近年来，中国养殖三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）流行一种以肌肉白化为典型特征的疾病，俗称“牙膏病（toothpaste crab）”，笔者实验室前期通过病理学和分子生物学等方法诊断出该病病原为一种微孢子虫——梭子蟹肌孢虫（Ameson portunus）^[1-2]。通过流行病学调查发现，2013年中国东、黄海野生三疣梭子蟹肌孢虫感染率平均为6.9%，江苏、上海沿海感染率高达10.6%；养殖三疣梭子蟹感染率更高，流行地区感染率高达90%以上^[1-2]。当气温降低后发病蟹大面积死亡可致塘口绝收，未发病蟹也由于经济价值丧失而对养殖业造成重大经济损失^[2-3]。由于微孢子虫在宿主细胞内寄生并拥有坚固的几丁质外壳保护^[4]，到目前为止仍然没有较好的治疗和控制措施^[5-6]，因此，建立病原的早期定量诊断技术，及早预警病原感染和疾病暴发风险，对于该病的防控具有重要意义。

截至目前，微孢子虫感染的常见检测方法有染色镜检^[7-8]、病理分析^[9-10]、免疫学方法^[11]以及分子生物学方法如PCR^[12-13]和LAMP^[14]等。每种检测方法各有自身的优势，在鉴定病原时常常需要几种方法相互印证^[15-16]。与其他方法相比，PCR方法可通过对特定核苷酸片断进行指数级的扩增实现对微量目的基因的检测^[17-18]，具有高度灵敏性和病原特异性的特点，在微孢子虫微量潜伏感染时具有其他方法无可比拟的优势^[19]；而且在常规PCR基础上发展起来的定量PCR技术，不仅比常规PCR具有更高的灵敏性^[20]，还能对微孢子虫感染量进行准确测定^[21-22]，可为微孢子虫病暴发风险的评估和预防控制措施的实施提供更为精准的参考与指导。然而，由于梭子蟹肌孢虫为笔者实验室新鉴定病原，国内外未见其他实验室的相关研究，因此，针对梭子蟹肌孢虫的各种特异性诊断技术还未见有报道。为了早期准确评估“牙膏病”发生风险，该研究建立了基于SYBR Green I的梭子蟹肌孢虫实时荧光定量PCR检测方法，以期为及早预警和防控梭子蟹“牙膏病”提供技术支撑。

1.   材料与方法

1.1   材料

健康三疣梭子蟹购自福建福鼎梭子蟹养殖户，经套式PCR方法检测为梭子蟹肌孢虫阴性；“牙膏蟹”购自江苏赣榆某养殖场；对照用溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌（V.parahemolyticus）和白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）为笔者实验室保存；病原定量检测用三疣梭子蟹样品采自江苏启东梭子蟹肌孢虫流行区的养殖户。

1.2   方法

1.2.1   引物

根据实验室前期测定并提交的梭子蟹肌孢虫SSU rRNA基因序列（GenBank登录号KC915038）设计了一对特异性引物，即上游AP-F（5′-AACARATAGATAGGGGCAGTA-3′）和下游AP-R（5′-TCTTCCGTCAATTTCTTTAA-3′），并经生工生物工程股份有限公司合成备用。

1.2.2   样品处理与DNA提取

用采集的“牙膏蟹”制备梭子蟹肌孢虫悬浮液，制备方法参照王元^[1]和王浩等^[2]。随后取1 mL梭子蟹肌胞虫悬浮液，经5 000 r·min^-1离心5 min后去上清，沉淀孢子用作后续实验。梭子蟹肌孢虫和三疣梭子蟹样品肌肉组织以及其他病原DNA的提取，分别参照王元^[1]和组织DNA提取试剂盒（Tiangen）的操作说明书进行。

1.2.3   实时定量PCR质粒标准品的制备

以梭子蟹肌孢虫DNA为模板，用合成引物进行常规PCR扩增，50 μL反应体系为Taq DNA Polymerase Mix（TaKaRa）25 μL，上、下游引物（10 μmol·L^-1）各1 μL，模板DNA 1 μL，双蒸水22 μL。PCR扩增条件为95 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循环35次；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物经过1.2%琼脂糖凝胶电泳，目的片段按照胶回收试剂盒操作说明书（TaKaRa）进行胶回收。回收片段经T4连接酶连接到pBluescript Ⅱ SK+载体，并转化到大肠杆菌感受态细胞JM-109，最后通过特异引物的PCR扩增方法筛选出阳性克隆。阳性菌株增殖培养后，使用碱裂解法提取质粒。

