海洋石油污染是由石油及其炼制品在开采、炼制、贮运和使用过程中进入海洋而造成, 已成为全球海洋面临的重要问题。近年来, 国内外海域溢油事故频发, 导致海洋石油污染形势日益严峻。2010年美国墨西哥湾石油泄漏事故中, 至少2 500 km²的海水被石油覆盖。2011年中国蓬莱19-3油田溢油事故导致周边海域石油类质量浓度高达1.28 mg · L^-1[1]。2013年中国石油类含量超过第一、第二类海水水质标准的海域面积约为17 150 km², 其中渤海、南海、黄海和东海海域面积分别为8 230、4 700、3 630和590 km^2[2]。

研究表明, 石油污染对海洋生态系统造成了严重的危害, 不仅破坏了海洋生态系统的物质循环和能量流动, 影响了整个生态系统的稳定性^[3], 还影响了海洋生物的生长、发育、繁殖等正常生理过程, 对其造成毒性危害^[4]。石油中的烃类化合物主要由烷烃、烯烃、芳香烃、杂环芳香烃等多种成分组成, 其中多环芳烃类具有较强的致癌、致畸和致突变作用, 可以通过生物富集作用积累在水生生物体内^[5-6]。发生海洋溢油事故时, 常采用溢油分散剂进行应急处理, 通过将海面油膜乳化、分散成小油滴以加速油膜溶解^[7-8]。然而, 溢油分散剂并不能减少水体中的石油含量, 反而对多环芳烃具有增溶作用, 对水生生物造成更不利的影响^[9-10]。

双壳类软体动物是近海海域重要的海洋生物资源, 仅2013年中国贝类中蛤的年产量已高达385×10⁴ t, 占贝类总产量的30.28%^[11]。其中, 菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)由于生长速度快、适应性强、味道鲜美等优势, 已成为中国主要的海水养殖贝类之一。但是, 由于生长位置固定、活动范围有限、采用滤食方式等习性, 菲律宾蛤仔在遇到水质污染时, 容易暴露于海洋污染物并产生富集作用, 尤其是石油烃等亲脂性污染物^[12]。通过生物富集进入菲律宾蛤仔体内的石油烃等污染物可以沿食物链进入人体, 带来极大的安全隐患。

目前, 国内外关于水生生物如鱼、虾、贝等对不同油品的生物富集动力学特征已开展了大量研究^[13-20], 但是在溢油分散剂处理下, 比较菲律宾蛤仔不同组织对0^#柴油和南海流花原油的生物富集规律的研究尚未见报道。因此, 文章以菲律宾蛤仔为研究对象, 在室内条件下进行0^#柴油和南海流花原油的生物富集实验, 采用半静态双箱动力模型^[21]对富集过程进行拟合, 比较了肌肉和内脏2种组织对石油烃富集能力的差异, 并分析了菲律宾蛤仔对0^#柴油和南海流花原油2种油品的生物富集动力学参数差异, 旨在为海洋溢油污染的生态风险评价提供科学依据, 为溢油污染下人类的健康风险评价提供基础数据。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

实验用菲律宾蛤仔(500只)购自广东省深圳市大鹏新区南澳水产市场, 选取大小均匀的健康贝类进行分组实验, 壳长范围为2.1~3.0 cm。实验前将贝类清洗干净, 并置于200 L玻璃钢水桶暂养7 d。实验用养殖海水取自大亚湾天然海水, 经沉淀池沉淀和砂滤后备用。实验期间控制水温为24~26 ℃, pH为8.16~8.20, 盐度约30。0^#柴油为中石化广州地区销售的轻质燃油, 南海流花原油为南海流花油田所产, 未经任何分硫、提纯等工艺处理。溢油分散剂为广州富肯环保科技有限公司生产的“富肯-3号”, 是一种可生物降解的常规型消油剂产品, 乳化率30 s>60%, pH为7~7.5, 可生物降解性BOD₅/COD(5日生化需氧量/化学需氧量)>30%, 燃点>70 ℃。

