对虾养殖体系中细菌群体感应抑制菌株的筛选及其特性初步研究

韦存, 于鹏, 于明超, 单洪伟

韦存, 于鹏, 于明超, 单洪伟. 对虾养殖体系中细菌群体感应抑制菌株的筛选及其特性初步研究[J]. 南方水产科学, 2018, 14(1): 27-34. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.01.004
引用本文: 韦存, 于鹏, 于明超, 单洪伟. 对虾养殖体系中细菌群体感应抑制菌株的筛选及其特性初步研究[J]. 南方水产科学, 2018, 14(1): 27-34. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.01.004
WEI Cun, YU Peng, YU Mingchao, SHAN Hongwei. Preliminary study of screening and characteristics of strains with Quorum sensing inhibition activity in shrimp culture environment[J]. South China Fisheries Science, 2018, 14(1): 27-34. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.01.004
Citation: WEI Cun, YU Peng, YU Mingchao, SHAN Hongwei. Preliminary study of screening and characteristics of strains with Quorum sensing inhibition activity in shrimp culture environment[J]. South China Fisheries Science, 2018, 14(1): 27-34. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.01.004

对虾养殖体系中细菌群体感应抑制菌株的筛选及其特性初步研究

基金项目: 山东省自然科学基金项目(ZR2014CP005);通威股份有限公司产学研项目(TW2014M006)
详细信息
    作者简介:

    韦 存(1993 — ),男,硕士研究生,从事虾蟹类动物养殖病害防控研究。E-mail:15063913827@163.com

    通讯作者:

    单洪伟(1984 — ),男,博士,讲师,从事虾蟹类动物养殖技术研究。E-mail:shanhongwei@ouc.edu.cn

  • 中图分类号: S 966.12+9

Preliminary study of screening and characteristics of strains with Quorum sensing inhibition activity in shrimp culture environment

  • 摘要: 从对虾养殖环境及肠道内筛选能够抑制细菌群体感应的活性菌株,并探讨了影响菌株活性的环境因素及其对病原坎氏弧菌(Vibrio campbellii)毒力基因表达的影响。采用滤纸片法和高通量法对分离出的纯化菌株进行筛选,获得活性菌株。评估不同培养时间和盐度对活性菌株降解N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)信号分子能力的影响,并检测活性菌株粗提物对坎氏弧菌毒力基因toxRtlh mRNA表达的影响。分离得到2株活性菌株DC13和RS5,经16S rRNA基因序列分析,初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和巨大芽孢杆菌(B. megaterium)。AHLs信号分子对活性菌株生长无显著性影响(P>0.05)。菌株DC13培养24 h后降解AHLs信号分子能力达到最大值,菌株RS5培养12~48 h降解AHLs信号分子能力无显著变化。盐度10~30时对菌株DC13降解AHLs信号分子能力无显著性影响,但是对菌株RS5降解AHLs信号分子能力影响显著(P<0.05)。活性菌株粗提物的添加使坎氏弧菌毒力基因toxR的表达上调,而毒力基因tlh的表达下调。
    Abstract: We screened the active strains with Quorum sensing inhibition activity in shrimp gut and their culture environment, to investigate the environmental factors that affect the activity of strains and their effects on the virulence gene expression of Vibrio campbellii. The methods of filter paper and high-throughput were applied to screen active strains. The effects of AHLs signal molecule on active strains growth with different culture time and salinities were estimated. The effects of crude extract products of active strains on the virulence genes toxR and tlh mRNA expression levels of the pathogenic bacteria were also investigated. Two active strains named as DC13 and RS5 were obtained and preliminarily identified as Bacillus subtilis and B.megaterium by 16S rRNA gene sequence analysis. No significant difference was observed in the active strains growth treated with AHLs signaling molecule (P>0.05). The AHLs signal molecule degradation ability of strain DC13 reached the maximum value at 24th hour. However, after a 12—48 h treatment, no significant difference was observed in AHLs signal molecule degradation ability by strain RS5. When the strains were cultured at salinity of 10–30, there was no significant difference in AHLs signal molecule degradation ability by strain DC13, while significant difference was observed by AHLs signal molecule degradation ability of strain RS5 (P<0.05). It is demonstrated that addition of crude extract products of active strains can increase virulence gene toxR expression but decrease virulence gene tlh expression level.
  • 随着大黄鱼(Pseudosciaena crocea Richardson)网箱养殖的蓬勃发展,各种病虫害的发生也越来越频繁。近年来,浙江省沿海各大黄鱼养殖场相继发生了一种溃疡病,该病发病率高、流行范围广,危害非常严重。为了搞清浙江沿海养殖大黄鱼溃疡病的病原,找到有效的防治方法,本文以典型症状的病鱼作为材料,通过菌株的分离鉴定、人工感染试验、电镜观察等手段,对大黄鱼溃疡病的致病菌进行了研究,并分析了致病菌的胞外产物,进行了药物抑菌试验,以期为大黄鱼病害的防治提供科学依据。

