随着水产养殖业的不断发展，水产养殖动物病害频发，据2014年数据显示，水产养殖动物因病害造成的经济损失约140亿元，占水产养殖产值的1.78%，其中甲壳类损失占52%，虾类疾病中细菌病5种，分别为红腿病、烂鳃病、烂尾病、肠炎病和弧菌病^[1]。随着抗生素等药物对环境及人类的危害越来越被认知和重视，抗生素等化学药物在水产养殖业的使用逐渐减少。因此，迫切需要寻找环境友好且易于操作的有效方法以减少细菌性病害的发生，从而降低其对水产养殖业造成的危害。水产功能菌株已用于水产动物细菌性病害的防治，并取得了很好的效果，大量研究表明在养殖池中施加有益微生物制剂不仅能够促进对虾肠道微生物群落的代谢功能^[2-3]，还能抑制池塘水体中的致病菌^[4]。

群体感应(Quorum sensing)是指细菌之间一种通过自身产生并释放一些特定的信号分子从而进行交流的特殊机制，当环境中的信号分子浓度达到一定阈值时，就会启动某些相关基因的表达，促使细菌产生独特的、多样的生物学功能^[5]，如控制细菌生物膜的形成^[6-7]、吸收外来DNA、耐酸、产生毒力因子^[7]、产生及调控抗生素等^[8]。通过抑制致病菌的群体感应系统，可以抑制其致病因子的产生，从而降低致病菌的致病能力，这为水产细菌性病害的防治提供了新的途径。Tinh等^[9]将从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道中获得的AHL降解菌株富集培养后拌料投喂，提高了大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼体的成活率；Kanagasabhapathy等^[10]从细菌中筛选出群体感应抑制效果的菌株，这些菌株包括芽孢杆菌属、假单胞菌属、交替假单胞菌属、弧菌属；Defoirdt等^[11]从养殖动物中分离出具有AHLs降解效果的芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株，这些菌株可以在水产养殖中作为新的生物控制菌株；Nahn等^[12]从蜡样芽孢杆菌(B. cereus)获得的AHL内酯酶能够抑制哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的发光效果。目前细菌群体感应抑制菌株的筛选方法多种多样，其中以利用报告菌的方法居多^[13-15]。为便于群体感应抑制菌株的大规模筛选，汤开浩^[16]和Zheng等^[17]以根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) A136为报告菌，构建了一种基于β-半乳糖苷酶(β-gal)活性检测的细菌群体感应抑制菌株高通量筛选方法，目前已应用于细菌群体感应抑制菌株的筛选。

本研究以紫色色杆菌和根癌农杆菌A136为报告菌株，利用滤纸片法和高通量法从对虾养殖环境和肠道内筛选获得具有AHLs信号分子抑制效果的活性菌株，探讨培养时间和盐度对活性菌株降解AHLs信号分子能力的影响，以及活性菌株粗提物对水产致病菌坎氏弧菌(V.campbellii，筛选自对虾苗种培育环境，危害对虾幼体健康)毒力基因toxR和tlh mRNA表达的影响，为基于群体感应的角度防治水产细菌性病害的研究提供基础性资料。

1.   材料与方法

1.1   菌株的分离与纯化

从乳山、东营、潍坊三地对虾养殖场采集健康凡纳滨对虾养殖池塘的水样及对虾，利用LB固体培养基划线纯化的方法分离得到纯化菌株。采样时间为8月，乳山养殖场采样池塘养殖水环境条件为温度29 ℃，盐度22，采样的对虾体长为7~8 cm。东营养殖场采样池塘养殖水环境条件为温度28 ℃，盐度31，采样的对虾体长为7~9 cm。潍坊养殖场采样池塘养殖水环境条件为温度28 ℃，盐度31，采样的对虾体长为7~9 cm。LB固体培养基的成分为蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠30 g，琼脂20 g，纯水1 L，pH 7.4~7.6。

1.1.1   水样中细菌分离与纯化

用无菌海水分别将水样稀释10²、10³、10⁴倍，取200 μL稀释液涂布于LB固体培养基上，放置于培养箱中培养(30 ℃，24 h)。挑取培养基上单菌落，进行划线培养，直到获得纯菌株。

