Molecular cloning and expression analysis of aspartate aminotransferase (AST) in Penaeus monodon under ambi-ent ammonia stress
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摘要:
为了探索天门冬氨酸转氨酶(AST)在斑节对虾(Penaeus monodon)氨氮(NH3-N)解毒代谢中的作用, 该研究利用RACE技术获得了斑节对虾AST基因(PmAST)的cDNA全长序列, 进行了相关生物信息学分析, 在此基础上采用荧光定量与氨氮胁迫实验的方法研究了PmAST基因在斑节对虾的不同组织以及不同浓度氨氮胁迫过程中差异表达情况。该序列全长1 957 bp, 开放阅读框(ORF)为1 242 bp, 3′非编码区(UTR)为584 bp, 包括含有30个碱基的poly(A)尾, 5′非编码区(UTR)为131 bp。ORF可编码413个氨基酸, 预测分子量为45.852 kD, 理论等电点为8.85。序列含有1个AAT-like超家族结构域、15个磷酸化位点和2个糖基化位点。PmAST的mRNA在斑节对虾各组织中都有表达, 在肝胰腺中表达量最高, 其次为鳃组织, 在胃和脑组织中的表达量最低。96 h氨氮胁迫后荧光定量PCR分析结果表明, PmAST在肝胰腺和鳃组织中都具有不同程度的表达上调, 显著高于对照组(P < 0.05)。研究结果表明斑节对虾的PmAST基因在氨氮胁迫条件下会出现表达上调, 并且氨氮浓度越高其上调幅度也越大, 所以PmAST参与了斑节对虾的急性氨氮胁迫应答。
Abstract:To explore the function of aspartate aminotransferase gene in the process of the ammonia nitrogen metabolism of black tiger shrimps (Penaeus monodon), the full-length cDNA sequence of aspartate aminotransferase from P.monodon (PmAST) was obtained by high throughput transcriptome sequencing and rapid amplification of cDNA ends.On this basis, the expression of the PmAST in different tissues under different ambient ammonia stress were detected by fluorescence-quantitative real time PCR.The cDNA length of PmAST was 1 957 bp, including a 5′UTR of 131 bp and a 3′UTR of 584 bp.The length of the open reading frame (ORF) was 1 242 bp encoding a polypeptide of 413 amino acid.The molecular mass of the deduced amino acid (aa) sequence was 45.852 kD with an estimated pI of 8.85, and there was a tailing signal (poly A) with 30 bp length.Like other animals′ ASTs, the structure of PmAST protein included an AAT-I superfamily domain.There were 15 phosphorylation sites and 2 glycosylation sites in this protein.Analysis of the tissue expression pattern of the PmAST shows that PmAST mRNA was expressed in all tested tissues, including ovary, haemolymph, brain, lymph, stomach, muscle, thoracic ganglia, heart, hepatopancreas and gill.The PmAST expression reached the maximum value in hepatopancreas and was the lowest in brain.After ambient ammonia stress experiment, the expression of the PmAST in hepatopancreas and gill was significantly higher than that in the control (P < 0.05), and the expression profiles differed between hepatopancreas and gill.The result shows that the higher the ambient ammonia concentration is, the greater the increase of PmAST expression will be.Therefore, the PmAST takes part in acute ammonia stress.