    病鱼取自浙江宁波象山和温州洞头养殖海区,健康鱼取自浙江宁波奉化养殖海区。

    取症状典型的濒死病鱼,无菌条件下从病鱼肝、肾、脾等组织取样,划线接种于普通营养琼脂培养基、IP培养基[1]和TCBS培养基上,27℃恒温培养24 h后,挑取形态特征一致的优势菌落进行克隆培养,转接斜面保存备用。

    按照常见细菌系统鉴定手册[2]、伯杰细菌鉴定手册(第9版)[3]的方法进行细菌学鉴定。

    用60 cm×50 cm×40 cm水体的玻璃缸,每缸放养体长15~20 cm的健康大黄鱼10尾,连续充气,暂养1 d后进行感染试验。试验菌株培养18~24 h,菌悬液浓度按McF浊度管结合活菌计数方法确定。

    将培养好的菌株以无菌生理盐水制成浓度为7.51×107 CFU · mL-1的菌悬液,以肌肉注射(0.3 mL · 尾-1)的方法进行人工感染试验。对照组注射等量无菌生理盐水。

    以无菌针头对试验鱼体进行穿刺、刮鳞创伤,然后置于试验菌浓度为7.51×104 CFU · mL-1的海水中,对照组不加菌液。

    以体表无损伤的健康大黄鱼进行,置于试验菌浓度为7.51×104 CFU ·mL-1的海水中,对照组不加菌液。

    挑取单菌落接种于IP斜面活化24 h,用磷酸盐缓冲液(PBS)pH 7.0洗下,取菌悬液涂于同样的平板培养基上,25℃培养24 h,每皿中加入PBS 5 mL将菌洗入无菌三角瓶中,磁力搅拌器搅拌30 min,4℃,12 000 rpm离心20 min除去菌体,上清液经孔径0.22 μm的纤维素膜过滤,滤液置4℃冰箱保存备用。胞外产物活性分析采用杯碟法进行[4]

    在IP固体培养基上以纸片法测定病原菌对不同药物的敏感性,经28℃恒温培养24 h,观察抑菌圈的有无及大小。药敏纸片(直径6 mm)购自上海疾病控制中心。

    15种中草药均为市售,按照文献[5]制成中药原汁(W/V)。将培养24 h的病原菌以无菌生理盐水制成菌悬液(约107 CFU · mL-1),取0.1 mL菌液于无菌平皿中,将IP培养基灭菌冷却后加入不同体积药液倒入含菌平皿制成平板,25℃恒温培养24 h,观察计数细菌生长情况,能够完全抑制细菌生长的最大稀释度即为该药的最小抑菌浓度(MIC)。继续培养48 h,以无菌生长的最低浓度为最小杀菌浓度(MBC)。

    患病大黄鱼前期症状不明显。中后期主要症状为:鱼体表脱鳞、溃疡,吻部充血,有的鱼吻部断裂,烂鳍、烂尾;解剖后可见肝肿大,有块状斑,略带土黄色;肾肿;肠空,无食物,有少量液体,肠壁无充血。

    在典型的发病网箱内,从出现少量病鱼到大部分发病死亡历时约1周,发病死亡率一般为20%~60%。流行时间以夏季高温期为主,7~8月份为高峰期。发病范围大,感染率高,鱼种和成鱼均能感染发病。在同一养殖海区当年鱼种比2龄以上成鱼更易发病,死亡率明显偏高。

    从患病大黄鱼体内分离到1株优势菌824-1进行人工感染试验,结果见表 1。菌株824-1对健康鱼的肌肉注射感染和创伤浸泡感染的死亡率均为100%,但单纯浸泡感染不能使健康鱼发病。健康鱼经人工感染后出现的症状与自然发病鱼症状基本一致。从发病鱼的血液、肾等处可分离到与试验菌株形态特征、理化性状完全一致的菌株,表明分离菌株是大黄鱼的致病菌。