1.1.2   对虾肠道内细菌分离与纯化

用乙醇将对虾表面擦拭干净，用已灭菌的镊子慢慢将对虾肠道取出，放入已灭菌的匀浆器内，加入1 mL无菌生理盐水研磨。将研磨好的匀浆液用无菌的生理盐水稀释10²、10³、10⁴倍，取200 μL稀释好的匀浆液涂布于LB固体培养基上，放置于恒温培养箱中培养(30 ℃，24 h)。挑取培养基上单菌落，进行划线培养，直到获得纯菌株。

1.2   活性菌株筛选

以紫色色杆菌作为指示菌株，通过滤纸片法，对筛选得到的纯化菌株进行初步筛选，获得具有AHLs信号分子抑制效果的疑似菌株。利用高通量法对菌株进行复筛，最终得到能够抑制细菌群体感应的活性菌株。

1.2.1   滤纸片法筛选具有AHLs信号分子抑制效果疑似菌株

将待测菌粗提物溶解于乙酸乙酯中，质量浓度为50 mg·mL^–1，取10 μL滴于滤纸片上，风干后倒扣在涂好紫色色杆菌的固体培养皿中，将处理好的培养皿在30 ℃条件下培养24 h后观察结果。根据滤纸片上紫色色杆菌褪色情况，评价待选菌株抑制AHLs信号分子的效果。以不含粗提物的乙酸乙酯滴于滤纸片作为对照组。紫色色杆菌培养基成分为蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，纯水1 L，pH 7.4~7.6。

1.2.2   高通量法筛选抑制细菌群体感应的活性菌株

参照汤开浩^[16]所构建的方法进行。根癌农杆菌A136培养基(蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 L，pH 7.0)灭菌后，加入壮观霉素(终浓度50 μg·mL^–1)、四环素(终质量浓度4.5 μg·mL^–1)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal，终质量浓度250 μg·mL^–1)，接种根癌农杆菌培养24 h。将待测菌株接种于LB液体培养基中培养24 h后，离心(10 000 r·min^–1，10 min)取上清液178 μL，与2 μL C₆-HSL (1 mmol·L^–1)和20 μL哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)缓冲溶液(1 mol·L^–1，pH 6.7)混合孵育36 h，然后离心(10 000 r·min^–1，10 min)取上清液。将10 μL上清液和培养好的根癌农杆菌190 μL加入96孔板中混合培养12 h。最后测定混合培养液的光密度OD₆₃₀和OD₄₉₀。β-gal活性的计算公式：β-gal活性${\rm{ = }}\frac{{0.653 \times {\rm OD}_{490} - {\rm OD}_{630}}}{{0.267 \times {\rm OD}_{630} - {\rm OD}_{490}}}$。β-gal活性越高，表明混合培养液中C₆-HSL含量越高，待测菌株粗提物对其降解越少。

1.3   菌株的鉴定

测定所获活性菌株的16S rRNA基因序列，测序结果在NCBI中用BLAST搜索同源序列，利用MEGA 5.0软件构建菌株的系统发育树，确定菌株种类。菌株16S rRNA基因的提取和序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4   活性菌株特性的初步研究

1.4.1   AHLs信号分子对活性菌株生长的影响

将不同量的AHLs信号分子主要化学成分N-酰基-高丝氨酸内酯标准品(C₆-HSL，Sigma公司)加入到所筛选获得的活性菌株培养系统中，使C₆-HSL最终质量浓度分别为0.02 mg·L^–1、0.2 mg·L^–1、0.4 mg·L^–1、1 mg·L^–1和2 mg·L^–1，30 ℃培养24 h后在波长600 nm下测定菌株培养液光密度，用OD₆₀₀表示菌株生长情况。活性菌株培养系统为蛋白胨10 mg·mL^–1、酵母粉5 mg·mL^–1、氯化钠30 mg·mL^–1、体积200 μL、pH 7.4~7.6。

1.4.2   不同培养时间对活性菌株降解AHLs信号分子的影响

将活性菌株放入到LB液体培养基中培养，分别于第12、第24、第36和第48小时离心获得上清液，加入C₆-HSL后共同孵育36 h，通过测定上清液β-gal活性评价不同培养时间活性菌株降解AHLs信号分子的效果。β-gal活性的测定参照1.2.2相关操作进行。

