大亚湾鱼类深水网箱养殖对环境的影响

梁庆洋; 齐占会; 巩秀玉; 韩婷婷; 史荣君; 张文博; 谷阳光; 黄洪辉

doi:10.3969/j.issn.2095-0780.2017.05.004

大亚湾鱼类深水网箱养殖对环境的影响

1.
中国水产科学研究院南海水产研究所，广东省渔业生态环境重点实验室，农业部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东广州 510300
2.
上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306

基金项目:

国家重点基础研究发展计划(973计划)项目 2015CB452901

广东省科技计划项目 2016A020222024

中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助 2014A01YY03

国家重点基础研究发展计划(973计划)项目 2015CB4529004

中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助 2016YD02

广东省自然科学基金项目 2014A030310331

详细信息

作者简介:
梁庆洋(1992-)，男，硕士研究生，从事渔业生态环境研究。E-mail：kinyosan@163.com

通讯作者:
黄洪辉(1972-)，男，博士，研究员，从事海洋生态环境保护研究。E-mail：huanghh@scsfri.ac.cn

中图分类号: S955.9
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出版历程
- 收稿日期: 2017-02-23
- 修回日期: 2017-03-30
- 录用日期: 2017-04-11
- 刊出日期: 2017-10-04

Impact of deep-water net cage fish farming in Daya Bay, southern China on environment

1.
Guangdong Provincial Key Lab. of Fishery Ecology Environment; Key Lab. of South China Sea Fishery Resource Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture; South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China
2.
College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China

摘要

摘要:
2016年5月(养殖开始前)和2016年8月(养殖投饵高峰期)对大亚湾大碓鱼类深水网箱区、外围区(网箱外0.1 km)和非养殖区(网箱外10~15 km)的海水和沉积环境进行了调查，采用有机污染指数(A)法、营养状态质量指数(NQI)法对水环境进行评价，用潜在生态危害指数(RI)法对表层沉积物重金属潜在生态危害进行评价。结果显示，与传统网箱养殖化学需氧量(COD)由网箱区中心向四周递减的趋势不同，深水网箱养殖COD_Mn浓度在3个区域间无显著性差异。深水网箱养殖海域水质较好(A < 1)，水质处于贫营养水平(NQI < 2)。深水网箱养殖海域表层沉积物重金属铅(Pb)和锌(Zn)含量均符合第一类海洋沉积物质量标准，但铜(Cu)和镉(Cd)含量轻微超标。沉积环境处于轻微生态危害状态(E_rⁱ＜30，RI＜100)，与中国同类型海区相比，污染危害程度相对并不严重。深水网箱养鱼对周围海域环境的影响较小。
- 深水网箱养鱼 /
- 有机污染指数 /
- 营养状态质量指数 /
- 潜在生态危害指数 /
- 大亚湾
Abstract:
We investigated the seawater and sediments in a deep-water net cage area in Dadui, southwest Daya Bay, to assess the impact of farming activities on the ambient environment. The water and sediment samples were collected from cage culture area, surrounding area (located ca. 0.1 km from the nearest farming cage) and non-culture area (where no culture activities were practiced, located ca. 10~15 km from the nearest farming cage) in May (before the farming) and August 2016 (the most feeding activities and metabolism of cultured fish), respectively. The water environment was assessed using organic pollution index (A) and nutrient quality index (NQI), while the heavy metals potential ecological risk in surface sediment was assessed using potential ecological risk index (RI). The results show no significant difference of COD_Mn concentration among the three areas of deep-water net cage farming, while COD of the traditional cage farming showed a decreasing trend from the center to the surrounding of the cage area. The A value ( < 1) of cage culture area indicates that the water quality was in a general condition, and the relatively low NQI value ( < 2) indicates that the water quality was in a relatively poor nutrient condition. The contents of heavy metals in surface sediments of cage area were lower than the marine sediment quality standards ClassⅠexcept for those of Cu and Cd. The E_rⁱ value ( < 30) and RI value ( < 100) were relatively low, compared with many other culture areas in China, which indicates that the surface sedimentary environment of deep-water net cage area in Daya Bay is in slight ecological harm. It is suggested that the influence of deep-water net cage fish farming on the ambient water and sedimentary environment is relatively low or acceptable.
- deep-water net cage fish farming /
- organic pollution index /
- nutrient quality index /
- potential ecological risk index /
- Daya Bay

