的超家族，介导水分子的跨膜运输，对渗透压调节具有重要作用。为研究AQP1a在急性盐度胁迫下对卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus)的渗透压调节作用，该研究获得AQP1a基因。基因全长1 078 bp，开放阅读框786 bp，编码261个氨基酸，具有MIP家族特有序列(HINPAVTLG)和2个天冬酰胺−脯氨酸−丙氨酸蛋白基序。qRT-PCR结果显示，AQP1a在11个被测组织中均有表达，在性腺中的表达量最高，其次是鳃和肠，在肌肉中表达量最低。在急性盐度胁迫下，当转入淡水时，AQP1a在鳃的表达量在第4小时显著上升，而在肾和肠中没有显著变化；当转入盐度10和20海水时，鳃中AQP1a的表达量在第2和第4小时显著升高，然后下降趋于稳定；转入盐度10海水时，肠中AQP1a的表达量均上升，肾中AQP1a的表达量呈先上升后下降趋势；转入盐度20海水时，肠中AQP1a的表达量仅在第4、第8和第48小时显著上升，肾中AQP1a的表达量在第12小时达到最大；转入盐度40海水中，鳃中AQP1a的表达量明显下降，相反，在肾和肠中AQP1a的表达量均明显上调。这些结果反映了AQP1a在不同组织中的功能特异性，证实了AQP1a在卵形鲳鲹盐度适应中起重要作用。Abstract: Aquaporin, a superfamily of internal membrane proteins that mediate transmembrane transport of water molecules, plays an important role in osmotic adjustment. AQP1a gene was obtained in order to study the role of AQP1a in osmoregulation of Trachinotus ovatus under acute salinity stress. The sequence of AQP1a gene was 1 078 bp with an open reading frame of 786 bp encoding 261 amino acids. The structural analysis shows that it has the structural characteristics of MIP family-specific sequence (HINPAVTLG) and two asparagine-proline-alanine (NPA) motifs. The qRT-PCR results show that AQP1a was distributed in the 11 tested tissues, highest in gonads and then in gill, intestine and liver, lowest in muscle. Under acute salinity stress, after being transfered to fresh water, the expression of AQP1a in gill increased at 4th hour, while there was no significant change in the expression in kidney and intestine. After being transfered to 10‰ and 20‰ salinity seawater, the expression of AQP1a in gill increased significantly at 2nd and 4th hour, and then decreased gradually. When being transferred to 10‰ salinity seawater, the expression of AQP1a in intestine increased. In kidney, the expression of AQP1a first increased and then decreased. When being transferred to 20‰ salinity seawater, the expression of AQP1a in intestine only increased significantly at 4th, 8th and 48th hour. In kidney, the expression of AQP1a reached the maximum at 12th hour. In 40‰ salinity seawater, the expression of AQP1a in gill decreased significantly. On the contrary, the expression of AQP1a in kidney and intestine were significantly up-regulated. The results reveal that the specificity of AQP1a functions in different tissues and plays an important role in T.ovatus salinity adaptation.