    表  1  人工感染试验结果
    Table  1.  Results of artificial infection test
    感染方式
    method of infection
    菌液浓度/CFU·mL-1
    bacterial concentration
    注射量/mL
    injection volume
    试验数/尾
    total number of
    fish challenged
    累计死亡数/尾
    number of mortality
    死亡率/%
    mortality rate
    肌肉注射
    intramuscular injection
    7.51×107 0.3 10 10 100
    对照(生理盐水) 0.3 10 0 0
    创伤浸泡
    injured immersion
    7.51×104 - 10 10 100
    对照(海水) - 10 0 0
    单纯浸泡
    immersion
    7.51×104 - 10 0 0
    对照(海水) - 10 0 0
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    菌株824-1的基本特征为革兰氏阴性短杆菌,菌体直或稍弯曲,两端钝圆,单个。极生单鞭毛,具运动性,无荚膜,无芽孢。在IP培养基上27℃培养24 h菌体大小为(0.6~0.9)μm×(1.2~1.5)μm,菌落直径为2 mm左右。圆形白色透明隆起,周缘光滑,无色素。TCBS培养基上呈黄色圆形菌落,表面光滑。根据菌株824-1的生理生化反应(表 2),该菌株应归属于弧菌属中的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)[2-3]

    表  2  分离菌株的生理生化特性
    Table  2.  Physiological and biochemical characteristics of the isolated bacterium
    鉴定项目item 824-1 鉴定项目item 824-1 鉴定项目item 824-1 鉴定项目item 824-1
    4℃生长
    4℃ growth
    甲基红
    MR
    柠檬酸盐利用
    utilization of itrate
    甘露糖
    mannose
    +
    43℃生长
    43℃ growth
    + V.P. + 液化明胶
    liquefying glutin
    + 纤维二糖
    cellobiose
    +
    0%NaCl生长
    0%NaCl growth
    产硫化氢
    produce H2S
    水解淀粉
    hydrolyzing amylum
    + 阿拉伯糖
    Arabinose
    6%NaCl生长
    6%NaCl growth
    + 产氨
    produce NH3
    葡萄糖产酸
    produce acid of glucose
    + 麦芽糖
    maltose
    +
    10%NaCl生长
    10%NaCl growth
    + 赖氨酸脱羧酶
    lysine decarbxylase
    + 葡萄糖产气
    produce gas of glucose
    半乳糖
    galactose
    +
    0/129(10μg) + 精氨酸双水解酶
    arginine dihydrolase
    肌醇
    inositol
    鼠李糖
    rhamnose
    0/129(150μg) + 鸟氨酸脱羧酶
    ornithine decarbxylase
    + 山梨醇
    sorbitol
    甘露醇
    mannitol
    +
    氧化酶
    oxidase
    + 脲酶
    urease
    蔗糖
    sucrose
    + 密二糖
    melibiose
    接触酶
    catalase
    + β-半乳糖甙酶
    ONPG
    乳糖
    lactose
    苦杏仁甙
    amygdalin
    +
    吲哚
    indole
    + 硝酸盐还原
    nitrate deoxidizing
    + 果糖
    fructose
    +
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    以杯碟法测定溶藻弧菌胞外产物的酶活性表明(表 3),该细菌的胞外产物具有明胶酶、淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶、卵磷脂酶、几丁质酶等多种酶活性,但没有脲酶活性。相同体积的胞外产物提取液中,淀粉酶、明胶酶的活性最高;其次是酪蛋白酶;脂肪酶、卵磷脂酶和几丁质酶的活性较低。另外,该菌株对兔红细胞具有一定的溶解能力以及溶血活性。

    表  3  溶藻弧菌胞外产物的酶活性
    Table  3.  The enzymatic activities of ECP of V.alginolyticus
    胞外产物
    ECP
    明胶酶
    gelatinase
    淀粉酶
    amylase
    酪蛋白酶
    casease
    脂肪酶
    lipase
    卵磷脂酶
    lecithinase
    几丁质酶
    chitinase
    脲酶
    urease
    溶血活性
    haemolysin
    活性
    ECP activity
    +++ +++ ++ + + + - +
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    药敏实验结果见表 4。20种化学药物中,有13种对病原菌具有明显抑制作用,其中以复方新诺明、磺胺+TMP、庆大霉素等3种药物的抑菌作用较强,妥布霉素、多粘菌素等次之,而以前水产养殖中常用的四环素等药物对此病原菌无抑菌作用或不明显,提示病原菌对其可能已具有抗性。