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鳜(Siniperca chuatsi)是中国重要的名特优养殖品种之一，近年来细菌病、病毒病的发生严重影响其产量，其中烂鳃病是危害鳜的主要细菌病之一。细菌性烂鳃病是危害中国淡水养殖鱼类最常见的疾病之一，其病原主要包括柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)^[1-2]和约氏黄杆菌(F.johnsoniae)^[3-5]等。黄杆菌几乎感染所有的淡水养殖品种，对中国主导淡水养殖品种如草鱼(Ctenopharyngodon idella)^[6-7]、鳜^[8-9]、大口黑鲈(Micropterus salmoides)^[10]等危害严重，死亡率最高可达50%。传统的抗菌药物治疗方法存在病原耐药性产生、药物残留等诸多弊端，而疫苗免疫是解决此类问题重要选择之一。美国在鱼类细菌性烂鳃病疫苗产业化方面走在世界前列，早在1997年柱状黄杆菌灭活疫苗(F.columnare Bacterin，Code 2974.00)批准上市，2009年柱状黄杆菌活疫苗(AquaVac-COL^®)和嗜冷黄杆菌(F.psychrophilum)灭活疫苗也先后批准上市。中国细菌性烂鳃病疫苗研究相对滞后，近年来对全菌灭活疫苗^[11-12]、基因工程灭活疫苗(即菌蜕疫苗)^[13]及重组亚单位疫苗^[14]开展了实验室研究，但尚未有相关产品进入产业化应用。

黄杆菌主要寄生在鱼体鳃组织、体表等处^[15-16]，而鱼类的皮肤、鳃和肠道及其表面黏膜所构成的黏膜相关免疫组织(mucosal-associated lymphoid tissue，MALT)是鱼体内环境和外环境之间的第一道防御屏障^[17]。因此，局部黏膜免疫在机体抗感染中发挥更为重要作用。而黄杆菌全菌灭活疫苗、亚单位疫苗等由于缺乏主动黏附能力，难以引发抵抗黄杆菌侵染的黏膜免疫应答，故其浸泡免疫效果不稳定，因此迫切需要开发新的浸泡型黄杆菌疫苗。弱毒疫苗由于能够模拟强毒株趋化、黏附、浸染宿主，引起机体强烈的黏膜免疫、细胞免疫，而成为浸泡疫苗研究的热点。LI等^[18]通过链霉素诱导获得约氏黄杆菌减毒株(M170株)，在鱼体上连续盲传5代未出现毒力恢复，将其制备疫苗免疫草鱼获得了良好的免疫保护效果。在此基础上，为了进一步探索该疫苗用于预防鳜烂鳃病的可行性，采用血清溶菌酶(Lys)、免疫球蛋白(IgM)、相对免疫保护率(relative percentage survival，RPS)等指标评价了鳜对约氏黄杆菌减毒株的免疫应答规律，为开发安全、高效的鳜约氏黄杆菌活疫苗奠定基础。

1. 材料与方法

1.1 菌株与实验鱼

约氏黄杆菌野毒株M168由笔者实验室从患病的鳗鲡(Anguilla anguilla)鳃分离并保存，减毒株M170是由M168经链霉素诱导而来。实验鳜购自广东清远某养殖场，健康，无发病史，镜检无寄生虫，体质量约100 g，养殖于200 L塑料桶中，实验前暂养7 d，充气，每天投喂适口鲮鱼作为饵料，定期排污，实验期间水温22~29 ℃。

1.2 约氏黄杆菌M170株的制备

将保存的M170菌种涂布于含50 μg·mL^-1链霉素的0.5%胰蛋白胨平板上，25 ℃恒温培养24 h，挑取单菌落，接种于100 mL 0.5%胰蛋白胨液体培养基，25 ℃恒温培养过夜，然后按1 : 10转接至0.5%的胰蛋白胨液体培养基中，25 ℃恒温培养12 h，离心收集菌体，PBS调整浓度为1×10⁷ CFU·mL^-1，用于浸泡免疫，现配现用。