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Keywords:
- Penaeus monodon /
- AST /
- ambient ammonia stress /
- gene clone /
- tissue expression
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一般地在鱼类内分泌系统中，脑下垂体-甲状腺轴对生长发育、物质能量代谢、繁殖等生命活动均发挥着非常重要的作用[1-3]。一方面，促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)首先作用于甲状腺组织，刺激甲状腺组织合成、分泌甲状腺激素(thyroid hormone，TH)，然后TH与机体组织中的TH受体结合，从而影响了机体的生长、发育以及繁殖等生命过程；另外，机体内TH水平对TSH的分泌也起到负反馈调节。在鱼类，TSH和促性腺激素都是糖蛋白激素，这几种糖蛋白激素都是由α和β 2个亚基组成，其中，每种动物中的α亚基是相同的，而β亚基都是不同的，激素的特异性是由β亚基所决定的。不同的基因分别指导α和β亚基的合成，两者在质膜上以非共价键结合，形成具有生物活性的二聚体分子蛋白[4]。
另一方面，鱼体内产生的雌激素主要是在垂体促性腺激素的作用下由卵巢滤泡细胞合成和分泌的C-18性类固醇激素。鱼类卵巢能产生和分泌的雌激素主要包括雌二醇(estradiol-17β，E2)和雌酮(estrone)2种，其中以E2的活性最强[5]。在硬骨鱼类中，E2具有促进肝组织合成和释放卵黄蛋白前体物质(卵黄蛋白原)[6]及提高血液中Ca2+水平的作用[7]。而且研究结果显示，E2对早期发育[8]、性分化[9]、生长[10]、免疫系统功能[11]、营养物质的利用[12]、性逆转[13]、血液中降血钙素水平[14]、遗传因子的调控[15]等生命活动过程也发挥着巨大的作用。因此，E2对鱼类正常的生理活动起着重要的作用。
可是，近几十年来，随着科技和现代工业的高速发展、人口数量的增多以及人类开发利用自然资源能力和范围的不断扩大，环境污染已逐渐成为威胁人类生存的重大问题之一。在有些河流、湖泊、污水处理排放口等水体中存在一定数量的污染物。研究显示，有些环境污染物可以通过模拟机体激素的作用来干扰、扰乱内源性激素的产生，从而改变机体内分泌系统的正常功能作用。进一步研究还显示，一些内分泌干扰物具有雌激素或雄激素效应[16-17]。因此，为明确具有雌激素效应的内分泌干扰物对生物体的危害，首先对过量的外源性雌激素，如E2对生物体内分泌系统的干扰作用进行研究是非常重要的。
异育银鲫(Carassius auratus)具有适应性强、疾病少、成活率高、生长速度快、养殖周期短、产量高、耐低温低氧、市场价格高等优点，深受广大水产养殖户的喜爱，并且异育银鲫在我国分布广泛。因此，本实验以异育银鲫为研究对象，运用实时荧光定量RT-PCR方法和放射免疫方法(RIA)检测了外源性E2对其脑垂体-甲状腺轴的影响，以期能够探讨和明确外源性E2对生物机体的危害，并为健康水产养殖标准的制定和保护人类的生存环境等方面提供新的理论和依据。
1. 材料和方法
1.1 实验动物
异育银鲫购于上海孙桥水产养殖良种场，体重在45 g左右。购回后暂养于实验室160 L水族箱内，每日按照1%的体重比喂食饵料、暂养。1周后，挑选健康样本作为实验对象，实验期间均不喂食饲料。
1.2 主要试剂
E2购于Sigma公司；M-MLV-RT试剂盒购于Promega公司；RNA抽提试剂TrizolⓇ Reagant购于Invitrogen公司；Perfect Real Time(SYBR Green Ⅰ)荧光定量反应试剂盒以及PCR反应试剂购于Takara公司；放射免疫分析试剂盒购于上海放射免疫分析技术有限公司。
1.3 激素的配制、注射和样本收集
首先称取适量E2用无水乙醇进行溶解配制成母液，通过小剂量倍比稀释实验找出其溶解下限-酒精浓度57%，然后将E2溶解在57%的酒精中。
将健康的异育银鲫分成4个注射组，每组6尾。实验组为注射3次0.5 mg·kg-1体重的E2组和注射5次0.5 mg·kg-1体重的E2组；对照组为注射3次同剂量的57%酒精组和注射5次同剂量的57%酒精组。
该4个注射组均采用肌肉注射法，每2周注射一次，在第3、第5次注射完后的第3天取样。取样时，采用断尾取血法收集血液，然后分离血清，－20℃保存备用；同时，自异育银鲫头部蝶鞍骨背面的小骨腔内取出脑下垂体于1.5 mL经DEPC处理过的离心管中，－70℃保存备用。实验期间所有注射组均无死亡现象发生。
1.4 定量模板的制备
按照TrizolⓇ Reagant试剂制造商提供的方法，从异育银鲫脑垂体中提取总的RNA。将所提取的RNA样本放于－80℃冰箱保存备用。反转录按照Promega公司M-MLV-RT试剂盒说明书进行。
1.5 引物设计
实时荧光定量RT-PCR是检测低丰度、或者从有限的组织中检测mRNA量的敏感方法之一。为了去除不同标本在RNA产量、质量以及反转录效率上可能存在的差别而得到目标基因特异性表达的真正差异，通常选择一内参基因进行校正和标准化。所以，本实验首先根据已获得的异育银鲫TSH-β基因cDNA序列[18]和金鱼beta-actin cDNA序列，运用Primer Premier 5结合Dnastar分析软件及在线BLAST，分别设计、合成了适用于荧光定量的目的片段(TSH-β cDNA)引物和内参片段(beta-actin cDNA)引物。引物序列如下：
