九孔鲍（Haliotis diversicolor supertexta）系杂色鲍的亚种，隶属于软体动物门、腹足纲，主要分布于中国广东、台湾等沿海地区，因其肉质鲜美、营养价值高，被誉为海产八珍之一^[1]。20世纪70年代，中国开始对九孔鲍进行人工育苗，并开展了工厂化养殖，九孔鲍迅速成为中国南方地区重要的养殖品种^[2]。随着九孔鲍养殖产业不断扩大，对鲍产量要求逐年增高，越来越多的养殖户开始在单位面积内追求利益最大化，对九孔鲍进行高密度养殖。九孔鲍高密度养殖最终导致鲍间近亲繁育现象加重，个体大小分化显著，而小个体九孔鲍则给鲍养殖产业造成巨大的经济损失，严重制约了中国九孔鲍产业的发展^[3-5]。针对九孔鲍生长差异问题，诸多学者从不同角度出发进行了研究，如蒋湘等^[5]、胡志国等^[6]从遗传育种方面研究了不同群体及家系间九孔鲍生长性能差异及遗传力；MGAYA和MERCER^[3]、HUANG等^[7]、ZHOU等^[8]从养殖环境方面探讨了影响九孔鲍生长的诸多因素。但从基因表达水平方面分析九孔鲍生长差异的研究至今未见报道。

在水生动物中，α-淀粉酶作为一种重要的消化酶，主要在碳水化合物代谢、营养消化吸收等方面起至关重要的作用。因此众多水产工作者对α-淀粉酶生化特性以及分子特性展开广泛研究。目前在长牡蛎（Crassostrea gigas）^[9]、欧洲鸟尾蛤（Cerastoderma edule）^[10]、盘鲍（Haliotis discus discus）^[11]、河豚（Siganus canaliculatus）^[12]、尖吻鲈（Lates calcarifer）^[13]等水生动物中已成功克隆出α-淀粉酶基因部分序列。对α-淀粉酶基因结构进行深入研究发现，它不仅能够影响水生动物消化，而且与水生动物生长具有显著相关性^[14]。研究表明，2个不同地理群体长牡蛎的α-淀粉酶基因结构存在显著差异，并筛选出与生长性状显著相关的差异位点^[15]。此外，在对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）^[16]、合浦珠母贝（Pinctada martensii）^[17]研究中，均发现α-淀粉酶基因中存在与其生长显著相关的单核苷酸多态性位点。以上研究均从α-淀粉酶基因结构来探究与水生生物生长相关性，而从α-淀粉酶基因表达上分析与生长性状相关的研究尚未见报道。有研究表明，生长相关基因表达量的差异会对水生动物生长产生影响^[18-19]，因此，笔者克隆了九孔鲍α-淀粉酶基因并分析其组织表达，同时探究九孔鲍α-淀粉酶基因表达与生长性状的相关性，以为阐述九孔鲍生长差异的分子调控机制提供基础数据。九孔鲍α-淀粉酶基因克隆分析，可为单核苷酸多态性位点的筛选与生长性状的关联分析奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

实验所用九孔鲍来自于汕尾市某水产公司，随机挑选10枚活力旺盛的九孔鲍，平均壳长（43.51±4.16）mm，平均体质量（11.62±2.32）g，暂养于26 ℃海水，7 d后取其胃保存于RNAhold，用于α-淀粉酶基因cDNA全长克隆，同时取九孔鲍右侧壳肌、肠、肝脏、胃、外套膜、吻、腹足7种组织用于组织表达分析。在同一家系九孔鲍中，选取体质量超过家系平均体质量的前10%个体作为大个体群体（big group），将低于家系平均体质量的后10%个体作为小个体群体（small group），分别从2个群体中随机抽取30枚鲍进行生长指标测定，然后提取每个个体RNA，进行实时荧光定量PCR，将基因表达量数据与九孔鲍2个群体生长数据进行相关性分析。