1.3 鱼体免疫

健康鳜200尾被随机分为2组，每组100尾，其中M170组鳜在10⁷ CFU·mL^-1疫苗悬液中浸泡30 min，对照组在同体积养殖水中浸泡，浸泡过程中保持充氧，免疫后将鱼转入塑料桶进行养殖。

1.4 免疫相关基因定量检测

1.4.1 RNA的提取及cDNA合成

免疫后第0、第6、第24、第48、第72小时以及第7、第14、第21、第28天每组随机抽取3尾鳜，分别取脾脏、肝脏组织，按照RNeasy Mini Kit试剂盒(Qiagen)说明书提取RNA。用TransScript Ⅱ One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金)进行反转录，合成cDNA第一链。

1.4.2 定量PCR检测

以cDNA第一链为模板，在ABI 7500(applied biosystems)实时荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR检测。反应体系和反应程序按照试剂盒SYBR Premix EX Tap^TM Ⅱ(Tli RNaseH plus)(宝生物工程)说明书操作。采用2^－ΔΔCt法计算样品中IgM、Lys基因(goose型)的相对表达量，β-actin为内参基因。引物序列为：

IgM F：5′-ATTGTCAGGTCCATCGGGC-3′

IgM R：5′-TCAGGGATGTTCATGTTGAGGTT-3′

Lys F：5′-CTGATGCGGGCAGAATGGAA-3′

Lys R：5′-AGCCGTTATACGCTCCTCTC-3′

Act F：5′-GACTTCGAGCAGGAGATGGG-3′

Act R：5′-CGAGGAAGGAAGGCTGGAAG-3′

1.5 抗体滴度的测定

1.5.1 样品收集与处理

分别于免疫后第7、第14、第20、第30、第35、第42天各组取3尾鱼，尾静脉采血，室温静置2 h后，4 ℃静置过夜，3 000 g、4 ℃离心15 min，取上清，最后将同组3尾血清等体积混合，-20 ℃冻存备用。

1.5.2 抗原制备

将约氏黄杆菌M170培养过夜，10 000 r·min^-1离心10 min，重悬于0.01 mol·L^-1 pH 7.4的PBS，然后再10 000 r·min^-1离心10 min，如此洗菌3次后重悬于包被液CBS(Na₂CO₃ 0.8 g，NaHCO₃ 1.46 g，水溶解，定容500 mL)中，稀释至OD₆₀₀=0.5，冰浴下采用超声波200 W的功率破碎10次，每次10 s，间隔15 s，取破碎后的细菌作为抗原4 ℃保存备用。

1.5.3 抗原包被

将以上制备抗原用包被液(CBS)进行1 : 1稀释，然后50 μL·孔^-1进行包被，4 ℃包被过夜。吸上清，PBST洗涤3次；然后加250 μL·孔^-1的封闭液(3% BSA+CBS)进行封闭；4 ℃过夜，吸上清，PBST洗涤3次。

1.5.4 ELISA工作程序

将待测血清进行倍比稀释(1 : 2ⁿ稀释于1% BSA+PBST中)后，每孔加100 μL稀释血清，37 ℃恒温箱孵育2 h，空白孔加1% BSA+PBST，每个样品重复3个孔；弃上清，PBST洗涤5次；加一抗(鳜鱼IgM单抗，福建省农业科学院生物技术研究所龚晖研究员赠送)，100 μL·孔^-1(1 : 4 000稀释于1% BSA+PBST中)，37 ℃恒温箱温育2 h；弃上清，PBST洗涤5次。加羊抗鼠IgG-HRP二抗(Sigma)，用1% BSA+PBST l : 5 000(V/V)稀释，100 μL·孔^-1，37 ℃恒温箱温育45 min，空白孔加1% BSA+PBST；弃上清，PBST洗涤5次；加新鲜配制的底物溶液[V(TMB) : V(H₂O₂)=1 : 1](天根)100 μL·孔^-1，37 ℃避光放置20 min，当显示蓝色时加50 μL ·孔^-1 H₂SO₄终止反应，孔的颜色将变黄，在酶标仪下测定450 nm光密度(OD)，以空白对照组调零后测各孔OD值大于阴性对照OD值2.1倍判断为阳性。

1.6 血清Lys活性测定

分别于免疫后第1、第2、第3、第4、第5、第6、第35、第42天各组取3尾鱼尾静脉采血，分离血清，取等体积的每尾鱼血清混合制备成混合样，按溶菌酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书要求测定血清中Lys活性，每个样品重复3次，计算样品中Lys含量。