-
Keywords:
- Trachinotus ovatus /
- aquaporin /
- osmoregulation /
- acute salinity stress
-
仿刺参(Apostichopus japonicus)，俗称海参、刺参，属棘皮动物门、海参纲、楯手目、刺参科、仿刺参属的种类[1]。在中国和马来西亚，刺参被认为是有很好滋补效果的补品，对高血压、哮喘病、风湿、阳痿、便秘等疾病有治疗作用[2-4]。刺参市场需求量增大，掀起了刺参养殖的热潮，但养殖过程中使用的饲料、各种抗菌药和消毒剂也给环境带来了不同程度的污染[5-6]。铜盐一般作为消毒剂用于消除池塘、水田、水渠和河湖中的绿藻污染[7]，铜(Cu)也是水产动物必需的微量元素之一[8]，对机体的生理功能和生长发育起着十分重要的作用。然而，当水体中的铜离子(Cu2+)超出一定的范围，易引起Cu在生物机体内特别是肝脏的大量积蓄[9-10]，各国研究学者一般从Cu对水生动物细胞膜毒性和组织质量分数变化及分布规律等方面进行研究[8, 11-12]。BUNDRIDGE[13]发现海参(Pentacta anceps)和绿刺参(Stichopus chloronotus)消化道能分泌一种消化酶消化饲料中的化合态铜，使其成为单体铜并积累到体壁组织中。高浓度Cu将变成一种抑制物或毒性物质，且在生态系统中不被分解或消除[14-15]。该研究以硫酸铜(CuSO4)和氯化铜(CuCl2)2种异源铜盐对幼参进行攻毒试验，确定2种不同来源的Cu2+对幼参的半致死质量浓度(LC50)和安全质量浓度(SC)，观察两者对幼参肠道组织学影响，初步探讨刺参Cu2+中毒机理，为制定不同铜盐作为消毒剂或兽药使用标准提供数据支持，也可用于刺参养殖环境评价学研究。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
仿刺参幼参由国家海洋科研基地内山东省海洋生物研究院海水良种繁育中心提供，所有幼参为同一批孵化，挑取体质量为3~5 g的健康个体暂养7 d，暂养期间每天按参总质量3%辅以3倍干海泥(水分7.90%)投喂商品饲料(YSB)，定时吸污更换海水，试验前1 d不投饵。
1.2 试验方法
1.2.1 试验的理化条件
在山东省海洋生物研究院中试实验室进行；水温(16±1)℃，溶解氧质量浓度即时测定值≥6 mg · L-1，24 h不间断充氧；pH为7.96~8.20，试验过程中每天8: 00和15: 00测定2次pH；盐度31.18±0.34；海水来自青岛团岛海域，经沙滤池过滤，Cu2+的本底质量浓度为0.001 mg · L-1，符合GB 11607-89中铜质量浓度＜0.10 mg · L-1的限量。
1.2.2 急性毒性试验
采用文献[16]~[18]的方法，根据预试验给出的CuSO4和CuCl2(CuC12 · 2H2O和CuSO4 · 5H2O为分析纯)100%致死的最低浓度与0%致死的最大浓度结果，按浓度对数的等差比例设5个浓度组，1个对照组，设有3个平行组，每组投放平均体质量在(3.88±0.32)g的刺参10只进行攻毒试验。采用静水法，试验期间不投饵，观察记录24 h、48 h、72 h和96 h各组刺参的死亡数，随时捞出死亡个体(取体壁匀浆-18 ℃保存，用于刺参体内Cu2+质量分数测定)或其他污物(主要指内脏)。结合文献[19]和试验观察，刺参死亡判断标准为萎缩，翻吻破肚，排脏，部分或全身发白、发蓝，溃烂，最后溶化。
1.2.3 刺参后肠组织学观察试验
根据1.2.2的结果选取CuSO4/CuCl2急性毒性试验中间浓度进行试验，设对照组1组，每组10只刺参，攻毒24 h后活体解剖刺参。取后肠固定于波恩氏(Bioun′s)溶液中，固定24 h后经冲洗、系列梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、做连续切片(厚度为7 μm)苏木精-伊红染色、中性树胶封片，显微镜下观察其组织结构，数码显微照相。
1.2.4 刺参体内Cu2+质量分数测定
参照GB/T 5009.13-2003食品中铜的测定。
1.3 数据处理
使用SPSS 13.0数理统计软件计算求出24 h、48 h、72 h和96 h的LC50及各自的95%置信区间，采用单因素方差分析，显著水平为P＜0.05时采用Tukey检验进行多重比较，试验数据以平均值±标准误差(X±SD)表示。
安全质量浓度计算公式[20]：
$$ \mathrm{SC}=\frac{\mathrm{LC}_{50}^{48} \times 0.3}{\frac{\mathrm{LC}_{50}^{24\;\;\;\;{2}}}{\mathrm{LC}_{50}^{48}}} $$ (1) 式中LC5024为生物24 h LC50 (mg · L-1)；LC5048为生物48 h LC50 (mg · L-1)。
$$ \text { 富集系数 }{ }^{[21-22]}:\mathrm{ \quad B C F=\frac{C_w}{C_0}} $$ (2) 式中Cw为幼参体内Cu2+质量浓度(mg · L-1)；C0为暴露质量浓度(mg · L-1)。
2. 结果与分析
2.1 异源铜盐攻毒刺参幼参后的中毒症状