1.2.4   标准品质粒定量及稀释

把提取的质粒适度稀释后测定光密度（OD），确定质粒质量浓度（ng·μL^-1）。依据下述公式计算每微升质粒溶液中的质粒拷贝数：6.02×10²³×（质粒质量浓度×10^-9）/（片段长度×660）。根据计算结果，将质粒溶液浓度（拷贝·μL^-1）调整为2.0×10⁹后进行10倍梯度稀释，直至2.0×10¹ 拷贝·μL^-1，所有梯度溶液作为质粒标准品保存至-80 ℃冰箱中备用。

1.2.5   实时定量PCR反应体系与扩增条件的优化

梭子蟹肌孢虫实时定量扩增反应在StepOne plus（ABI）定量PCR仪上进行，反应体系参照试剂盒SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ（TaKaRa）的试剂组成，总体积为10 μL，其中含有2×SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ 5 μL，不同终浓度的上、下游引物（0.1~1.0 μmol·L^-1）各2 μL，并以2.0×10⁶ 拷贝·μL^-1质粒标准品1 μL作为DNA模板。扩增条件为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，t ℃ 20 s（t=60、63和65），循环40次，确定最佳引物浓度和最佳退火温度。

1.2.6   实时定量PCR方法的敏感性检测

对不同浓度的质粒标准品（2.0×10⁹~2.0×10¹ 拷贝·μL^-1）采用1.2.5优化后的实时定量PCR体系和条件在实时定量PCR仪上扩增，以Ct≤35且出现标准“S”型扩增曲线的标准品的最低稀释度作为检测的敏感度，即检测下限，并与常规PCR方法进行敏感性对比分析。

1.2.7   实时荧光定量PCR的特异性检测

为了检验该引物对梭子蟹肌孢虫检测的特异性，分别提取梭子蟹常见病原如溶藻弧菌、副溶血弧菌和WSSV的DNA，以及“牙膏蟹”和健康三疣梭子蟹的肌肉总DNA，并以2.0×10⁶ 拷贝·μL^-1的标准品质粒作阳性对照，以无DNA酶水为阴性对照，按照该研究建立的实时荧光定量PCR方法进行扩增。

1.2.8   标准曲线的绘制及重复性实验

以质粒标准品（2.0×10⁹~2.0×10² 拷贝·μL^-1）作为模板，且每个浓度梯度设置5个重复，采用1.2.5优化后的实时定量PCR体系和条件在实时定量PCR仪上扩增，结束后，仪器自动分析得出Ct与标准品浓度相关性的线性方程、相关系数R²等，利用Excel 2010对Ct值进行方差分析，并计算组内变异系数（C.V.），分析该定量PCR方法的组内重复性；组间重复是将标准品置于-80 ℃冰箱储存60 d后再扩增，用SPSS 19.0软件进行显著性检验，分析即时扩增与长期储存后标准曲线的稳定性。该实验重复2次。

1.3   实时定量PCR与套式PCR方法对梭子蟹样品的检测

对采自启东“牙膏病”流行区的待检三疣梭子蟹样品，按照王元^[1]的方法分别提取肌肉组织总DNA，然后用该研究建立的SYBR Green I实时定量PCR方法和笔者实验室前期已经建立的套式PCR方法分别检测，分析比较2种方法对样品中梭子蟹肌孢虫的检出率。

2.   结果

2.1   标准品质粒PCR扩增

以制备的梭子蟹肌孢虫质粒标准品为模板，使用特异引物AP-F和AP-R进行常规PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳分析，获得大小约为290 bp的单一条带，该条带与目的片段大小一致（图 1）。

图  1  质粒中目的片段的PCR扩增结果

M. DL2000 marker；1~6.质粒标准品（浓度为2.0×10⁴ 拷贝·μL^-1）

Figure  1.  PCR products of A.portunus gene fragments cloned in the plasmid

1~6.A.portunus standards (2.0×10⁴ copies·μL^-1)