1.2   引物设计

参照李璐^[17]的方法，从NCBI中查找出盘鲍（EF103353.1）、长牡蛎（AJ496605.1）、合浦珠母贝（JX683680.1）等与九孔鲍相近物种的淀粉酶基因序列，并对淀粉酶基因进行比对，找出序列的保守区，用Primer 6.0设计出九孔鲍α-淀粉酶基因中间片段扩增引物AMY(s)、AMY(a)；根据克隆出的α-淀粉酶基因中间片段序列，设计出5′和3′末端扩增所需的特异引物（5′Race、3′Race）以及通用引物（UPM）；根据九孔鲍α-淀粉酶基因的开放阅读框，设计出用于检测组织表达所需的荧光定量特异引物qRT-AMY(s)、qRT-AMY(a)，同时选用九孔鲍β-actin基因作为内参基因，设计内参引物β-actin(s)、β-actin(a)。引物序列见表 1。

表  1  九孔鲍α-淀粉酶基因全长克隆及实时荧光定量表达中所有引物序列

Table  1.  Full length cloning of alpha-amylase gene of H.diversicolor supertexta and sequence of all primers in real time qPCR

引物primer	序列sequence
AMY(s)	GTTTGTCCGAGTGATGAGTAGTTATTT
AMY(a)	ACTATTGGTTCCTCGTTGTTGCT
5′Race	GATTACGCCAAGCTTAGCCATTTCCGCACGAACCATCTCC
3′Race	GATTACGCCAAGCTTACAGTGGATGGCTCAGGAAATGCTC
UPM	TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
qRT-AMY(s)	ATGGTAGCGTTCAGGAATGCCGTAG
qRT-AMY(a)	GGGAGCCCTGTTTGGAATGTTTGAT
β-actin(s)	CCATCCAGGCTGTTCTGTCTC
β-actin(a)	GCGGTGGTGGTGAATGAGTAA

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1.3   总RNA提取以及cDNA合成

参照Trizol试剂（全式金）使用说明提取各组织RNA，然后采用核酸定量的方法对提取出的RNA进行纯度及浓度的检测。以总RNA为模板反转录为cDNA，反应体系为500 ng RNA，1 μL Oligo-dT（0.5 μg·μL^-1），10 μL 2×ES Reaction Mix，1 μL EasyScript Enzyme Mix，1 μL gDNA Remover，加RNase-free H₂O至20 μL。然后将混合溶液于42 ℃孵育反转录30 min，85 ℃加热5 s，最后4 ℃保存备用。

1.4   九孔鲍α-淀粉酶基因cDNA全长克隆

以反转录获得的cDNA为模板，采用引物AMY(s)、AMY(a)对序列进行扩增，反应体系为25 μL，其中包括2.5 μL 10×PCR Buffer（Mg²⁺ Plus），2 μL dNTP（2.5 mmol·L^-1），2 μL cDNA，2 μL上游引物，2 μL下游引物，0.2 μL rTaq酶，14.3 μL ddH₂O。反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min。将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用TaKaRa凝胶回收试剂盒对目的片段进行回收，以pMD-19T为载体连接目的片段，并导入感受态细胞中，进行阳性菌落PCR后，筛选出阳性菌送上海生工进行测序，获得cDNA中间片段。

采用特异引物（5′Race、3′Race）以及通用引物（UPM）进行5′RACE和3′RACE。5′和3′末端序列克隆采用Clontech公司的Smarter RACE 5′/3′Kit。反应体系及反应条件参照试剂盒说明。然后将扩增获得的末端序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将回收产物与质粒连接，导入感受态细胞中，筛选阳性菌落送往上海生工进行测序，即获得3′和5′末端序列。利用DNAman 6.0将α-淀粉酶基因中间片段、5′和3′末端序列进行拼接，获得cDNA序列全长。

1.5   α-淀粉酶mRNA的组织表达分析

以九孔鲍右侧壳肌、肠、肝脏、胃、外套膜、吻、腹足7种组织提取的RNA为模板，稀释相同倍数后反转录为cDNA，由于反转录过程已经去除基因组DNA，因此可直接用该cDNA进行荧光定量PCR扩增。采用九孔鲍β-actin基因作为内参，扩增引物为β-actin(s)、β-actin(a)。目的基因扩增引物为qRT-AMY(s)、qRT-AMY(a)。荧光定量PCR采用全式金的TransStart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒，每个样品设置3个重复。反应体系参照试剂盒说明书，反应条件为94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，58 ℃ 34 s，72 ℃ 10 s，40个循环。荧光信号采集设置为退火步骤进行采集。