    表  4  不同药物对菌株824-1的抑菌作用
    Table  4.  The activities of the 20 antimicrobial agents on strain 824-1
    药品
    antimicrobial agent
    含药量/μg或
    IU·片-1
    content
    抑菌圈直径/mm
    inhibitory ring
    diameter
    药品
    antimicrobial agent
    含药量/μg或
    IU·片-1
    content
    抑菌圈直径/mm
    inhibitory ring
    diameter
    阿莫西林
    moxycillin
    10 0 磺胺+TMP
    sulfarmehoxazole/TMP
    25 25
    新生霉素
    neomycin
    30 10 卡那霉素
    kanamycin
    30 16
    氟哌酸
    norfloxacin
    10 10 麦迪霉素
    midecamycin
    30 0
    庆大霉素
    gentamycin
    10 20 丁胺卡那霉素
    amikacin
    30 15
    吡哌酸
    pipemidic acid
    30 12 头孢孟多
    cefamandole
    30 16
    青霉素G
    penicillin G
    10 0 妥布霉素
    tobradistin
    10 17
    强力霉素
    doxycycline
    30 12 链霉素streptomycin 10 14
    克林霉素
    clindamycin
    2 0 四环素tetracycline 30 0
    多粘菌素
    polymycin
    300 15 氨苄青霉素
    ampicillin
    10 0
    复方新诺明
    Co. SMZ
    25 26 磺胺甲基异噁唑
    sulfamethoxazole
    10 0
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    15种中草药对病原菌824-1菌株的抑菌效果见表 5。不同药物对病原菌的抑制作用相差较大,其中以石榴皮、地榆、五味子、大黄等4种药物的抑菌能力最强,其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为1∶ 640、1∶ 640、1∶ 320、1∶320和1∶ 320、1∶ 160、1∶ 160、1∶ 160。乌梅、公丁香、连翘、板蓝根等也有较强的抑菌作用;而大青叶、木瓜、威灵仙、地丁等只有在较高浓度时才有抑菌作用。

    表  5  中草药对824-1菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)
    Table  5.  MICs and MBCs of the eater extracts of Chinese herbal medicines evaluated
    药名CHM MIC MBC 药名CHM MIC MBC 药名CHM MIC MBC
    乌梅
    Fructus prunusis
    1∶160 1∶80 大黄
    Rheum officinale
    1∶320 1∶160 木瓜
    Fructus chaenomelesis
    1∶20 1∶20
    黄芩
    Radix scutellariae
    1∶80 1∶40 白芍
    Rhizoma paeoniae
    1∶20 1∶20 威灵仙
    Radix clematidis
    1∶10 1∶10
    地榆
    Rhizoma sanguisorbae
    1∶640 1∶160 大青叶
    Folium polygoni
    1∶20 1∶10 地丁
    Corydalis bungeana
    1∶10 1∶5
    石榴皮
    Pericarpium granati
    1∶640 1∶320 五味子
    Fructus schizandrae
    1∶320 1∶160 黄芪
    Radix astragalus
    1∶20 1∶20
    公丁香
    Flos caryophyllum
    1∶160 1∶80 连翘
    Fructus forsythiae
    1∶160 1∶160 板蓝根
    Rhizoma isatidis
    1∶160 1∶80
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    菌株824-1的生理生化特性虽然与文献上对溶藻弧菌的描述略有差异,文献上溶藻弧菌能利用柠檬酸盐[2-3],而分离菌株却对柠檬酸盐不利用。推测其原因与同一种菌内不同个体之间的差异有关。按照细菌学分类原理,这种微小差异并不影响该种的分类地位的确立。另外,根据全自动细菌鉴定仪VITEK32的鉴定结果,分离菌株归属于溶藻弧菌的可信度在92%以上,因此可将分离菌株鉴定为溶藻弧菌(Vibrio aiginolyticus)。

    溶藻弧菌广泛存在于自然海区的海水中,是一种条件致病菌,能引起海水鱼类、贝类、对虾[6-8]等发生疾病,但其致病性取决于宿主的健康状况、环境条件、海水中细菌数量、海水的理化物质等因素。