目的片段引物(产物长度为176 bp)：
上游引物：5′GGGTATTTTGATGAAGGTAGCC 3′
下游引物：5′CTTTGAACCAGGAAACGAGC 3′
内参片段引物(产物长度为127 bp)：
上游引物：5′GATGCGGAAACTGGAAAGG 3′
下游引物：5′ACTGTGAGGGCAGAGTGGTAG 3′
1.6 实时荧光定量RT-PCR检测TSH-β mRNA表达水平
利用SYBR Green Ⅰ荧光染料在ABI Prism 7000荧光定量PCR仪上检测TSH-β mRNA的表达水平。优化后的实时定量RT-PCR体系如下：SYBRⓇ Premix EX TaqTM (2×)10 μL，上、下游引物(10 μM)各0.4 μL，ROX Reference Dye (50×)0.4 μL，DNA模板2.0 μL (< 100 ng)，灭菌双蒸水6.8 μL，总量20 μL。将反应体系稍微离心后放入定量PCR仪内进行扩增。反应条件：95℃，10 s；95℃，5 s，60℃，30 s，45个循环。反应结束后，系统将采集到的每一循环反应时各反应管荧光强度的增长指数(DRn)进行分析，绘制每一反应管的扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值(threshold)时的扩增循环数(Ct值)。最后将每个内参样品的Ct值除以相应目的样品的Ct值，进而得出每个样品的相对精确值。最后，将所扩增的PCR产物进行溶解曲线分析(检测温度：60℃)。
1.7 血清T3和T4含量水平的测定
异育银鲫血清中甲状腺激素T3和T4水平的检测采用常规T3和T4放射免疫测定方法(RIA)测定。首先分别配制T3标准液(0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和8.0 ng·mL-1)和T4标准液(0.5、1.25、2.5、3.75、5、7.5、10、15、20和40 ng·mL-1)，建立T3和T4标准曲线。然后对待测样品进行T3和T4含量测定。
1.8 数据处理
每组数据均以平均值±标准差表示，显著性检验采用t检验，P < 0.05时认为差异显著；P < 0.01时认为差异极显著。数据统计采用SAS 6.0统计软件进行。
2. 结果
2.1 荧光定量效果鉴定分析
为保证本实验结果数据的准确性，首先随机抽取5个样本进行预实验，以求对荧光定量PCR仪功效以及样品质量进行鉴定。扩增曲线显示PCR扩增指数增长期及平台期曲线都较为整齐，无不正常、不规则条带出现(图 1)。说明荧光定量PCR仪性能良好，PCR条件适当，扩增效果较好。
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图 1 荧光定量RT-PCR扩增曲线分析Figure 1. Amplification curve analysis of fluorescence real time PCR溶解曲线分析显示，特异性扩增产物都具有相同的Tm值。目的片段PCR产物的Tm值在83℃左右，内参片段PCR产物的Tm值在80.5℃左右，溶解温度单一(图 2)。将该随机抽取的五个样本进行PCR扩增反应后，经琼脂糖凝胶电泳鉴定也同样证明了引物具有很强的特异性，并且所得目的片段产物和内参片段产物与预测大小一致，且均为单一条带(图 3)。在此基础上，我们检测了外源性E2对异育银鲫TSH-β mRNA表达的影响。
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图 3 异育银鲫内参片段和目的片段PCR产物凝胶电泳结果1~5. 内参PCR产物；6~10. 目的PCR产物；11. 100 bp分子量Figure 3. Agarose electrophoresis of the PCR products of beta actin and C. auratus TSH-β1~5. PCR products of beta-actin; 6~10. PCR products of TSH-β; 11. 100 bp marker2.2 外源性E2对异育银鲫TSH-β mRNA表达水平的影响
注射3次与5次外源性E2后，异育银鲫TSH-β mRNA表达水平与对照组相比均未有显著差异(P>0.05)。但随着注射次数的增加，总体呈现一个升高的趋势(图 4)。另外，对照组注射5次与3次相比TSH-β mRNA的表达水平无显著差异(P>0.05)。
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图 4 注射外源性E2对异育银鲫TSH-β mRNA表达水平的影响(n=6)Figure 4. Effects of exogenous E2 injection on the expression level of C. auratus TSH-β mRNA(n=6)2.3 外源性E2对异育银鲫血清甲状腺激素T3和T4含量水平的影响
注射3次和5次外源性E2后，异育银鲫血清甲状腺激素T3和T4含量水平与对照组相比均出现了显著差异(图 5)。从图 5中可以看到：注射3次后，血清T3和T4水平与对照组相比显著升高(P < 0.05)，而且血清T4水平较T3更为明显；注射5次后，血清T3和T4水平与对照组相比出现了极显著升高(P < 0.01)。另外，对照组5次与3次相比血清T3和T4水平无显著性变化(P>0.05)。