1.2   实验母液的制备

实验母液制备方法为先将0^#柴油与溢油分散剂按照1:1体积比混合, 置于超声波洗涤器中超声5 min^[22]; 再将混合液与过滤海水按照1:10体积比混匀, 置于超声洗涤器中超声1 h; 最后将混合液置于分液漏斗中静置3 h, 所获水相液作为实验母液置于棕色玻璃瓶中保存。南海流花原油实验母液的制备方法同上。

1.3   富集实验

实验在中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地进行, 用过滤海水将实验母液稀释至设计浓度, 0^#柴油暴露水体中石油烃质量浓度为0.5 mg · L^-1和2.5 mg · L^-1, 南海流花原油水体中石油烃质量浓度为0.5 mg · L^-1和5 mg · L^-1, 再设1个空白对照(未加任何物质的过滤海水)。在5个60 L玻璃缸中分别放入50只菲律宾蛤仔, 实验期间每天投喂适量螺旋藻粉。实验采用半静态法进行富集, 每12 h换水1次, 换水量为100 %。实验开始前, 采集菲律宾蛤仔样品, 测定其肌肉和内脏组织的石油烃本底值。富集实验为期15 d, 分别在富集的第1、第3、第5、第7、第15天随机取6只菲律宾蛤仔, 将肌肉和内脏组织剥离后用锡箔纸分开包裹封于密封袋中, 置于-20 ℃冷冻保存待测。

1.4   石油烃含量测定

将每次取样的6只菲律宾蛤仔的肌肉和内脏组织分别混合并匀浆后, 采用上海精科荧光分光光度计F95S按照《海洋监测规范》(GB 17378.6—2007)^[23]中的荧光分光光度法进行石油烃含量测定, 其中生物组织检测采用湿质量。海水样品中的石油烃含量则采用岛津UV-2501紫外分光光度计按照《海洋监测规范》(GB 17378.4—2007)^[24]中的紫外分光光度计法进行测定。

1.5   数据处理

采用双箱动力模型对菲律宾蛤仔富集石油烃的过程进行拟合^[25]。该模型认为污染物在生物体内的富集过程是其在水相和有机相之间的两相分配过程(图 1)。

图  1  生物富集双箱动力学模型

Figure  1.  Two-compartment model of accumulation

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其中C_W为水体污染物质量浓度(mg · L^-1), C_A为生物体内污染物质量分数(mg · kg^-1), k₁为吸收速率常数, k₂为释放速率常数, k_M为生物体的代谢速率常数, k_V为污染物挥发速率常数。忽略水体中石油烃的挥发及生物体的代谢, 即k_V和k_M取为0, 由方程(2)可以得到富集和释放过程的方程:

在0 < t < t^*的富集阶段:

在t>t^*的释放阶段:

其中e为自然底数, C₀为空白对照组生物体内的石油烃浓度, t^*为富集天数。

利用OriginPro 8.5软件按照方程(3)对富集过程进行非线性拟合, 得到k₁和k₂的拟合值。在理论平衡状态下(t→∞), 生物富集系数(BCF)、生物体内污染物质的含量(C_Amax)和生物半衰期(B_1/2)的计算公式如下:

通过拟合系数R²对双箱动力学模型的拟合优度进行评价; 采用F检验对模型的显著性进行检验, 以验证双箱动力模型的适用性; 同时, 采用配对t检验衡量模型结果与实际结果在显著性水平P为0.05的情况下是否相符。

2.   结果

2.1   对0^#柴油和南海流花原油的生物富集

通过对富集过程中菲律宾蛤仔体内石油烃含量的测定, 得到了肌肉和内脏组织对石油烃的生物富集量(图 2)。随着富集时间的增长, 菲律宾蛤仔体内的石油烃含量也随之增加。第15天, 菲律宾蛤仔肌肉组织对0^#柴油和南海流花原油的生物富集量分别为20.08 mg · kg^-1和137.03 mg · kg^-1, 而内脏组织分别为53.11 mg · kg^-1和583.97 mg · kg^-1, 与空白对照组相比石油烃含量分别增加了2.93、25.76、16.94和116.74倍, 表明菲律宾蛤仔对2种油品均具有较强的生物富集能力。