1.6   数据处理

1.6.1   α-淀粉酶基因cDNA序列生物信息学分析

将拼接获得的cDNA序列在NCBI上进行Blastp比对，鉴定该序列全长为α-淀粉酶基因。使用ORF在线分析软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）对获得的cDNA序列进行开放阅读框分析，并采用DNAstar对cDNA所编码的氨基酸序列以及理化性质进行分析。利用SingalP 4.1分析α-淀粉酶基因信号肽结构。最后使用SMART软件分析α-淀粉酶蛋白结构域。利用Clustal X和MEGA 4.0软件，分析九孔鲍α-淀粉酶氨基酸序列与相近物种淀粉酶氨基酸序列同源性，并采用邻接法（NJ法）构建九孔鲍α-淀粉酶氨基酸系统进化树。

1.6.2   生长相关性分析

采用相对定量法（2^-ΔΔCt法）^[20]，计算大个体群体和小个体群体中α-淀粉酶基因mRNA相对表达水平，然后用SPSS 17.0进行基因表达水平与生长性状相关性分析，P<0.05为差异显著。

2.   结果

2.1   九孔鲍α-淀粉酶基因cDNA序列克隆及生物信息学分析

由九孔鲍总RNA琼脂糖凝胶电泳检测结果可知，提取的九孔鲍总RNA具有较为清晰的2条亮带，其中位于1 000~2 000 bp的片段为28S，750 bp左右片段为18S，且18S片段亮度为28S片段亮度的2倍左右，与大多数脊椎动物情况相反，但与合浦珠母贝^[17]等无脊椎贝类情况相同。经过检测提取的总RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8~2.0，因此可用于九孔鲍α-淀粉酶基因cDNA全长克隆以及组织表达等后续实验。

九孔鲍α-淀粉酶基因中间片段长为362 bp，3′非编码区（UTR）片段长为820 bp，且具有较为明显的连续PloyA结构，通过特异性扩增，获得5′UTR片段长为1 179 bp。通过DNAman将3个序列进行拼接，获得九孔鲍α-淀粉酶基因cDNA全长为2 260 bp。对九孔鲍α-淀粉酶基因序列全长分析发现，开放阅读框的长度为2 088 bp，编码695个氨基酸，起始密码子ATG位于69~71 bp，终止密码子TAA位于2 154~2 156 bp（图 1）。采用ProtParam软件对编码蛋白进行推测，其分子量为75.74 kD，等电点为6.12，携带负电荷的氨基酸残基（Asp+Glu）68个，正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）58个。对α-淀粉酶进行信号肽预测发现，该多肽链具有信号肽结构，且信号肽是由18个氨基酸（MWAQYGIVSALLVLSASA）组成，因此该蛋白为分泌蛋白。对蛋白结构域分析表明，α-淀粉酶存在domain A、domain C 2个结构域，其中domain A（Glu29~Arg393）由8个α蛋白和8个β蛋白构成桶状结构（TIM桶）；domain C（Glu402~Thr466）是由β折叠组成。α-淀粉酶蛋白二级结构预测结果显示，该蛋白中α螺旋占18.42%，β转角占10.94%，无规则卷曲占43.60%，延伸链占27.05%（图 2-A），在domain A中第28~第396个氨基酸构成淀粉酶的催化中心。采用SWISS-MODLE同源建模法，将α-淀粉酶蛋白序列与搜索到的模板进行匹配，推导出九孔鲍α-淀粉酶蛋白三级空间结构（图 2-B）。

图  1  α-淀粉酶cDNA全长及推测氨基酸序列

下划线表示蛋白结构域A；方框表示蛋白结构域C；阴影部分表示启动子或终止子

Figure  1.  Full-length of alpha-amylase cDNA and amino acid sequence

Underlines indicate domain A; boxes indicate domain C; shadows indicate premoter or terminator.