1.7 RPS的测定

免疫后第28天，采用约氏黄杆菌野毒株M168注射攻毒，每组20尾鱼，注射浓度为10⁹ CFU ·mL^-1，每尾注射100 μL，连续观察14 d，记录鱼体死亡情况，对发病和死亡个体进行病原的分离和鉴定，并计算RPS：RPS＝(1－免疫组死亡率/对照组死亡率)×100%。

1.8 数据分析

实验所得数据均表示为“平均数±标准差( X ± SD)”，采用OringinPro 6.0软件进行数据处理，并采用t检验进行差异性分析，当P < 0.05时表示差异显著。

2. 结果

2.1 免疫后鳜Lys表达情况

约氏黄杆菌减毒活疫苗M170免疫组Lys相对对照组表达量在免疫后第6小时显著上调(P < 0.05)，到第48小时时表达量达到峰值，是对照组的10.9倍(P < 0.05)，随后表达量迅速下降，但在第7、第21和第28天表达量仍显著高于对照组(P < 0.05)(图 1)。免疫后不同时间点鳜血清Lys水平结果见表 1。结果显示M170免疫组第1天开始相对于对照组明显升高，第2天达到高峰，为对照组的8.43倍(P < 0.05)，随后下降，到第6天与对照组水平相当；对照组整个实验过程中维持在同一水平。以上结果表明浸泡免疫后鳜Lys基因表达和血清中Lys水平相对于对照组显著升高。

图 1 免疫后鳜溶菌酶基因表达变化

“*”表示与对照组差异显著(P < 0.05)，后图与表 2同此

Figure 1. Lysozyme expression profile of mandarin fish vaccinated with M170

"*" indicates significant difference with the control group. The same case in the following figures and Tab. 2.

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表 1 鳜浸泡免疫后不同时间点血清中溶菌酶质量浓度

Table 1. Lysozyme content in serum of mandarin fish post-immunization

μg·mL^-1
组别 group	免疫后天数/d days post vaccination
组别 group	1	2	3	4	5	6	35	42
M170免疫组M170 immunized group	83.23±3.33	120.46±4.22	104.36±4.38	48.93±1.37	24.28±1.07	13.88±3.61	14.52±0.48	10.53±0.41
对照组 control group	12.35±0.35	14.29±0.40	10.34±0.45	12.33±0.43	12.95±0.23	11.25±0.38	9.56±0.21	11.58±0.39

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2.2 免疫后鳜特异性抗体表达情况

约氏黄杆菌减毒活疫苗M170免疫组IgM的相对表达量显著高于对照组(P < 0.05)，免疫组从第7天至第28天表达量相对于对照组均显著上调，其中第28天时M170免疫组IgM相对表达量是对照组的98.7倍(P < 0.05)(图 2)。免疫后不同时间点鳜血清抗体效价结果显示，免疫后第7天抗体效价相对于对照组显著升高，第28天血清抗体效价达到峰值(2⁶)，之后稍有下降，第49天仍维持在2⁴水平(图 3)。

图 2 免疫后鳜IgM表达变化

Figure 2. IgM expression profile of mandarin fish vaccinated with M170

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图 3 免疫后鳜血清抗体效价动力学

Figure 3. The kinetics of serum antibody titer of mandarin fish post-immunization

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2.3 RPS的测定

免疫后第28天，用约氏黄杆菌强毒株M168进行活菌攻击，结果显示，对照组鱼从第2天开始出现死亡，而M170免疫组第4天开始出现死亡，死亡个体出现鳃丝腐烂、鳍条发白、腐烂等细菌性烂鳃病症状，死亡后可从鳜鳃、肝脏等部位分离到约氏黄杆菌。实验期间免疫组累计死亡率为10%，对照组累计死亡率为70%(表 2)，该疫苗对鳜的RPS为85.9%。

表 2 约氏黄杆菌减毒活疫苗对鳜的免疫保护效果

Table 2. Immune efficacy of attenuated F.johnsoniae vaccine for mandarin fish

组别 group	死亡数/总数 numbers of dead fish/total fish	累计死亡率/% cumulative mortality	相对免疫保护率/% relative percentage survival
M170免疫组immunized group	2/20	10 ^*	85.9
对照组control group	14/20	70	-