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2.2   反应体系的优化

不同引物浓度的实时定量PCR扩增结果显示，引物的终浓度为0.2 μmol·L^-1时对同一标准品能获得较小的Ct值和较强的荧光信号强度，对不同标准品的扩增产物熔解曲线分别均为单一尖锐峰，而对阴性对照无扩增（图 2），因此，确定该浓度为引物最佳终浓度。如此经过一系列参数优化后，最终确定最佳梭子蟹肌孢虫实时荧光定量PCR反应体系为总体积10 μL，其中2×SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ 5 μL，上、下游引物(1.0 μmol·L^-1)各2 μL，DNA模板1 μL；当退火温度为60 ℃时，扩增效率和引物特异性最佳，因此，确定该实时定量PCR方法的最优扩增条件为95 ℃ 30 s预变性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循环40次。

图  2  实时定量PCR扩增产物的熔解曲线

中文注解A~H.不同浓度质粒标准品（从高到低依次为2.0×10⁹~2.0×10²拷贝·μL^-1）；图中蓝色无峰熔解曲线来自阴性对照（无DNA酶水）alt-text> A~H. A.portunus standards of different concentrations (from 2.0×10⁹ to 2.0×10² copies·μL^-1); the blue melting curve without a peak is the product of negative control (DNase-free ddH₂O).

Figure  2.  Melting curves of real time qPCR products

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2.3   标准曲线的绘制

运用优化好的实时定量PCR反应体系和条件，取浓度为2.0×10⁹~2.0×10² 拷贝·μL^-1的质粒标准品作为模板进行实时定量PCR扩增，获得该定量方法的标准曲线（图 3）。该标准曲线的线性方程为Ct=-3.26X+35.57（X为质粒拷贝数的对数），相关系数R²=0.999，表明标准曲线线性关系良好；由标准曲线斜率计算出反应扩增效率为101.45%，介于最优值范围内（95%~105%）；得到的组内的变异系数范围在0.35%~1.33%（表 1）。以上系列标准品置于-80 ℃冰箱保存60 d后，重复上述扩增，结果见表 2，8个浓度梯度显著性分析结果P＞0.05，说明-80 ℃下储存60 d和即时稀释的标准品扩增的标准曲线差异不显著。组内和组间重复性结果均表明，该研究构建的实时定量PCR方法重复性好、稳定性高。

图  3  实时定量PCR方法的标准曲线

Figure  3.  Standard curve of real time qPCR amplification method for A.portunus plasmid

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表  1  实时定量PCR检测不同浓度质粒标准品的组内重复性

Table  1.  Intra-group variability of real time qPCR for A.portunus plasmid

质粒/拷贝·μL-1 plasmid	质粒Ct值 Ct values of parallel tests of plasmids					Ct平均值 mean Ct of intra-group	标准偏差 S.D.	变异系数/%C.V.
	1	2	3	4	5
2.0×109	5.26	5.16	5.21	5.25	5.24	5.22	0.04	0.77
2.0×108	8.48	8.45	8.52	8.46	8.49	8.48	0.03	0.35
2.0×107	11.69	11.93	11.82	11.67	11.59	11.74	0.13	1.11
2.0×106	15.22	14.93	15.14	14.71	15.09	15.02	0.20	1.33
2.0×105	18.35	18.23	18.18	18.11	18.47	18.27	0.14	0.77
2.0×104	21.42	21.59	21.65	21.49	21.51	21.53	0.09	0.42
2.0×103	24.88	24.85	24.96	24.70	24.56	24.79	0.16	0.65
2.0×102	28.12	28.04	28.03	28.21	27.90	28.06	0.12	0.43

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表  2  实时定量PCR检测不同浓度质粒标准品的组间重复性

Table  2.  Inter-group variability of real time qPCR for A.portunus standards

质粒/拷贝·μL-1 plasmid	F	P
2.0×109	0.65	0.33
2.0×108	0.09	0.64
2.0×107	0.41	0.13
2.0×106	0.25	0.10
2.0×105	0.16	0.23
2.0×104	0.19	0.53
2.0×103	0.23	0.52
2.0×102	0.12	0.70

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2.4   敏感性分析

用浓度为2.0×10⁹~2.0×10¹拷贝·μL^-1的质粒作为模板，用该研究建立的实时定量PCR方法检测，结果见图 4。所有模板均有较强的荧光信号，并得到良好的“S”型扩增曲线。至模板浓度为2.0×10¹拷贝·μL^-1时仍能有效扩增（Ct=35），符合荧光定量PCR扩增效率要求（Ct≤35）。与此同时，把这些模板进行套式PCR扩增，发现当模板浓度降低到2.0×10²拷贝·μL^-1时，扩增产物明显减少，而当模板浓度降低到2.0×10¹拷贝·μL^-1时，就不再出现目的条带（图 5）。可见该研究建立的实时定量PCR检测方法具有更高的检测灵敏度。