使用CuSO4和CuCl2对刺参幼参攻毒后，幼参出现了不同程度的中毒现象，即根据浓度不同化皮程度也不同，部分刺参出现摇头现象，继而逐渐死亡，但2组均没有吐肠现象。ρCu2+CuSO4>0.25 mg · L-1攻毒24 h后全部刺参沉入箱底，刺激无反应，化皮率100%；ρCu2+CuSO4>0.10 mg · L-1攻毒24 h后大部分刺参活动迟缓，管足不能附壁，沉入箱底，有3只幼参出现化皮现象，96 h后全部10只幼参完全化皮，刺激后反应微弱或无反应；ρCu2+CuCl2>0.075 mg · L-1攻毒24 h后即有2只幼参出现化皮，48 h后10只幼参全部出现化皮现象且刺激无反应；ρCu2+CuCl2>0.19 mg · L-1攻毒24 h后受试幼参全部化皮，溃烂。由此可以初步推断CuCl2对幼参的急性毒性大于CuSO4，这可能是实际生产中通常采用CuSO4溶液来灭藻杀菌而不采用CuCl2的原因。
2.2 CuSO4/CuCl2对幼参后肠毒性组织学观察结果
Cu2+暴露液质量浓度为0.06 mg · L-1时，幼参经过24 h暴露后体表有溃烂白点，肠道组织切片结果见图 1。对照组健康刺参肠道由内到外分别为肠上皮、单层粘膜层、粘膜下层、较窄的纵层、较宽的环层、浆膜层构成(图 1-a)，对照组健康刺参的血小窦通过间皮细胞连接(图 1-b)。图 1-c~e分别显示的CuCl2攻毒刺参后肠40倍放大的图片，通过组织切片观察，CuCl2和CuSO4 2组刺参的血小窦均已脱落成游离状态，图 1-c中箭头所指部位为刺参后肠粘膜上层细胞皱襞脱落，刺参后肠粘膜层上皮细胞死亡分解，血窦内皮与粘膜层脱落(图 1-d)，粘膜下层结缔层与肌肉层分离，疏松结缔层内细胞已经死亡分解(图 1-e)；图 1-f~h分别显示的CuSO4攻毒刺参后肠400倍放大图片，其中刺参肠道上皮细胞死亡(图 1-f)，生发层有大量嗜碱性细胞生成，显示的是刺参肠道上皮细胞正在分解(图 1-g)，粘膜上层与结缔层正在分离，结缔层生有大量嗜酸性细胞(图 1-h)。通过组织切片的解析可以看出，CuSO4和CuCl2试验组的刺参肠道均有不同程度的损伤，表现为刺参肠道粘膜上层脱离粘膜下层结缔组织，结缔组织中出现许多吞噬变形细胞用于解毒。同一攻毒时间后的CuCl2攻毒组的刺参肠道粘膜下层结缔层与肌肉层分离(图 1-e)，而CuSO4攻毒组的粘膜上层与结缔层正在分离(图 1-h)，由此可见，CuCl2对刺参肠道的毒性(类似腐蚀作用)大于CuSO4的毒性。但刺参真正的致死原因是由于体表腐蚀作用，或是肠道腐蚀作用亦或是双重作用，有待进一步研究，以便用于指导刺参养殖过程中受到重金属侵染时作出及时正确的补救措施。吞噬变形细胞属于刺参体腔细胞，其在棘皮动物免疫过程中具有重要作用。刺参体腔受到刺激后会产生相应的反应，体腔细胞开始合成或分泌多种效应因子，李霞等[23]发现虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)有2种体腔细胞，变形吞噬细胞具有吞噬酵母的功能，色素细胞可释放色素颗粒参与体液免疫反应。孙永欣[24]研究发现高剂量的黄芪多糖(APS)会刺激刺参体腔内的吞噬细胞增多，用于吞噬外源APS，与该研究的结果类似。
![]()
图 1 对照组与硫酸铜/氯化铜攻毒组刺参后肠组织切片图a. 对照组刺参后肠(×1 000)；b. 对照组血小窦(×1 000)；c~e. CuCl2攻毒刺参后肠(×400)；f~h. CuSO4攻毒刺参后肠(×400)；ml. 黏膜层；cm. 环肌；lm. 纵肌；ct. 结缔组织；mu. 粘膜上皮层；pce. 假复层纤毛柱状上皮；mc. 间皮细胞Figure 1. Intestinal tissue slices of sea cucumber of control group and CuSO4/CuCl2 toxic groupa. hindgut 1 000 times micro-amplification; b. blood sinus 1 000 times micro-amplification of control group; c~e. hindgut 400 times micro-amplification of CuCl2 toxic group; f~h. hindgut 400 times micro-amplification of CuSO4 toxic group; ml. mucous layer; cm. circular muscle; lm. longitudinal muscle; ct. connective tissue; mu. Mucosa; pc. pseudostratified ciliated columnar epithelium; mc. mesothelial cells2.3 CuSO4/CuCl2对幼参半致死浓度计算结果
急性毒性浓度设置和死亡数量记录见表 1。根据试验结果利用浓度对数-概率回归方程，计算出CuSO4/CuCl2对幼参的不同时间LC50和95%置信区间，结果见表 2。