图  2  菲律宾蛤仔肌肉和内脏组织对0^#柴油和南海流花原油的生物富集曲线

Figure  2.  Accumulation curves of No.0 diesel and South China Sea Liuhua crude oil in muscles and viscera of R.philippinarum

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随着水体中2种油品浓度的增加, 2种组织对石油烃的生物富集量也逐渐增加。当0^#柴油质量浓度由0.5 mg · L^-1增加到2.5 mg · L^-1时, 肌肉和内脏组织对石油烃第15天的生物富集量分别增加了0.32倍和0.31倍; 而南海流花原油质量浓度由0.5 mg ·L^-1增加到5.0 mg · L^-1时, 菲律宾蛤仔肌肉和内脏组织的生物富集量分别增加了3.16倍和2.37倍。

2.2   对0^#柴油和南海流花原油的生物富集动力学参数

采用OriginPro 8.5软件, 按照方程(3)对富集过程进行非线性拟合(图 2), 得到菲律宾蛤仔肌肉和内脏组织对不同质量浓度0^#柴油和南海流花原油的吸收速率常数k₁和释放速率常数k₂, 并计算得到相应的BCF、C_Amax和B_1/2(表 1)。

表  1  菲律宾蛤仔肌肉和内脏组织对不同浓度0^#柴油和南海流花原油的富集动力学参数

Table  1.  Accumulation kinetic parameters of No.0 disel and South China Sea Liuhua crude oil in muscles and viscera of R.philippinarum

油品 oil	质量浓度/mg·L-1 concentration	组织 tissue	吸收速率常数 k1	释放速率常数 k2	生物富集系数BCF	体内污染物质量分数/mg·kg-1 CAmax	生物半衰期/d B1/2
0#柴油	0.5	肌肉	2.70	0.105	25.71	12.86	6.60
No.0 diesel oil		内脏	9.74	0.103	94.56	47.28	6.73
	2.5	肌肉	0.921	0.134	6.87	17.18	5.17
		内脏	2.51	0.093	27.05	67.62	7.47
南海流花原油	0.5	肌肉	11.3	0.186	60.75	30.38	3.73
South China Sea		内脏	64.2	0.169	379.88	189.94	4.10
Liuhua crude oil	5.0	肌肉	3.43	0.100	34.30	171.50	6.93
		内脏	22.5	0.189	119.05	595.24	3.67

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菲律宾蛤仔对0^#柴油和南海流花原油的k₁分别为0.921~9.74和3.43~64.2, 随着水体中石油烃浓度的增大, k₁减小。同等石油烃浓度下, 内脏组织对石油烃的k₁大于肌肉组织。菲律宾蛤仔对0^#柴油和南海流花原油的k₂分别为0.092 8~0.134和0.100~0.189, 该参数与外部水体中石油烃浓度无明显相关性。

菲律宾蛤仔对0^#柴油和南海流花原油的BCF分别为6.87~94.56和34.30~379.88, 其对南海流花原油的生物富集能力强于0^#柴油。随着水体中石油烃浓度的增大, BCF逐渐减小。同等石油烃浓度下, 内脏组织对石油烃的BCF高于肌肉组织, 表明内脏组织对石油烃的富集能力强于肌肉组织。

生物富集达到理论平衡时, 菲律宾蛤仔对0^#柴油和南海流花原油的C_Amax分别为17.18~67.62 mg · kg^-1和30.38~595.24 mg · kg^-1, 该实验中各浓度组在暴露的第15天基本上都达到了理论平衡状态。随着水体中石油烃浓度的增加, 同种组织的C_Amax也随之增加。同等石油烃浓度下, 菲律宾蛤仔对南海流花原油的C_Amax高于0^#柴油, 内脏组织的C_Amax高于肌肉组织。0^#柴油和南海流花原油在菲律宾蛤仔体内的半衰期B_1/2分别为5.17~7.47和3.67~6.93 d, 0^#柴油的B_1/2高于南海流花原油, 而B_1/2与水体中石油烃浓度无明显相关性。