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3. 讨论

国际上有多种鱼类黄杆菌疫苗开发成功，其中柱状黄杆菌减毒活疫苗Aquavac-Col^®已在美国批准上市^[19]，LAFRENTZ等^[20]和ALVAREZ等^[21]相继研制了虹鳟(Oncorhynchus mykiss)嗜冷黄杆菌弱毒疫苗。此研究证实通过链霉素连续传代诱导获得的约氏黄杆菌减毒株M170通过浸泡免疫能引发鳜非特异性和特异性免疫应答，并提供良好的免疫保护，为开发安全、高效的鳜约氏黄杆菌减毒活疫苗奠定基础。

Lys在鱼类抵抗病原感染中发挥重要作用，可水解致病菌中的黏多糖，抵抗外来病原的入侵^[22]，广泛存在于血清、皮肤黏液和组织器官中，是鱼体重要非特异性免疫指标^[23]。目前已发现2种类型的Lys，分别为chicken(c-)型和goose(g-)型，其中IRWIN和GONG^[24]最早在天鹅(Cygnus cygnus)蛋中发现了具有抗菌作用的g-型Lys。SUN等^[25]于2006年克隆鉴定了鳜g-型Lys基因，并证实了其抗菌功能。该研究结果表明疫苗接种后第1天鳜血清Lys含量显著升高，第2天达到峰值，为对照组的8.43倍，说明约氏黄杆菌减毒株引发了鳜的非特异性免疫应答。肝脏Lys基因表达量与血清中Lys含量测定结果类似，但持续时间存在较大差别，肝脏Lys基因表达量直到第28天仍与对照组存在显著差异，而血清Lys含量到第5天与对照组无显著差异，导致出现这种差异的原因为：1)2种方法的灵敏度存在差异，定量PCR方法更灵敏，较为细微差别均能区分开来，所以定量PCR检测的肝脏Lys基因表达量到第28天仍与对照组存在显著差异；2)定量PCR是测定体内g-型Lys基因转录数量，而Lys检测试剂盒则是检测血清中Lys酶活性。

血清特异性抗体效价是评价疫苗免疫效果最常用的指标之一^[26-27]。该研究结果表明免疫组鳜血清抗体效价显著高于对照组，免疫后鳜脾脏IgM基因相对表达量与免疫后血清抗体效价变化规律基本一致，表明约氏黄杆菌减毒活疫苗浸泡免疫鳜后引起了机体体液免疫应答。ESTEVE-GASSENT等^[28]研究表明浸泡免疫可以激发鱼类体液免疫应答，通常来说全菌灭活疫苗约在免疫后500度日血清抗体效价达到峰值，但该研究结果显示血清抗体效价在700度日(免疫后第28天)达到峰值，且IgM基因相对表达量从第7到第28天一直呈现上升趋势，推测可能是约氏黄杆菌减毒活疫苗能够在鱼体内存活较长时间，可以持续激发机体体液免疫应答。

RPS是评价疫苗免疫效果最直接指标，其高低与疫苗种类、鱼类品种、免疫途径等存在密切的关系。该研究制备的约氏黄杆菌减毒活疫苗M170株免疫鳜后第28天，浸泡免疫RPS可达85.9%，表明制备的约氏黄杆菌活疫苗具有良好的免疫保护效果。而LI等^[18]用该约氏黄杆菌减毒株制备疫苗浸泡免疫草鱼后第28天RPS为73.1%，造成这种差异的原因可能与鳜体表具有发达的黏膜免疫系统有关^[29]。罗霞等^[30]研究发现灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)浸泡免疫鳜后，皮肤黏液的抗体效价随着时间的推移而变化，说明鳜皮肤具有强大的黏膜免疫系统。在美国批准上市的柱状黄杆菌减毒活疫苗也存在类似的结果，该疫苗对孵化后第10至第48天的斑点叉尾(Ictalurus punetaus)浸泡免疫RPS为57%~94%，而对于孵化后第10天的大口黑鲈RPS为74%~94%^[19]。