表 1 CuSO4/CuCl2来源的Cu2+对幼参急性毒性试验浓度设计与死亡结果(n=3)Table 1. Analysis of concentrations of different copper ions on juvenile sea cucumbermg · L-1 暴露时间/hexposure time ρ(CuSO4)(Cu2+) ρ(CuCl2)(Cu2+) 0.25 0.16 0.10 0.06 0.04 0.19 0.12 0.075 0.05 0.03 24 9 6 3 0 0 9 6 3 0 0 48 10 9 6 2 0 10 9 9 2 1 72 10 10 8 7 4 10 10 10 4 3 96 10 10 10 8 7 10 10 10 6 5 表 2 CuSO4/CuCl2来源的Cu2+对幼参急性毒性试验统计结果(n=3)Table 2. Result of different copper ions on juvenile sea cucumber in acute toxicity test时间/h time 硫酸铜/氯化铜CuSO4/CuCl2 浓度对数-概率回归方程regression equation 半致死质量浓度/mg·L-1 LC50 相对标准偏差RSDLC50 95%置信区间/mg·L-1 95%confidence interval P 24 CuSO4 P=5.29x+4.53 0.140 0.005 0 0.110~0.180 0.001 CuCl2 p=5.58x+5.52 0.100 0.005 0 0.097~0.130 48 CuSO4 p=5.72x+5.97 0.090 0.008 0 0.072~0.110 0.003 CuCl2 p=4.19x+5.01 0.064 0.008 0 0.053~0.076 72 CuSO4 p=3.62x+4.81 0.047 0.008 0 0.023~0.063 0.966 CuCl2 p=4.14x+5.74 0.041 0.009 0 0.028~0.053 96 CuSO4 p=4.18x+6.24 0.032 0.003 0 1.2×10-23~0.045 0.933 CuCl2 p=5.37x+7.75 0.036 0.004 0 0.029~0.042 采用ANOVA方差分析2种铜盐对幼参在不同时间的LC50组间差异显著，采用Tukey进行双重检验，结果见表 2。CuSO4来源的Cu2+对幼参24 h、48 h和72 h的LC50均大于CuCl2来源的Cu2+对幼参24 h、48 h和72 h的LC50，CuCl2对幼参96 h LC50大于CuSO4对幼参96 h LC50；但2种铜盐在24 h和48 h的LC50之间差异极其显著，而72 h和96 h的LC50差异不显著；由此可见在暴露初期，前48 h内Cu2+来源不同对刺参的毒性影响极其显著，随着暴露时间的延长Cu2+来源的不同对刺参的毒性影响不显著。
分别将2种铜盐对幼参的暴露时间和LC50结果拟合后发现，CuSO4对幼参的LC50与暴露时间满足对数函数关系，而CuCl2对幼参的LC50与暴露时间满足幂函数关系，且相关系数都较高(表 3)；分别对暴露时间和LC50进行t检验，发现CuSO4的暴露时间对LC50差异不显著(P=0.05)，而CuCl2的暴露时间对LC50差异显著(P＜0.05)。
表 3 CuSO4/CuCl2对幼参的暴露时间和半致死浓度回归参数一览表Table 3. Expose time and LC50 of juvenile with different copper ions铜来源source 回归方程regression equation R2 t 硫酸铜CuSO4 y=-0.08 ln(x)+0.1411 0.99 0.053 氯化铜CuCl2 y=0.110 3x-0.836 0.99 0.034 2.4 异源铜盐对幼参毒性限量与相关标准对比结果
根据1.3中式(1)得出异源铜盐对幼参的SC为：SCCuSO4=0.011 mg · L-1，SCCuCl2=0.006 5 mg ·L-1，SCCuSO4是SCCuCl2的1.69倍，说明CuCl2对幼参的毒性大于CuSO4对幼参的毒性。
通过中国不同海水水质标准对铜的限量(表 4)，可以看出关于海水水质的相关标准均是强制性的，但是标准中的Cu2+没有针对来源进行规定。文章研究得出的CuSO4对幼参SC为0.010 mg ·L-1，与《无公害食品海水养殖用水水质》、《海水水质标准》二类标准和《渔业水质标准》中的铜限量一致；CuCl2对幼参SC为0.006 5 mg · L-1介于《海水水质标准》一类标准和二类标准之间。
Table 4. Table of different standards of copper maximum limit in seawater in China标准名称standard name 标准类型type 最高限量/mg·L-1maximum limit NY 5052-2001 强制性 第一类≤0.005 ≤0.010 第三类、第四类≤0.050 GB 3097-1997 强制性 第二类 ≤0.010 GB 11607-1989 强制性 ≤0.010 2.5 幼参体壁内Cu2+质量分数与暴露液中Cu2+质量浓度的关系
刺参幼参体壁中w(Cu2+)随暴露水体中ρ(Cu2+)(CuSO4来源)的增大呈现逐渐升高的趋势，两者的关系满足多项式y=-141.03x2+70.58x+0.593 2(R2=0.92)(图 2-a)；对于CuCl2来源的刺参幼参体壁中w(Cu2+)随暴露水体中ρ(Cu2+)的变化也呈现同样的趋势，但两者的关系满足对数关系y=1.302 ln(x)+7.373 7(R2=0.93)(图 2-b)。
![]()