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图 5 注射外源性E2对异育银鲫TH水平的影响(样本n=6)“*”，“**”分别表示差异显著(P < 0.05)和极显著(P < 0.01)Figure 5. Effects of estradiol injection on serum thyroid hormone concentration of C. auratus(n=6)The significant difference levels at 5% (P < 0.05)and 1% (P < 0.01) were denoted by "*" and "* *" respectively.3. 讨论
本研究运用SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法以及RIA方法检测了外源性E2对异育银鲫脑下垂体-甲状腺轴的影响。研究结果显示，在实验条件下随着注射次数的增加，外源性E2使异育银鲫TSH-β mRNA的表达量出现了逐渐升高的趋势，但与对照组相比，并无显著性差异。这与YOUNG和BALL[19]的研究结论较为相似，其研究发现外源性E2对鳉鱼(Poecilia latipinna)TSH活性无显著性影响；但与国内外一些学者如OLIVEREAU等[20]、QU等[21]的研究结果略有不同。他们研究显示外源性E2使TSH细胞活性，TSH-β mRNA的表达水平出现了显著升高。上述结果与本结果不同，可能是由于研究对象种类以及发育阶段的不同、外源激素注射剂量以及实验条件等不同而导致外源性E2作用结果出现了差异所致。
另一方面，利用RIA方法对异育银鲫血清甲状腺激素T3和T4含量水平的测定结果显示，在本实验条件下，随注射次数的增加，注射外源性E2使异育银鲫血清T3和T4水平显著升高。该结果与BANDYOPADHYAY等[22]的体外研究结果有相似之处。BANDYOPADHYAY研究发现，在培养液中加入1~100 ng E2时，对缘鳢(Channa gachua)甲状腺滤泡分泌T4具有促进作用。但与OLIVEREAU[20]、QU等[21]以及LEATHERLAND等[23]的体内研究结果不同。OLIVEREAU等[20]研究表明外源性E2能降低欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)血浆T3和T4的水平；QU等[21]对日本鳗鲡(A.japonica)的研究也表明注射外源性E2能降低血清T3和T4水平；LEATHERLAND等[23]研究显示，注射外源性E2能同时降低鲑科鱼类虹鳟(Salmo gairdneri)T3和T4水平，而埋植外源性E2时只对T3有降低作用，对T4水平无影响。上述结果可能由于实验条件、实验所用研究对象种类、鱼体的不同发育阶段[24]等不同。
综合本实验结果可以推测：(1)E2可能作用于鱼类的脑下垂体，增强脑垂体对促甲状腺激素释放激素的反应，从而使TSH的合成和分泌出现了一定程度的增加[25]，所以TSH-β mRNA的表达水平略有增加或显著升高。由此，可能导致了血清中甲状腺激素T3和T4水平的显著性升高。(2)E2也可能作用于甲状腺组织促使甲状腺组织释放了TH[22]，然后TH通过脑垂体-甲状腺轴的负反馈系统抑制了TSH-β mRNA表达水平的进一步升高。至于E2具体作用于异育银鲫脑垂体还是作用于甲状腺组织或对2组织同时发挥作用，还有待进一步研究。
在实验设计中，为明确外源性E2对异育银鲫脑垂体-甲状腺轴的影响而设计了E2注射组和对照组；另外，为排除实验期间异育银鲫由于获得饵料情况的不同而产生的生理差异的影响，整个实验期间动物没有给予投喂饲料。虽然在整个实验期间没有投喂饲料对异育银鲫的正常生理会有一定的影响，但对于本研究所要阐述问题的目的没有影响。国内、外研究者也有很多类似的研究论文发表[20, 26]。
本实验以异育银鲫为研究对象，从基因水平及内分泌角度研究了外源性E2对其脑垂体-甲状腺轴的影响。实验结果在一定程度上说明了外源性E2能够对异育银鲫脑垂体-甲状腺轴的正常生理功能产生一定的影响作用。从而为内分泌干扰物可能对生物机体产生一定的影响这一理论提供了一定的证据。与此同时，论文结果对于保护动物的繁衍和生存有着重要的意义，也为创建健康水产养殖标准和保护人类的生存环境提供新的理论和科学依据。
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图 1 斑节对虾AST基因的核酸和氨基酸序列
两边每行标注的序号是指核苷酸和氨基酸的位置; 起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)用下划线标出; poly(A)尾巴用斜体字标出; 字体加粗标注为多肽结合位点; 灰色阴影标注为糖基化位点; 方框所示为谷AAT-like超家族结构域; 圆框中为磷酸吡哆醛结合位点; 三角框中为Lys催化残基。
Figure 1. Nucleotid and amino acid sequences of PmAST