1.4.3   不同盐度条件对活性菌株降解AHLs信号分子的影响

改变LB液体培养基中氯化钠添加量，设置3个盐度梯度(10、20、30)，将活性菌株培养24 h后，离心获得上清液，加入C₆-HSL后共同孵育36 h，通过测定上清液β-gal活性评价不同盐度条件下菌体降解AHLs信号分子的效果。β-gal活性的测定参照1.2.2相关操作进行。

1.4.4   活性菌株粗提物对坎氏弧菌毒力基因表达的影响

提取活性菌株粗提物，将其加入到坎氏弧菌培养系统中，使粗提物质量浓度为50g·L^–1，30 ℃培养24 h后，离心(8 000 r·min^–1，10 min)收集菌体，测定坎氏弧菌毒力基因toxR和tlh mRNA绝对表达量。坎氏弧菌培养系统为蛋白胨10 mg·mL^–1、酵母粉5 mg·mL^–1、氯化钠30 mg·mL^–1、体积2 mL、pH 7.4~7.6。

1.5   活性菌株粗提物的提取

将活性菌株接种于LB液体培养基中培养24 h后，取200 μL菌液涂布于固体培养基上培养48 h，用2 mL PBS (0.01mol·L^–1，pH=7.4)将固体平板上菌体刮入到已灭菌的EP管中，向EP管中加入与菌体(未离心)等量的含5%丙酮的乙酸乙酯，萃取12 h。取上清液移至另一EP管中，使用离心浓缩冻干机低温冻干，收集固体物质，放入–20 ℃冰箱保存备用。

1.6   坎氏弧菌毒力基因绝对表达量测定

利用UNIQ–10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒(SK1321，生工^TM)提取细菌总RNA。细菌菌体在液氮中研磨成粉末后，加入Trizol试剂提取总RNA，具体步骤参照试剂盒说明书完成。总RNA获得之后参照cDNA合成试剂盒(EP0733，Thermo Scientific^TM)说明书进行反转录。使用StepOne型荧光定量PCR仪(美国ABI)测定基因mRNA绝对表达量，反应体系包括10 μL SybrGreen qPCR Master Mix，0.4 μL上下游引物，2 μL cDNA，加超纯水至20 μL。反应条件为95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，45个循环。

根据GenBank上坎氏弧菌toxR基因(HQ 318823)和tlh (DQ 663484)基因序列，利用Primer 5.0软件设计得到toxR和tlh实时定量PCR引物，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表  1  引物序列设计

Table  1.  Primer sequence design

基因 gene	产物大小/bp product size	上游引物 forward	下游引物 reverse
toxR	142	5′-CCGAAGCTACCACAGAAACG-3′	5′-CAGACTGGCAGCAGCAAAG-3′
tlh	193	5′-ACGGGTTTGTATGGACAGAAT-3′	5′-AACTCAAGGGTGAACAGGGTA-3′

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1.7   数据分析

实验数据用平均值±标准差($ \overline X \pm {\rm SD}$)表示，通过SPSS 19.0软件对实验数据进行统计分析，先将数据作单因子方差分析(ANOVA)，如果处理组间有显著性差异，再用Tukey多重比较法进行两两间差异显著性分析，当P<0.05时认为差异显著。

2.   结果

2.1   细菌群体感应抑制菌株的筛选

从乳山、东营、潍坊三地对虾养殖场环境和对虾肠道内共筛选获得纯化菌株74株，其中从环境中筛选得到50株，从对虾肠道内筛选得到24株。与对照相比，菌株DC13 (筛选自对虾肠道，东营)和RS5 (筛选自对虾养殖环境，乳山)滤纸片上紫色褪去，表明菌体粗提物中有抑制紫色色杆菌AHLs信号分子的物质(图1)。进一步通过β-gal活性检测法判断菌体粗提物对AHLs信号分子的抑制效果，发现菌株DC13和RS5细菌培养液与C₆-HSL孵育后β-gal活性显著低于对照组(P<0.05，图2)，表明菌株培养液中有抑制AHLs信号分子的物质。综合研究结果表明，菌株DC13和RS5粗提物中含有对AHLs信号分子具有抑制作用的物质，2株菌株可以作为具有细菌群体感应抑制作用的活性菌株进行下一步实验。

图  1  滤纸片法筛选结果

Figure  1.  Screening result by filter paper method

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图  2  菌株DC13和RS5上清液与C₆-HSL孵育后的β-gal活性

不同字母表示差异显著(P<0.05)；后图同此

Figure  2.  β-gal activity in supernatant of strain DC13 and RS5 co-cultured with C₆-HSL

Different letters indicate significant difference (P<0.05). The same case in the following figures.