图 2 暴露水体中铜离子质量浓度与刺参体内壁铜质量分数关系图Figure 2. Copper concentration in tissue of juvenile after exposure因此，刺参幼参对不同来源的Cu2+的富集效果是不一样的。
刺参幼参对不同来源Cu2+的96 h内富集系数不同，利用AVONA分析得出，两者差异不显著(P=0.56>0.050)，但幼参对CuSO4来源的富集系数小于CuCl2来源的富集系数(表 5)。CuSO4对刺参幼参的毒性小于CuCl2，因此，渔业养殖中可采用CuSO4杀灭水质中的微生物或其他藻类。
表 5 刺参幼参对异源铜离子96 h富集系数Table 5. 96 h bioconcentration factor of juvenile with different copper ions toxicity铜来源source of copper ion 暴露质量浓度/mg·L-1 exposure concentration 96 h富集系数96 h bioconcentration factor 硫酸铜CuSO4 0.020~0.25 27.37~100 氯化铜CuCl2 0.030~0.19 37.60~132.50 国家标准中不再对Cu2+进行限量(表 6)，但NRJAGU[25]认为Cu是所有生物都需要的微量元素，它对生物生长的抑制效应是浓度的两步函数，浓度过低会抑制生物的生长，甚至死亡，但过高会产生毒性效应。孙元芹等[22]认为文蛤(Meretrix meretrix)暴露在ρ(Cu2+)为0.05 mg · L-1，富集30 d后体内w(Cu2+)达0.44 mg · L-1时(鲜质量)文蛤全部死亡。刘天红等[26]前期研究认为Cu2+对于12月龄栉孔扇贝(Chlamys Farreri)属于剧毒类物质。程波等[27]认为低浓度的Cu2+对于凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)具有重要的作用，可以作为他们的营养元素、血蓝蛋白成分，且在许多生物酶的组成和功能上也发挥着重要的作用，但是过量的Cu2+对于对虾来说却有害，甚至会是致死。由于金属能被海洋生物富集，沿食物链转移后最终影响人类健康[28-29]，因此，建议应该结合具体的养殖环境及食品安全毒理学评价数据，加强对水产品中Cu2+限量的研究，而不只是参考国际食品法典标准。
表 6 关于铜限量的食品安全标准Table 6. Food safety standards maximum limit of copper标准名称standard name 标准类型type 最高限量/mg·L-1maximum limit GB 2733-2005《鲜冻动物性水产品卫生标准》 强制性 / GB 2762-2005《食品中污染物限量》 强制性 / GB 15199-1994《食品中铜限量卫生标准》* 强制性 ≤50 注：*.根据2011年第3号中国国家标准公告，已废止
Note：*.According to announcement of No.3 National Standard of P.R.China of 2011 which was abolished.根据张志杰和张维平[30]的毒物毒性分级表(表 7)，对不同来源的Cu2+对刺参幼参毒性进行定性分析，半数耐受限(median tolerance limit, TLm)和LC50在大部分情况是等价[22]。CuSO4对刺参幼参96 h的LC50为0.032 mg · L-1，CuCl2对刺参幼参96h的LC50为0.036 mg · L-1，通过与表 7比对，认为CuSO4、CuCl2对于幼参均属于剧毒类物质。刘存岐等[31]认为Cu2+对日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的毒性较强，可能影响其体内酶的功能。程波等[27]认为可能是CuCl2、CuSO4阴离子的不同引起凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)蜕皮率和死亡率有所不同，但具体原因有待进一步研究。其他学者[32-33]也研究了Cu2+毒性，但缺乏定性分析。
表 7 有毒物质对水产类的毒性标准Table 7. Toxicity criteria of toxicants for fish等级scale 剧毒extremely toxic 高毒highly toxic 中毒toxic 低毒low toxic 半数耐受限/mg·L-1 TLm ＜0.10 0.10~1 1~10 >10 3. 结论
1) CuSO4和CuCl2对刺参幼参急性毒性效果不同，CuSO4对刺参幼参的24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分别为0.14 mg · L-1、0.09 mg · L-1、0.047 mg · L-1和0.032 mg · L-1；CuCl2对刺参幼参的24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分别为0.10 mg · L-1、0.064 mg · L-1、0.041 mg · L-1和0.036 mg · L-1；其中CuSO4和CuCl2对刺参幼参的24 h和48 h LC50差异极其显著；72 h和96 h差异不显著。