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图  2  九孔鲍α-淀粉酶二级结构（A）和三级结构预测（B）

Figure  2.  Prediction of alpha-amylase secondary structure (A) and tertiary structure (B) in H.diversicolor supertexta

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九孔鲍α-淀粉酶与其他物种同源性分析结果表明，九孔鲍α-淀粉酶与皱纹盘鲍（H.discus hannai）、盘鲍同源性最高（均为87.9%）；与草鱼（Ctenopharyngodon idella）的同源性最低（44.5%）。九孔鲍与其他物种同源性在40%~65%（表 2）。

表  2  九孔鲍α-淀粉酶同源性分析

Table  2.  Alpha-amylase homology analysis of H.diversicolor supertexta

物种species	同源性/% homology
九孔鲍（H.diversicolor supertexta）	100
皱纹盘鲍（H.discus hannai）	87.9	100
盘鲍（H.discus discus）	87.9	100	100
合浦珠母贝（Pinctada fucata）	46.7	46.9	46.9	100
长牡蛎（Crassostrea gigas）	64.7	67.6	67.6	50.5	100
海蜗牛（Janthina janthina）	45.7	45.9	45.9	63.1	47.6	100
草鱼（Ctenopharyngodon idellus）	44.5	44.5	44.5	56.0	45.8	53.1	100
黄斑篮子（Siganus canaliculatus）	45.4	45.8	45.8	57.8	47.5	55.5	76.0	100
小鼠（Mus musculus）	48.1	47.9	47.9	58.4	50.2	56.1	70.3	72.0	100
山羊（Capra hircus）	49.4	49.2	49.2	59.2	51.0	54.1	72.4	73.4	82.2	100
人（Homo sapiens）	48.7	48.7	48.7	58.0	50.4	55.1	69.5	72.2	84.3	87.1	100

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2.2   九孔鲍α-淀粉酶基因的组织表达分析

对九孔鲍α-淀粉酶基因进行组织表达分析可知，α-淀粉酶基因在九孔鲍右侧壳肌、肠、肝脏、胃、外套膜、吻、腹足7种组织中均不同程度表达（图 3）。其中九孔鲍胃中α-淀粉酶表达量最高（326.803），为α-淀粉酶在肝脏中表达量的9.68倍，为外套膜中表达量的933.72倍。经ANOVA分析可知，胃、肠、肝脏中α-淀粉酶表达与其余4种组织间差异达显著水平（P<0.05）；吻、腹足、右侧壳肌中α-淀粉酶表达量差异不显著（P>0.05），且均属低水平表达。

图  3  α-淀粉酶基因不同组织表达

AM.右侧壳肌；I.肠；DG.肝脏；S.胃；M.外套膜；R.吻；G.腹足；*.差异显著；**.差异极显著

Figure  3.  Expression of alpha-amylase gene in different tissues

AM. adductor muscle; I. intestine; DG. digestive gland; S. stomach; M. mantle; R. rostral; G. foot; *. significant difference; **. very significant difference

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2.3   α-淀粉酶基因表达量与生长相关性分析

对同一家系九孔鲍的2个群体生长性状进行测量（表 3），结果发现，2个群体间九孔鲍在壳长、壳宽及体质量方面具有显著差异（P<0.05）。将九孔鲍生长性状与α-淀粉酶基因表达量进行相关性分析（表 4），结果发现α-淀粉酶基因mRNA表达量与生长性状具有显著相关性（P<0.05），且为正相关。α-淀粉酶基因基因表达量与壳长、壳宽、体质量相关系数分别为0.888、0.846、0.838。

表  3  九孔鲍2个群体生长性状测定

Table  3.  Results of growth traits in two groups of H.diversicolor supertexta

	壳长/mm shell length	壳宽/mm shell width	体质量/g body mass	基因表达量 gene expression
大个体群体big group	30.73±1.82a	22.88±1.24a	4.23±0.30a	27.40±0.83a
小个体群体small group	20.30±2.28b	15.67±1.37b	3.23±0.17b	19.92±1.22b
注：同列不同上标字母表示差异显著（P<0.05） Note：Values with different superscripts in the same column indicate significant difference（P<0.05）.

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表  4  九孔鲍α-淀粉酶基因表达量与生长性状的相关性

Table  4.  Correlation between alpha-amylase gene expression and growth traits for H.diversicolor supertexta

生长性状 growth trait	相关系数 correlation coefficient
壳长shell length	0.888**
壳宽shell width	0.846**
体质量body mass	0.838**
注：**代表差异极显著（P<0.01） Note：** indicates very significant difference（P<0.01）.