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2.2   活性菌株鉴定结果

菌株DC13和RS5的16S rRNA测序结果在NCBI中比对结果表明，菌株DC13和RS5属于芽孢杆菌属细菌(图3)。菌株系统发育树分析结果表明，菌株DC13序列同枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)序列具有97%相似性，菌株RS5序列同巨大芽孢杆菌(B.megaterium)序列具有100%相似性。

图  3  菌株DC13、RS5及在GenBank中与其相关种属以16S rRNA基因为基础构建的进化树

分支点上的数字表示构建系统树时1 000次计算时形成该节点的百分比；括号内数值为GenBank登录号；标尺或刻度0.02或0.005代表2%或0.5%的16S rRNA基因序列的进化差异

Figure  3.  Phylogenetic analysis of strain DC13 and RS5 based on 16S rRNA gene sequence

The bootstrap values (%) presented at the branches were calculated from 1 000 replications; numbers in parentheses are GenBank accession numbers; the scale bar 0.02 or 0.005 represents 20 or 5 nucleotide substitutions per 1 000 nucleotides.

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2.3   AHLs信号分子对活性菌株生长的影响

不同质量浓度C₆-HSL对菌株DC13和RS5的生长无显著影响(P>0.05，图4)，但是高质量浓度的C₆-HSL对菌株DC13的生长呈现促进作用。

图  4  菌株DC13 (A)和RS5 (B)在不同C₆-HSL质量浓度条件下的生长

Figure  4.  Growth of strain DC13 (A) and RS5 (B) at different C₆-HSL mass concentrations

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2.4   活性菌株不同培养时间降解AHLs信号分子效果

菌株DC13培养24 h后，培养液中β-gal活性无显著性变化，表明其降解AHLs信号分子能力在培养24 h后无显著性差异(图5)。菌株RS5培养12~48 h时，培养液中β-gal活性无显著性变化，表明其降解AHLs信号分子的能力在培养12 h后无显著性差异。

图  5  菌株DC13 (A) 和RS5 (B) 不同培养时间上清液与C₆-HSL孵育后β-gal活力

Figure  5.  β-gal activity of C₆-HSL cultured with supernatant of strain DC13 (A) and RS5 (B) at different culture time

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2.5   不同盐度条件下活性菌株降解AHLs信号分子的效果

盐度对菌株降解AHLs信号分子的影响见图6。盐度对菌株DC13降解AHLs信号分子影响不显著，但是在高盐度(20和30)时降解效果较好。盐度对菌株RS5降解AHLs信号分子具有显著影响(P<0.05)，高盐度(20和30)时降解效果比低盐度(10)时明显提高。

图  6  菌株DC13 (A) 和RS5 (B) 不同培养盐度上清液与C₆-HSL孵育后β-gal活力

Figure  6.  β-gal activity of C₆-HSL culture with supernatant of strain DC13 (A) and RS5 (B) at different salinities

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2.6   活性菌株粗提物对坎氏弧菌毒力基因表达的影响

菌株DC13和RS5粗提物的添加显著影响了坎氏弧菌毒力基因toxR和tlh的表达(P<0.05，图7)。2株细菌粗提物的添加使坎氏弧菌毒力基因toxR的表达明显上调，其中DC13组坎氏弧菌toxR的绝对表达量上调更加明显。2株细菌粗提物的添加使坎贝氏弧菌tlh基因的表达下调，其中DC13组坎氏弧菌tlh的绝对表达量下调更加明显。

图  7  菌株DC13和RS5粗提物与坎氏弧菌共培养后，坎氏弧菌菌体中toxR (A)和tlh (B)绝对表达量

V.campbellii组为对照组

Figure  7.  Absolute expression quantity of toxR (A) and tlh (B) in V.campbellii after being cultured with extracellular products of strain DC13 and RS5

V.campbellii group is the control group.