图  4  梭子蟹肌孢虫实时定量PCR方法的灵敏性试验

1~9.不同浓度质粒标准品（从高到低依次为2.0×10⁹~2.0×10¹拷贝·μL^-1）；10.无DNA酶水

Figure  4.  Sensitivity of real time qPCR method for A.portunus

1~9. A.portunus standards of different concentrations (from 2.0×10⁹ to 2.0×10¹ copies·μL^-1); 10. DNase-free ddH₂O

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图  5  梭子蟹肌孢虫质粒标准品的套式PCR扩增结果

1~9.不同浓度质粒标准品（从高到低依次为2.0×10⁹~2.0×10¹ 拷贝·μL^-1）；10.无DNA酶水；M. DL2000 marker

Figure  5.  Nested PCR products of A.portunus standards

1~9. A.portunus plasmids of different concentrations (from 2.0×10⁹ to 2.0×10¹ copies·μL^-1); 10. DNase-free ddH₂O

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2.5   特异性检测

运用该研究建立的实时定量PCR方法对典型“牙膏蟹”的肌肉DNA模板进行扩增后，获得了与质粒标准品类似的“S”形扩增曲线，而其他样品如WSSV、健康梭子蟹肌肉、溶藻弧菌以及副溶血弧菌的DNA模板均未出现明显的扩增曲线（图 6）。检测结果表明，该研究建立的梭子蟹肌孢虫实时定量PCR检测方法具有良好的病原特异性。

图  6  梭子蟹肌孢虫实时定量PCR方法的特异性试验

1.质粒标准品（2.0×10⁶ 拷贝·μL^-1）；2. “牙膏蟹”肌肉；3. WSSV；4.健康三疣梭子蟹肌肉；5.溶藻弧菌；6.副溶血弧菌；7.无DNA酶水

Figure  6.  Specificity of real time qPCR method for A.portunus

1. plasmid (2.0×10⁶ copies·μL^-1); 2. muscle of "toothpaste crab"; 3. WSSV; 4. muscle of the healthy P.trituberculatus; 5. V.alginolyticus; 6. V.parahemolyticus; 7. DNase-free ddH₂O

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2.6   三疣梭子蟹样品的定量检测

为了验证该研究建立的梭子蟹肌孢虫实时定量PCR方法对未知样品检测的可靠性，并初步探究梭子蟹肌孢虫载量与梭子蟹健康状态的关系，分别运用此定量方法和梭子蟹肌孢虫套式PCR检测方法，对来自梭子蟹肌孢虫流行区的3组养殖三疣梭子蟹样品进行检测，结果见表 3，套式PCR方法对梭子蟹肌孢虫的检出率为64.71%，而该研究建立的实时定量PCR方法的检出率为82.35%。

表  3  养殖三疣梭子蟹中梭子蟹肌孢虫的检测结果

Table  3.  Detection of A.portunus DNA in cultured P.trituberculatus samples

养殖户 company	样品编号 sample No.	套式PCR nested PCR	qPCR 拷贝·（ngMuDNA）-1	qPCR 拷贝·（mgMu）-1	蟹状态 status of crab
M	1	+	4.92×108	3.15×1010	D
	2	+	4.07×108	4.07×1010	D
	3	+	3.89×102	2.47×104	D
	4	-	2.69	1.74×102	D
	5	+	2.10×104	1.65×106	D
	6	+	1.43×108	1.04×1010	D
	7	+	3.48×108	2.27×1010	D
	8	+	1.16×104	8.48×105	D
L	9	+	3.00×102	1.98×104	A
	10	-	5.85	3.67×102	A
	11	+	1.15×106	8.60×107	A
	12	+	3.70×106	2.67×108	A
Z	13	-	4.55	3.43×102	A
	14	+	5.33×107	4.89×109	D
	15	-	NA	NA	A
	16	-	NA	NA	A
	17	-	NA	NA	A
注：+.阳性；-.阴性；D.死；A.活；Mu.肌肉；NA.无扩增 Note：+. positive；-. negative；D. dead；A. alive；Mu. muscle；NA.no amplification

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3.   讨论

三疣梭子蟹感染微孢子虫后的早期临床症状不明显，不易被养殖户发现，而且该病原增殖较慢，对摄食等行为没有影响，以致该病往往到收获季节才大量暴发，导致经济损失严重。因此，需建立一种高效的病原检测技术，以便在潜伏期及早发现病原感染，及时采取措施抑制病原增殖、控制病原传播，有效预防“牙膏病”暴发。