2) CuSO4和CuCl2对刺参幼参的SC分别为0.011 mg · L-1、0.065 mg · L-1，对于刺参幼参属于剧毒物质。
3) 2种来源Cu2+对刺参肠道均有不同程度的损伤，表现为刺参肠道粘膜上层脱离粘膜下层结缔组织，结缔组织中出现许多吞噬细胞用于解毒。
4) 暴露溶液中CuSO4来源的Cu2+与CuCl2来源的Cu2+都是水合铜离子，主要不同的是暴露溶液中的阴离子，试验说明不同的阴离子对Cu2+的毒性有拮抗作用。
5) 建议应该结合具体的养殖环境及食品安全毒理学评价数据，加强对水产品中Cu2+限量的研究。
-
![]()
图 1 AQP1a的cDNA序列及预测的氨基酸序列
起始密码子ATG在细线方框内，终止密码子以*表示；糖基化位点用灰色阴影表示；蛋白激酶A用直线下划线表示；蛋白激酶C加波浪线表示；胰岛素受体用间断下划线表示；细胞周期蛋白依赖性激酶用双下划线表示
Figure 1. Full cDNA sequence and predicted amino acid sequence of AQP1a
The start codon (ATG) is marked with box, and the stop codon is marked with an asterisk. The glycosylation sites are shown in shadow. The protein kinase A is underlined. The protein kinase C is wavy underlined. The insulin receptor is discontinuous underlined. The cyclin-dependent kinases is double underlined.
![]()
图 2 卵形鲳鲹AQP1a三级结构预测
a. AQP1a单体；b. AQP1a在质膜上的四聚体
Figure 2. Tertiary structure prediction of T.ovatus AQP1a
a. AQP1a monomer; b. AQP1a tetramers on the plasma membrane
![]()
图 3 卵形鲳鲹AQP1a氨基酸序列与其他物种氨基酸对比
下横线为6个跨膜结构域(TMD1~6)；红框为天冬酰胺–脯氨酸–丙氨酸(NPA)基序；黑框为MIP家族特有的保守序列HINPAVTLG；各物种AQP1a的序列号：高体 (XP_022613743.1)；舌齿鲈(ABI95464.2)；斑马鱼(NP_996942.1)；非洲爪蟾(NP_001085391.1)；小鼠(EDK98728.1)；人(CAQ51480.2)
Figure 3. Alignment of amino acid sequence of T.ovatus AQP1a in comparison with those of other species
Horizontal lines indicate six predicted transmembrane helical structure (TMD1–6); red box indicates the structural characteristics of asparagine-proline-alanine (NPA) motifs; black box indicates the unique conserved sequence of the MIP family: HINPAVTLG; the AQP1a sequence No. of each species: S. dumerili (XP_022613743.1) ; D.labrax (ABI95464.2); D.rerio (NP_996942.1); X.laevis (NP_001085391.1); M.musculus (EDK98728.1); H.sapiens (CAQ51480.2)
![]()
图 4 基于AQP1氨基酸序列构建的NJ系统进化树
Figure 4. NJ phylogenetic tree based on amino acid sequences of AQP1
![]()
图 5 AQP1a mRNA在各组织中的表达分布
Figure 5. Distribution of AQP1a mRNA expression in different tissues
![]()
图 7 鳃、肾和肠中AQP1a在急性盐度胁迫后时空表达
EF-1α为内参基因；*. 差异显著(P<0.05)；**. 差异极显著(P<0.01)；0 h为空白对照
Figure 7. Spatiotemporal expression of AQP1ɑ in gill, kidney and intestine after acute salinity stress
EF-1α expression was used as an internal control for real-time PCR; *. significant difference at P<0.05; **. very significant difference at P<0.01. The untreated (0 h) group was used as the control.