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3.   讨论

通过干扰致病菌群体感应系统以防治水产细菌性病害的研究刚刚开展，筛选得到致病菌群体感应抑制菌株是开展相关研究工作的基础。本研究中筛选得到了2株具有抑制细菌群体感应效果的芽孢杆菌，初步鉴定为枯草芽孢杆菌(菌株DC13)和巨大芽孢杆菌(菌株RS5)，丰富了芽孢杆菌对致病菌群体感应系统抑制作用的研究资料。芽孢杆菌属细菌对细菌群体感应的抑制效果已有报道，宋增福等^[15]从异育银鲫(Carassius auratus gibelio)肠道内分离出一株短小芽孢杆菌(B.pumilus)，其具有细菌群体感应信号分子抑制作用。Bai等^[18]研究发现苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)所分泌的AiiA内酯酶能够抑制哈维氏弧菌的群体感应系统。Chu等^[19]从异育银鲫肠道内分离出一株具有降解AHLs信号分子功能的芽孢杆菌，经发酵培养后作为添加剂加入到饲料中，降低了嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对异育银鲫的致病力。

AHLs是细菌群体感应主要信号分子之一，广泛存在于革兰氏阴性细菌中^[20]，其对环境微生物的生长和功能有显著影响。侯保连等^[21]研究发现，人为添加AHLs信号分子能促进硝化污泥微生物生长，提高微生物生长速率，增强硝化污泥活性，加速硝化污泥生物量累积。本研究结果发现，随着C₆-HSL添加量的增加，菌株DC13的生长呈现上升趋势，但是各组之间差异不显著。

环境因子对细菌的生长和功能具有重要影响，宋洪宁等^[22]研究发现环境因子对东平湖沉积物的细菌多样性产生显著影响，但对其土著菌群的影响不大。因此，探讨潜在功能菌株的环境适应性，对于更好地发挥菌株功能十分重要。本研究中发现盐度对所筛选得到的活性菌株降解AHLs信号分子能力具有一定的影响，2株细菌更适合在盐度20以上的条件下使用。培养时间对菌株降解AHLs信号分子能力也有一定的影响。以上研究结果为菌株的实际应用以及通过发酵培养获得活性物质提供了参考。

毒力基因toxR广泛分布于弧菌属细菌中，作为调节基因在调节编码弧菌肠毒素基因、菌毛和一些外膜蛋白在内的毒力基因中发挥关键作用^[23]。毒力基因tlh编码不耐热性溶血毒素，是一种非典型磷脂酶，能够引起连续的溶血使细胞凋亡从而溶解细胞^[23-24]。干扰致病菌群体感应系统可以抑制其毒力基因的表达，吕子敏等^[25]研究发现原白头翁素抗铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染的机制可能是其作用于细菌的群体感应系统，抑制了毒力因子表达，从而降低该菌的毒力。本研究中也发现，菌株DC13和RS5粗提物添加后坎氏弧菌的tlh基因表达受到抑制，推测可能是粗提物中的活性物质干扰了坎氏弧菌群体感应系统从而引起毒力基因表达减弱，具体的有效成分和作用机理有待进一步研究。然而，菌株DC13和RS5粗提物添加后坎氏弧菌toxR基因的表达上调，推测可能与其具有调节毒力相关基因表达的功能有关。作为毒力基因的调节基因，当tlh表达下调时，toxR表达上调以促进tlh基因的表达，行使其调控作用，具体作用机理有待进一步深入探讨。

群体感应在水产养殖中的研究还处于起步阶段，活性菌株对致病菌群体感应系统抑制效果及其作用机理还需深入研究。本研究中获得了2株具有细菌群体感应抑制效果且影响水产致病菌毒力基因表达的活性菌株，为基于群体感应的角度防治水产细菌性病害的研究提供了实验材料。此外，进一步开展了群体感应抑制菌株的实际应用研究，研究结果具有重要的实际应用价值。后期将对活性菌株粗提物中的物质进行分离、纯化，以得到能够抑制致病菌群体感应的有效活性物质，探讨其作用的相关机制，为通过抑制致病菌群体感应防治水产细菌性病害的研究提供理论基础。

致谢：中国海洋大学张晓华老师为项目研究提供的根癌农杆菌A136，扬州大学缪莉老师提供的紫色色杆菌，特此感谢！