综上所述，约氏黄杆菌减毒株M170浸泡免疫鳜可刺激肝脏中Lys基因和脾脏中IgM基因表达上调，血清Lys活性提高，免疫后血清抗体效价可达到2⁶，RPS可达85.9%，表明该疫苗可有效防治约氏黄杆菌导致的鳜烂鳃病。

图 1 大亚湾大碓深水网箱区

Figure 1. Deep-water net cage culture area in Dadui of Daya Bay

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图 2 大亚湾深水网箱海域表层营养盐的时空变化图柱上不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)；后图同此

Figure 2. Spatial-temporal variation of NO₂-N, NO₃-N, NH₄-N and PO₄-P in surface water of deep-water net cage area of Daya Bay Different lowercase letters on bars indicate significant difference (P < 0.05). The same case in the following figure.

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图 3 大亚湾深水网箱海域底层营养盐的时空变化

Figure 3. Spatial-temporal variation of NO₂-N, NO₃-N, NH₄-N and PO₄-P in bottom water of deep-water net cage area of Daya Bay

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表 1 有机污染分级

Table 1 Grade of organic pollution

有机污染指数(A)organic pollution index	< 0	0~1	1~2	2~3	3~4	> 4
污染分级assessment grade	0	1	2	3	4	5
水质评价assessment of water	良好	较好	开始污染	轻度污染	中度污染	严重污染

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表 2 重金属元素背景值和毒性系数

Table 2 Background value of heavy metal elements and toxic coefficient

元素element	铜Cu	铅Pb	锌Zn	镉Cd
背景值/mg·kg^-1 background value	6.44	21.67	26.01	0.027
毒性系数toxic coefficient	5	5	1	30

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表 3 大亚湾深水网箱海域海水因子(平均值±标准差)

Table 3 Seawater column characteristics in deep-water net cage area of Daya Bay (X ±SD)

调查月份 sampling month	区域 area	水层 water depth	ρ(DIP)/mg·L^-1	ρ(DIN)/mg·L^-1	ρ(DO)/mg·L^-1	ρ(TPM)/mg·L^-1	ρ(COD_Mn)/mg·L^-1	ρ(Chl-a)/μg·L^-1
5月 May	网箱区	表层底层	0.003±0.001^a0.007±0.003^a	0.085±0.016^a0.067±0.019^a	5.99±0.38^a4.78±0.33^b	10.06±1.11^a8.10±3.30^a	0.90±0.24^a0.77±0.13^a	4.76±1.34^a2.81±0.59^a
	外围区	表层底层	0.006±0.004^a0.006±0.003^a	0.108±0.031^a0.074±0.003^a	5.25±0.91^a4.72±0.25^b	7.44±2.21^a7.25±2.88^a	1.06±0.19^a0.74±0.17^a	2.49±0.90^a2.71±0.81^a
	非养殖区	表层底层	0.003±0.001^a0.002±0.001^b	0.029±0.020^b0.026±0.005^b	7.66±0.79^a6.49±0.21^a	7.60±0.60^a10.33±3.43^a	1.17±0.35^a0.59±0.36^a	4.70±2.81^a4.38±4.00^a
8月 August	网箱区	表层底层	0.003±0.002^a0.004±0.002^a	0.039±0.006^a0.042±0.011^a	6.47±0.40^a5.39±0.53^b	4.77±1.01^a6.62±0.97^a	0.89±0.10^a0.69±0.14^a	2.59±0.71^a3.77±1.06^a
	外围区	表层底层	0.002±0.001^a0.004±0.001^a	0.048±0.007^a0.043±0.013^a	6.47±0.50^a5.63±0.59^a	7.86±2.93^a6.92±4.14^a	0.77±0.21^a0.58±0.18^a	5.10±2.92^a3.96±0.84^a
	非养殖区	表层底层	0.002±0.001^a0.002±0.001^a	0.073±0.033^a0.099±0.042^a	7.05±0.08^a6.61±0.12^a	5.44±1.07^a5.11±2.36^a	0.82±0.25^a0.50±0.20^a	2.49±0.47^a2.78±0.84^a
注：同一列中数据有相同上角标表示不存在显著差异(P > 0.05)，后表同此 Note：Values with same superscript letters within the same column are not significantly different (P > 0.05). The same case in the following tables.