2.3   双箱动力模型的拟合优度检验

利用拟合系数R²、F检验和t检验对模型拟合结果进行评价(表 2), 发现菲律宾蛤仔对不同质量浓度0^#柴油和南海流花原油生物富集拟合曲线的R²分别为0.971 4~0.994 5和0.933 2~0.985 8, 表明拟合程度良好。同时, F检验的P值均小于0.05, 说明双箱动力模型回归方程显著。在此基础上, 采用配对t检验对模型值和实测值进行验证, 结果显示所有的P值均大于0.05, 表明模型结果和实测结果没有显著性差异。上述拟合优度检验表明, 在该实验条件下, 双箱动力学模型适用于菲律宾蛤仔对0^#柴油和南海流花原油的生物富集动力学特征研究。

表  2  双箱动力模型用于菲律宾蛤仔对0^#柴油和南海流花原油生物富集的拟合优度检验信息

Table  2.  Statistical information to acess goodness-of-fit of two-compartment model applied in accumulation of No.0 diesel and South China Sea Liuhua crude oil in R.philippinarum

油品 qoil	质量浓度/mg·L-1 concentration	组织 tissue	R2	F检验的P值 P value of F test	t检验的P值 P value of t test
0#柴油 No.0 diesel oil	0.5	肌肉	0.994 5	7.45×10-6	0.55
		内脏	0.971 4	2.62×10-4	0.59
	2.5	肌肉	0.990 0	1.99×10-5	0.65
		内脏	0.981 0	2.37×10-4	0.65
南海流花原油 South China Sea Liuhua crude oil	0.5	肌肉	0.950 7	3.62×10-4	0.89
		内脏	0.933 2	1.37×10-3	0.67
	5.0	肌肉	0.985 8	1.62×10-4	0.54
		内脏	0.942 2	5.88×10-4	0.72

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3.   讨论

3.1   菲律宾蛤仔对石油烃生物富集的一般规律

目前, 关于菲律宾蛤仔对石油烃等污染物的生物富集动力学特征已有相关研究。姜朝军等^[17]发现菲律宾蛤仔对0.021~0.068 mg · L^-1 0^#柴油的BCF为685~431, 高萍等^[18]测得菲律宾蛤仔对0.1~3.2 mg · L^-1胜利原油的BCF为231.20~30.61。上述研究均表明, k₁和BCF均随着水体中石油烃质量浓度的增大而减小。因为随着水体石油烃浓度的增加, 生物体内石油烃含量增加相对较快, 与脂肪等物质的结合更易达到饱和, 导致石油烃从水相进入有机相的速率常数下降, 即k₁减小。同时, 随着生物体内石油烃含量的增加, 其对水体中石油烃的富集能力减弱, 表现为BCF减小。

该研究测得的菲律宾蛤仔对南海流花原油的BCF与高萍等^[18]的研究结果接近, 但0^#柴油质量浓度大于姜朝军等^[17]研究中的水平, 导致BCF小于其研究结果。该研究中菲律宾蛤仔对石油烃的k₁和BCF均随着水体石油烃浓度的上升而减小, 符合生物对污染物质生物富集的一般规律, 与已有研究结果一致。

3.2   不同油品对石油烃生物富集的影响

同种贝类对不同油品的石油烃生物富集动力学特征也存在差异。薛秋红等^[19]测定的紫贻贝对0^#柴油的BCF远大于大港原油。李磊等^[20]发现缢蛏(Sinonovacula constricta)对0^#柴油乳化液的生物富集量和生物富集系数均高于对东海平湖原油乳化液。该研究中, 菲律宾蛤仔对南海流花原油的生物富集量及富集系数均大于0^#柴油。