    人工感染试验结果表明,溶藻弧菌对大黄鱼的致病途径不是经口,可能是鱼体受伤后,菌体通过创伤面进入体内,产生毒素,使病灶出血溃烂,造成死亡。对病原菌胞外产物的研究表明,其胞外产物含脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、明胶酶及溶血因子等成分,这与以往的报道基本一致[9]。由于淀粉酶有分解糖原的作用;明胶酶、酪蛋白酶等能分解胶原等蛋白成分;脂肪酶可分解脂类;而溶血因子又能使大黄鱼的血细胞溶解,所以推测胞外产物在溶藻弧菌侵染大黄鱼的过程中起到了一定的作用。因此,在夏季高水温期时,养殖海域中弧菌大量增殖,而由于网箱养殖密度过高,鱼碰撞受伤的机率大大增加,同时还由于寄生虫造成鱼体表损伤,继发细菌感染,进一步导致鱼体受多种因素的侵害而死亡。

    药敏试验结果表明,病原菌对复方新诺明、磺胺+TMP、庆大霉素等3种药物较为敏感,可从中进一步筛选预防和治疗药物。

    中草药抑菌试验表明,所使用的15种中草药对溶藻弧菌均有不同程度的抑制作用,其中石榴皮、地榆、五味子、大黄等4种药物的抑菌作用尤其显著。

    由于抗菌药的大量使用,不但会提高病原菌的抗药性,还可能因为药物残留导致水产品质量安全下降,而中草药具有低毒、低残留、副作用小、不易产生抗药性等特点,且药中某些成分既有抗菌作用,又有免疫作用,能改善机体的免疫状态,提高自身抗菌能力[10],因此,可将上述中草药配制成抗病药物饵料来代替抗生素应用于海水网箱大黄鱼养殖生产。

  • 图  1   滤纸片法筛选结果

    Figure  1.   Screening result by filter paper method

    图  2   菌株DC13和RS5上清液与C6-HSL孵育后的β-gal活性

    不同字母表示差异显著(P<0.05);后图同此

    Figure  2.   β-gal activity in supernatant of strain DC13 and RS5 co-cultured with C6-HSL

    Different letters indicate significant difference (P<0.05). The same case in the following figures.

    图  3   菌株DC13、RS5及在GenBank中与其相关种属以16S rRNA基因为基础构建的进化树

    分支点上的数字表示构建系统树时1 000次计算时形成该节点的百分比;括号内数值为GenBank登录号;标尺或刻度0.02或0.005代表2%或0.5%的16S rRNA基因序列的进化差异

    Figure  3.   Phylogenetic analysis of strain DC13 and RS5 based on 16S rRNA gene sequence

    The bootstrap values (%) presented at the branches were calculated from 1 000 replications; numbers in parentheses are GenBank accession numbers; the scale bar 0.02 or 0.005 represents 20 or 5 nucleotide substitutions per 1 000 nucleotides.

    图  4   菌株DC13 (A)和RS5 (B)在不同C6-HSL质量浓度条件下的生长

    Figure  4.   Growth of strain DC13 (A) and RS5 (B) at different C6-HSL mass concentrations

    图  5   菌株DC13 (A) 和RS5 (B) 不同培养时间上清液与C6-HSL孵育后β-gal活力

    Figure  5.   β-gal activity of C6-HSL cultured with supernatant of strain DC13 (A) and RS5 (B) at different culture time

    图  6   菌株DC13 (A) 和RS5 (B) 不同培养盐度上清液与C6-HSL孵育后β-gal活力

    Figure  6.   β-gal activity of C6-HSL culture with supernatant of strain DC13 (A) and RS5 (B) at different salinities

    图  7   菌株DC13和RS5粗提物与坎氏弧菌共培养后,坎氏弧菌菌体中toxR (A)和tlh (B)绝对表达量

    V.campbellii组为对照组

    Figure  7.   Absolute expression quantity of toxR (A) and tlh (B) in V.campbellii after being cultured with extracellular products of strain DC13 and RS5

    V.campbellii group is the control group.

    表  1   引物序列设计

    Table  1   Primer sequence design

    基因
    gene
    产物大小/bp
    product size
    上游引物
    forward
    下游引物
    reverse
    toxR1425′-CCGAAGCTACCACAGAAACG-3′5′-CAGACTGGCAGCAGCAAAG-3′
    tlh1935′-ACGGGTTTGTATGGACAGAAT-3′5′-AACTCAAGGGTGAACAGGGTA-3′
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-06-17
  • 修回日期:  2017-08-20
  • 录用日期:  2017-09-17
  • 网络出版日期:  2019-01-07
  • 刊出日期:  2018-02-06

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