实时荧光定量PCR技术是在传统PCR扩增的基础上，通过对反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，同时实现对起始模板的定量及定性分析^[23-24]，不仅灵敏度更高，还可以实现对病原感染量的准确认定。常用定量PCR检测技术分探针法和SYBR Green I染料法，基于染料法建立的实时定量PCR检测技术，具有成本更低、操作更为简便的特点^[20]。特异性实验结果显示，该方法对宿主三疣梭子蟹及其养殖过程中的常见病原——溶藻弧菌、副溶血弧菌和WSSV等的DNA模板都没有产生有效扩增，而对“牙膏蟹”的DNA模板和阳性质粒扩增良好，形成典型的“S”形扩增曲线，显示该方法具有高效的扩增效率和极强的病原特异性；而且，灵敏性实验结果还表明，当反应体系中的阳性质粒或养殖三疣梭子蟹样品DNA的模板量为20个拷贝（copies）时仍能保持有效扩增。对比国内外同类技术研究可见，DURAND等^[25]采用探针法针对WSSV建立的实时定量PCR技术在体系中含有400个拷贝以上时，Ct值才在可信区内（Ct≤35）；PHELPS等^[26]基于探针法建立了针对金体美洲鳊鱼（Notemigonus crysoleucas）微孢子虫（Ovipleistophora ovariae）的实时定量检测方法，对阳性质粒模板的检测下限为9拷贝·体系^-1，但是，此检测下限对应的Ct值大于35个循环；刘珍等^[20]针对感染凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）的虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）建立了基于染料法的实时定量检测方法，对反应体系中质粒标准品的检测灵敏度约为83个拷贝。综合以上分析可知，该研究建立的梭子蟹肌孢虫实时定量PCR方法具有很高的病原特异性和灵敏性；组内与组间实验也表明，该法具有良好的稳定性以及组内和组间重复性，因此，适用于梭子蟹肌孢虫微量潜伏感染时期的监测。另外，在与套式PCR的对比分析中还发现，该研究建立的实时定量PCR方法比先前的套式PCR方法具有更高的检出率，显示了更高的检测灵敏性，这与刘珍等^[20]的研究报道一致。综上，该研究基于SYBR Green I染料法建立的梭子蟹肌孢虫实时定量PCR技术具有很高的病原特异性、灵敏性和实用性，可作为梭子蟹肌孢虫防控过程的技术支撑。

实验室前期研究发现^[1]，梭子蟹肌孢虫与Ameson属的其他微孢子虫^[27-29]类似，主要靶向宿主三疣梭子蟹的肌肉组织，感染蟹因肌纤维断裂、溶解而使肌肉呈现“牙膏样”白化症状。该研究对流行区养殖三疣梭子蟹样品的检测结果表明，死亡蟹肌肉中的梭子蟹肌孢虫载量为1.74×10²~4.07×10¹⁰ 拷贝·mg^-1，平均为1.22×10¹⁰拷贝·mg^-1，而活蟹的载量为0~2.67×10⁸拷贝·mg^-1，平均为4.41×10⁷拷贝·mg^-1，可见，活蟹的平均带虫量大幅低于死蟹，而且活蟹多数个体的带虫量很低甚至无虫（2只微孢子虫含量高的蟹大幅拉高了活蟹带虫平均值），而死蟹大多带虫量很高，说明该地区梭子蟹的死亡与肌孢虫的感染密切相关。此外，活蟹与死蟹的最高带虫量显示，梭子蟹肌孢虫载量达到1.0×10⁹ 拷贝·mg^-1左右时就预示三疣梭子蟹存在暴发疾病甚至死亡的风险。这与PALENZUELA等^[30]的研究结果一致。他们研究表明，微孢子虫感染可导致宿主鱼严重死亡。该文研究结果还显示，死蟹中也有少量个体带虫量很低，表明该地区梭子蟹的死亡应该还与其他因素有关。事实上，笔者实验室在进行细菌分离鉴定时，发现M养殖户的部分梭子蟹存在较重的弧菌性感染。已有研究表明，多数微孢子虫感染可导致宿主免疫力暂时下降，容易继发感染其他病原^[31]，因此，及早发现微量微孢子虫的感染不仅有利于及时控制病原增殖、防止疾病暴发，还能提示其他病原的并发或继发感染风险。