表 1 实验所用引物
Table 1 Primer sequences used in this study
引物
primer引物序列 (5′–3′)
primer sequence用途
applicationAQP1a-F
AQP1a-RAAACCCAGACCAAGAGGTGAAG
TGCTGCTACACCACCGCACATT验证开放阅读框 AQP1a-qF
AQP1a-qRAGTTACCCTCGGGATGCTTGC
GCTGCTACACCACCGCACATT实时荧光定量 PCR EF-1α-F
EF-1α-RCCCCTTGGTCGTTTTGCC
GCCTTGGTTGTCTTTCCGCTA内参基因 
下载: 导出CSV
表 2 卵形鲳鲹AQP1a氨基酸与其他物种的同源性
Table 2 Homology of AQP1a amino acids of T.ovatus to other species
1 2 3 4 5 6 7 1 卵形鲳鲹 T.ovatus 100 2 高体 S.dumerili 95.7 100 3舌齿鲈 D.labrax 93.1 93.1 100 4 斑马鱼 D.rerio 76.7 75.9 75.1 100 5 人 H.sapiens 59.1 58.3 56.8 57.6 100 6 小鼠 M.musculus 60.2 58.7 57.2 58.3 94.0 100 7 非洲爪蟾 X.laevis 56.8 56.1 56.1 56.5 73.5 74.2 100
下载: 导出CSV
表 3 构建系统进化树的物种
Table 3 Species used in phylogenetic tree
物种
species基因
gene登录号
accession No.舌齿鲈 D.labrax AQP1 ABI95464.2 攀鲈 A.testudineus AQP1a AGF30363.1 欧洲鳗鲡 A.anguilla AQP1a CAD92027.1 欧洲鳗鲡 A.anguilla AQP1b ABM26906.1 暗纹东方鲀 T.obscurus AQP1 ADG86337.1 大西洋鲑 S.salar AQP1b NP_001133472.1 黄尾 S. dorsalis AQP1 XP_023259499.1 日本鳗鲡 A.japonica AQP1a BAC82109.1 日本鳗鲡 A.japonica AQP1b BAK53383.1 青鳉 O.dancena AQP1 BAN17349.1 金头鲷 S.aurata AQP1a ABM26907.1 金头鲷 S.aurata AQP1b ABM26908.1 鲤 Cyprinus carpio AQP1 BAS18938.1 平鲷 R.sarba AQP1 AEG78286.1 胡瓜鱼 O.mordax AQP1 ACO09149.1 黑鲷 A.schlegelii AQP1 ABO38816.1 人 H.sapiens AQP1 CAQ51480.2 小鼠 M.musculus AQP1 EDK98728.1
下载: 导出CSV
-
[1] AN K W, KIM N N, CHOI C Y. Cloning and expression of aquaporin 1 and arginine vasotocin receptor mRNA from the black porgy, Acanthopagrus schlegeli: effect of freshwater acclimation[J]. Fish Physiol Biochem, 2008, 34(2): 185-194.
[2] CHNG Y R, ONG J L, CHING B, et al. Molecular characterization of aquaporin 1 and aquaporin 3 from the gills of the African lungfish, Protopterus annectens, and changes in their branchial mRNA expression levels and protein abundance during three phases of aestivation[J]. Front Physiol, 2016, 7: 532.
[3] ABASCAL F, IRISARRI I, ZARDOYA R. Diversity and evolution of membrane intrinsic proteins[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1840(5): 1468-1481.
[4] FINN R N, CERDÀ J. Evolution and functional diversity of aquaporins[J]. Biol Bull, 2015, 229(1): 6-23.
[5] AGRE P, SASAKI S, CHRISPEELS M J. Aquaporins: a family of water channel proteins[J]. Am J Physiol, 1993, 265(3 Pt 2): F461.
[6] TINGAUD-SEQUEIRA A, CHAUVIGNÉ F, FABRA M, et al. Structural and functional divergence of two fish aquaporin-1 water channels following teleost-specific gene duplication[J]. BMC Evol Biol, 2008, 8(1): 259.
[7] CHEN L M, ZHAO J, MUSA-AZIZ R, et al. Cloning and characterization of a zebrafish homologue of human AQP1: a bifunctional water and gas channel[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2010, 299(5): R1163-R1174.
[8] DEANE E E, LUK J C Y, WOO N Y S. Aquaporin 1a expression in gill, intestine, and kidney of the euryhaline silver sea bream[J]. Front Physiol, 2011, 2: 39.
[9] GUO H, WEI M, LIU Y, et al. Molecular cloning and expression analysis of the aqp1aa gene in half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis)[J]. PLoS One, 2017, 12(4): e175033.
[10] TIPSMARK C K, SØRENSEN K J, MADSEN S S. Aquaporin expression dynamics in osmoregulatory tissues of Atlantic salmon during smoltification and seawater acclimation[J]. J Exp Biol, 2010, 213(3): 368-379.
[11] MARTINEZ A S, CUTLER C P, WILSON G D, et al. Regulation of expression of two aquaporin homologs in the intestine of the European eel: effects of seawater acclimation and cortisol treatment[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2005, 288(6): R1733-R1743.
[12] JEONG S Y, KIM J H, LEE W O, et al. Salinity changes in the anadromous river pufferfish, Takifugu obscurus, mediate gene regulation[J]. Fish Physiol Biochem, 2014, 40(1): 205-219.