The serial numbers on both sides of each row refer to the location of nucleotides and amino acids; start codon (ATG) and termination codon (TAA) are underlined; "*" indicates stop codon; the poly (a) signals are in italics; eight poly peptide sites are highlighted in bold; shadow area indicates two glycosylation sites; the completed AAT-I superfamily domains are shown in the box; ten PLP binding sites are represented by round frames; the catalytic residue is marked by a triangle.
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图 2 斑节对虾AST蛋白与小鼠AST蛋白三维结构空间示意图
Figure 2. Three-dimensional ribbon structures of PmAST protein and M.musculus AST
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图 3 PmAST的氨基酸序列与其他物种AST的氨基酸多重序列比对
Figure 3. Multiple alignment of predicted amino acid sequence of PmAST with other eukaryote AST amino acid sequences
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图 4 利用MEGA 6.0软件构建的基于PmAST基因所编码氨基酸序列的NJ系统进化树
Figure 4. NJ phylogenetic tree based on PmAST amino acid sequences by MEGA 6.0
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图 5 斑节对虾AST基因在各组织表达情况
HE.肝胰脏; G.鳃; M.肌肉; H.心脏; TG.胸神经; O:卵巢; HA.血淋巴L.淋巴; S.胃; B.脑; 图中数值为平均值±标准差(X ±SD), 小写字母不同表示差异性显著(P < 0.05)。
Figure 5. Expression of P.monodon AST in different tissues
HE.hepatopancreas; G.gill; M.muscle; H.heart; TG.thoracic ganglia; O.ovary; HA.haemolymph; L.lymph; S.stomach; B.brain; values (X ±SD) with different letters are significantly different from one another (P < 0.05).
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图 6 斑节对虾肝胰腺和腮中PmAST基因在氨氮胁迫过程中表达变化情况
图中数值为“平均值±标准差(X ±SD)”, 同一时间内小写字母不同表示实验组与对照组差异性显著(P < 0.05)。
Figure 6. Expression profiles of PmAST gene in P.monodon hepatopancreas and gill during ambient ammonia stress
Values (X ±SD) with different lowercase letters at the same time are significantly different with the control (P < 0.05).
表 1 斑节对虾AST基因克隆与表达分析所用引物序列
Table 1 Oligonucleotide primers used in the experiment
引物名称
primer引物序列(5′→3′)
primer sequence用途
functionTZ-F AATACGCTTCGCTCCGC 已知片段验证 TZ-R TTGCCTGCTTTGTTTACCAT TZS1 CCATCAGAGACTGGAGTCACATCA 3′RACE TZS2 TTCTGTGTACCTGACAAAGGATGG TZA1 CACCAACGCCAAGATTC 5′RACE TZA2 TGTCACGCTTGAATGCC β-actin-F AGTAGCCGCCCTGGTTGTAGA 内参基因 β-actin-R TTCTCCATGTCGTCCCAGT TZD-F AGCCCAGTTATTGCCGATG 荧光定量 PCR TZD-R GAAGGTGGAGCCAATACGGA 
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