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表 4 大亚湾深水网箱海域水环境评价(平均值±标准差)

Table 4 Seawater assessment of deep-water net cage area of Daya Bay (X ±SD)

调查月份 sampling month	区域 area	有机污染指数A		营养状态质量指数NQI
调查月份 sampling month	区域 area	表层	底层	表层	底层
5月May	网箱区	0.18±0.20^a	0.40±0.39^a	1.17±0.18^a	0.98±0.16^a
	外围区	0.78±0.66^a	0.47±0.22^a	1.16±0.08^a	0.98±0.19^a
	非养殖区	-0.72±0.15^b	-0.74±0.10^b	1.17±0.41^a	0.83±0.45^a
8月August	网箱区	-0.44±0.18^a	-0.24±0.24^a	0.74±0.14^a	0.79±0.18^a
	外围区	-0.47±0.20^a	-0.31±0.24^a	0.94±0.33^a	0.81±0.17^a
	非养殖区	-0.28±0.37^a	-0.64±0.38^a	0.83±0.20^a	0.74±0.30^a

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表 5 大亚湾深水网箱海域重金属质量分数(平均值±标准差)

Table 5 Heavy metals contents in deep-water net cage area of Daya Bay ( X ±SD)

mg·kg^-1
区域 area	元素element
区域 area	铜Cu	铅Pb	锌Zn	镉Cd
网箱区cage area	43.45±6.01^a	41.70±20.92^a	69.23±25.93^a	0.02±0.00^b
外围区surrounding area	39.20±6.51^a	30.45±1.63^a	79.20±2.40^a	0.06±0.01^a
非养殖区non-culture area	14.13±0.85^b	25.67±7.04^a	42.53±33.02^a	0.03±0.02^b

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表 6 大亚湾深水网箱海域表层沉积环境重金属危害状况(平均值±标准差)

Table 6 Damage of heavy metals in surface sediments from deep-water net cage area of Daya Bay ( X ±SD)

区域 area	潜在生态危害系数E_rⁱ				潜在生态危害指数RI
区域 area	铜Cu	铅Pb	锌Zn	镉Cd	潜在生态危害指数RI
网箱区cage area	33.73±4.67^a	9.62±4.82^a	2.66±1.00^a	22.22±0.00^b	61.32±11.36^a
外围区surrounding area	30.44±5.06^a	7.03±0.37^a	3.05±0.09^a	61.12±7.86^a	101.62±2.34^a
非养殖区non-culture area	10.97±0.66^b	5.92±0.63^a	1.64±1.27^a	33.33±19.25^b	51.85±18.27^b

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施引文献(35)

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1. 材料与方法
1.1 菌株与实验鱼
1.2 约氏黄杆菌M170株的制备
1.3 鱼体免疫
1.4 免疫相关基因定量检测
1.4.1 RNA的提取及cDNA合成
1.4.2 定量PCR检测
1.5 抗体滴度的测定
1.5.1 样品收集与处理
1.5.2 抗原制备
1.5.3 抗原包被
1.5.4 ELISA工作程序
1.6 血清Lys活性测定
1.7 RPS的测定
1.8 数据分析
2. 结果
2.1 免疫后鳜Lys表达情况
2.2 免疫后鳜特异性抗体表达情况
2.3 RPS的测定
3. 讨论

1. 材料与方法
1.1 菌株与实验鱼
1.2 约氏黄杆菌M170株的制备
1.3 鱼体免疫
1.4 免疫相关基因定量检测
1.4.1 RNA的提取及cDNA合成
1.4.2 定量PCR检测
1.5 抗体滴度的测定
1.5.1 样品收集与处理
1.5.2 抗原制备
1.5.3 抗原包被
1.5.4 ELISA工作程序
1.6 血清Lys活性测定
1.7 RPS的测定
1.8 数据分析
2. 结果
2.1 免疫后鳜Lys表达情况
2.2 免疫后鳜特异性抗体表达情况
2.3 RPS的测定
3. 讨论

参考文献(45)

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大亚湾鱼类深水网箱养殖对环境的影响

作者简介: 梁庆洋(1992-)，男，硕士研究生，从事渔业生态环境研究。E-mail：kinyosan@163.com

通讯作者: 黄洪辉(1972-)，男，博士，研究员，从事海洋生态环境保护研究。E-mail：huanghh@scsfri.ac.cn

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