[13] KIM Y K, LEE S Y, KIM B S, et al. Isolation and mRNA expression analysis of aquaporin isoforms in marine medaka Oryzias dancena, a euryhaline teleost[J]. Comp Biochem Physiol A, 2014, 171(5): 1-8.
[14] IP Y K, SOH M M, CHEN X L, et al. Molecular characterization of branchial aquaporin 1aa and effects of seawater acclimation, emersion or ammonia exposure on its mRNA expression in the gills, gut, kidney and skin of the freshwater climbing perch, Anabas testudineus[J]. PLoS One, 2013, 8(4): e61163.
[15] GIFFARD-MENA I, BOULO V, AUJOULAT F, et al. Aquaporin molecular characterization in the sea-bass (Dicentrarchus labrax): the effect of salinity on AQP1 and AQP3 expression[J]. Comp Biochem Physiol A, 2007, 148(2): 430-444.
[16] 于文博, 朱克诚, 郭华阳, 等. 卵形鲳鲹MHCⅡβ基因的克隆与表达分析[J]. 南方水产科学, 2017, 13(4): 69-79. [17] GEYER R R, MUSA-AZIZ R, QIN X, et al. Relative CO(2)/NH(3) selectivity's of mammalian aquaporins 0-9[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2013, 304(10): C985-C994.
[18] FINN R N, CHAUVIGNÉ F, HLIDBERG J B, et al. The lineage-specific evolution of aquaporin gene clusters facilitated tetrapod terrestrial adaptation[J]. PLoS One, 2014, 9(11): e113686.
[19] KONG Y, MA J. Dynamic mechanisms of the membrane water channel aquaporin-1(AQP1)[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(25): 14345-14349.
[20] FUJIYOSHI Y, MITSUOKA K, de GROOT B L, et al. Structure and function of water channels[J]. Curr Opin Struct Biol, 2002, 12(4): 509-515.
[21] De GROOT B L, GRUBMÜLLER H. Water permeation across biological membranes: mechanism and dynamics of aquaporin-1 and GlpF[J]. Science, 2001, 294(5550): 2353-2357.
[22] BEITZ E, WU B, HOLM L M, et al. Point mutations in the aromatic/arginine region in aquaporin 1 allow passage of urea, glycerol, ammonia, and protons[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(2): 269-274.
[23] 姜勇, 麻彤辉. NPA motif在水通道蛋白AQP1表达和转水功能中的重要性[J]. 科学通报, 2007, 52(4): 426-431. [24] WALZ T, HIRAI T, MURATA K, et al. The three-dimensional structure of aquaporin-1[J]. Nature, 1997, 387(6633): 624-627.
[25] 丁炜东. 黄鳝性别分化相关候选基因的筛选及相关功能研究[D]. 南京: 南京农业大学, 2016: 76-83 [26] 姚小皓, 李学军. 水孔蛋白1的结构与功能[J]. 生理科学进展, 2000, 31(4): 345-348. [27] BOJ M, CHAUVIGNÃ F, ZAPATER C, et al. Gonadotropin-activated androgen-dependent and independent pathways regulate aquaporin expression during teleost (Sparus aurata) spermatogenesis[J]. PLoS One, 2015, 10(11): e0142512.
[28] AOKI M, KANEKO T, KATOH F, et al. Intestinal water absorption through aquaporin 1 expressed in the apical membrane of mucosal epithelial cells in seawater-adapted Japanese eel[J]. J Exp Biol, 2003, 206(19): 3495-3505.
[29] 丁炜东, 曹丽萍, 曹哲明, 等. 黄鳝AQP1 cDNA的克隆与表达分析[J]. 华北农学报, 2012, 27(S1): 6-11. [30] SANG Y L, NAM Y K, YI K K. Characterization and expression profiles of aquaporins (AQPs) 1a and 3a in mud loach Misgurnus mizolepis after experimental challenges[J]. Fish Aquat Sci, 2017, 20(1): 23.
[31] 王美垚, 杨健, 徐跑, 等. 刀鲚水通道蛋白1的分子克隆及高盐作用下的表达分析[J]. 中国水产科学, 2017, 24(3): 449-458. -
期刊类型引用(1)
1. 李茜茜, 朱华平, 卢迈新, 刘志刚, 高风英, 可小丽. 盐胁迫对橙色莫桑比克罗非鱼AQP1基因表达的影响. 基因组学与应用生物学. 2016(11): 2996-3006 . 
百度学术
其他类型引用(2)
计量
- 文章访问数:
- HTML全文浏览量:
- PDF下载量:
- 被引次数: 3
粤公网安备 44010502001741号