不同油品的生物富集动力学特征差异, 可能与其成分组成、含量差异以及处理方式相关。芳香烃是石油烃的重要组分, 与烷烃、烯烃等其他组分相比, 具有更高的溶解度和更强的亲脂能力, 也更容易在贝类脂质中积累。柴油中的芳香烃质量分数为5%~25%, 而原油中的芳香烃质量分数为15%~40%^[17]。薛秋红等^[19]和李磊等^[20]研究的石油乳化液是将不同油品与过滤海水按一定体积比混合后制得, 虽然原油中具有更高含量的芳香烃, 但还存在胶质、沥青和石蜡等杂质。0^#柴油在乳化过程中有更多的可溶性石油烃溶解在水中, 导致其在贝类体内的富集量均高于原油乳化液, 生物富集系数也随之增大。溢油分散剂可以使石油烃中各组分, 尤其是多环芳烃, 在海水中的溶解量增加^[9]。该研究采用溢油分散剂制备实验母液, 与0^#柴油相比, 南海流花原油暴露水体中可溶性芳香烃含量增多, 造成生物体内的富集量更高, 生物富集系数也更大。因此, 不同油品中的芳香烃含量和溢油分散剂处理可能是造成该研究中菲律宾蛤仔对0^#柴油和南海流花原油生物富集动力学特征差异的主要原因。

3.3   组织差异对石油烃生物富集的影响

国内外已开展大量双壳类软体动物对石油烃的生物富集动力学特征研究, 但是不同组织对石油烃的生物富集差异尚未见报道。该研究发现, 石油烃在菲律宾蛤仔不同组织间的生物富集系数差异显著。肌肉组织对0.5 mg · L^-1、2.5 mg · L^-1 0^#柴油和0.5 mg · L^-1、5.0 mg · L^-1南海流花原油的BCF分别为25.71、6.87和60.75、34.30, 而内脏组织分别为94.56、27.05和379.88、119.05, 后者是前者的3.68、3.94、6.25和3.47倍。菲律宾蛤仔的内脏组织对石油烃的生物富集能力明显高于肌肉组织, 可能与其行使的解毒功能相关。石油烃进入水生生物体内参与Ⅰ相与Ⅱ相生物转化, 在氧化还原循环中会产生大量高活性的活性氧自由基(relative oxygen species, ROS), 造成酶失活、蛋白质变性、DNA损伤等氧化损伤; 而内脏组织是贝类重要的抗氧化应激器官, 其中较高含量的抗氧化酶系, 包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)等, 可以有效地清除新陈代谢产生的ROS、氧自由基、超氧离子自由基等, 维持生物体正常的代谢平衡^[1]。已有研究表明, 石油污染能够导致贝类内脏组织中的抗氧化酶被显著诱导^[26-29]。因此, 作为石油污染的重要解毒场所, 内脏组织对石油烃表现出更强的富集能力, 其生物富集量和生物富集系数均高于肌肉组织。另外, 不同组织的脂质含量对于石油烃的选择性富集也有一定影响。贾晓平等^[30]针对广东沿岸牡蛎的研究表明, 石油烃含量差异与组织脂质含量、脂质组成等相关, 其中内脏含量最高, 闭壳肌含量最低^[30]。王召会等^[31]在研究辽东湾海域生物体内石油烃污染时, 也发现贝类内脏组织的石油烃含量高于肌肉组织。

4.   小结

该研究比较了菲律宾蛤仔肌肉和内脏2种组织对不同浓度0^#柴油和南海流花原油的生物富集动力学特征。结果发现, 随着水体中石油烃浓度的增大, 菲律宾蛤仔对石油烃的k₁和BCF均减小。油品种类会影响菲律宾蛤仔对石油烃的生物富集能力, 南海流花原油在菲律宾蛤仔体内的生物富集量和生物富集系数均高于0^#柴油, 不同油品的成分组成、含量差异以及处理方式可能是造成以上差异的主要原因。不同组织对石油烃的生物富集也存在差异, 菲律宾蛤仔的内脏组织对石油烃的生物富集量和生物富集系数均高于肌肉组织, 是溢油事故中双壳类软体动物积累石油烃的重要组织, 这种差异可能与组织特性、代谢功能、脂质组成及含量等因素相关。