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3.   讨论

文章克隆了九孔鲍胃组织α-淀粉酶基因cDNA全长，该序列全长为2 260 bp，其中开放阅读框长度为2 088 bp，编码氨基酸695个。通过比较发现，九孔鲍α-淀粉酶基因全长以及编码氨基酸数目均大于盘鲍^[11]、合浦珠母贝^[21]、黄斑篮子鱼（Siganus canaliculatus）^[22]、美洲拟鲽（Pleuronectes americanus）^[23]等多种水生动物。此外，九孔鲍α-淀粉酶信号肽序列长度为18个氨基酸，与大珠母贝（P.maxima）^[24]、企鹅珍珠贝（Pteria penguin）^[24]、合浦珠母贝^[17]、盘鲍^[11]α-淀粉酶信号肽序列长度存在显著差异，并且长度大于胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticus Bleeker）、斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）、人类（Homo sapiens）等脊椎动物淀粉酶中信号肽序列。对九孔鲍α-淀粉酶蛋白进行三级结构分析发现，其中domain A中含有TIM桶状蛋白，此结论与鳜（Siniperca chuatsi）、人类以及植物中的研究结果一致^[25-27]，表明TIM桶状蛋白具有高度保守性，因此可将domain A用于不同物种间的蛋白标记，为遗传育种提供可靠的蛋白标记位点。由于各物种间α-淀粉酶基因的功能极为相似，因此在基因结构上存在一定的同源性，该研究发现九孔鲍与皱纹盘鲍、盘鲍的同源性最高（87.9%），而与草鱼同源性最低(44.5%)。因此以后针对九孔鲍基因研究，可以选择皱纹盘鲍作为参照。

对九孔鲍α-淀粉酶进行组织表达特征分析发现，不同组织中的表达量存在差异（P<0.05）。α-淀粉酶基因在九孔鲍右侧壳肌、肠、肝脏、胃、外套膜、吻、腹足7种组织中均有不同程度表达。其中胃、肝脏、肠3种组织中淀粉酶基因表达量相对较高，而其他组织中的表达量较低，说明α-淀粉酶基因与生物体消化功能密切相关，在消化组织中淀粉酶基因表达量远大于非消化组织^{[11, 28]}。九孔鲍肠、胃是消化食物主要场所，可将食物中淀粉消化分解为小分子物质，而肝脏作为消化液主要分泌器官，可分泌多种水解酶，故肠、胃、肝脏3个组织中的α-淀粉酶基因表达量较高。九孔鲍α-淀粉基因在右侧壳肌、吻、外套膜、腹足中也有微量表达，推测原因可能为九孔鲍α-淀粉酶是一种诱导酶，在摄食过程中，腹足、吻、外套膜参与食物的附着、摄取，α-淀粉酶基因被诱导表达，但由于以上组织并不直接参与食物消化，因此α-淀粉酶基因仅微量表达^[29]。研究表明，α-淀粉酶基因在盘鲍^[11]、长牡蛎^[14]、草鱼^[29]、胭脂鱼^[30]的消化组织中大量表达，非消化组织中微量表达，与此实验研究结果一致。相反，对大珠母贝的研究发现淀粉酶基因只在肝胰脏中表达，在其他组织中并不表达^[24]，这与此研究结果存在差异，其原因可能是实验过程中所选取的内参基因不同，分析出的表达量存在差异。

该研究发现，在相同环境下，同种家系九孔鲍在壳长、壳宽及体质量方面具有显著差异（P<0.05），表明虽然家系基因型相同，但存在某种变量导致九孔鲍个体间存在显著差异。将九孔鲍生长性状与α-淀粉酶基因表达量进行相关性分析发现，α-淀粉酶基因表达与生长性状具有显著相关性（P<0.05），且为正相关，表明α-淀粉酶基因表达高低可直接影响九孔鲍生长性状，且个体越大，其α-淀粉酶基因表达量越高。原因可能是生长速度快的个体所需能量高于生长速度慢的个体，在食物充足情况下，为获取更多能量，生长速度快的个体所需α-淀粉酶量多，因此基因表达量高，相反生长速度慢的个体表达量较低。研究表明，α-淀粉酶活性与鳙（Aristichthys nobilis）的体长、体质量等生长指标呈显著正相关^[31]；对日本沼虾（Macrobrachium nipponense）的研究显示，随着日本沼虾生长发育，α-淀粉酶活性逐渐增强，α-淀粉酶与对虾生长显著相关^[32]。将以上研究结果与该研究结果结合，可以初步推测α-淀粉酶不仅可以通过调节基因表达量对水生动物生长产生影响，同时可以通过调节酶活性影响水生动物生长。