Molecular cloning and expression analysis of aspartate aminotransferase (AST) in Penaeus monodon under ambi-ent ammonia stress
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摘要:
为了探索天门冬氨酸转氨酶(AST)在斑节对虾(Penaeus monodon)氨氮(NH3-N)解毒代谢中的作用, 该研究利用RACE技术获得了斑节对虾AST基因(PmAST)的cDNA全长序列, 进行了相关生物信息学分析, 在此基础上采用荧光定量与氨氮胁迫实验的方法研究了PmAST基因在斑节对虾的不同组织以及不同浓度氨氮胁迫过程中差异表达情况。该序列全长1 957 bp, 开放阅读框(ORF)为1 242 bp, 3′非编码区(UTR)为584 bp, 包括含有30个碱基的poly(A)尾, 5′非编码区(UTR)为131 bp。ORF可编码413个氨基酸, 预测分子量为45.852 kD, 理论等电点为8.85。序列含有1个AAT-like超家族结构域、15个磷酸化位点和2个糖基化位点。PmAST的mRNA在斑节对虾各组织中都有表达, 在肝胰腺中表达量最高, 其次为鳃组织, 在胃和脑组织中的表达量最低。96 h氨氮胁迫后荧光定量PCR分析结果表明, PmAST在肝胰腺和鳃组织中都具有不同程度的表达上调, 显著高于对照组(P < 0.05)。研究结果表明斑节对虾的PmAST基因在氨氮胁迫条件下会出现表达上调, 并且氨氮浓度越高其上调幅度也越大, 所以PmAST参与了斑节对虾的急性氨氮胁迫应答。
Abstract:To explore the function of aspartate aminotransferase gene in the process of the ammonia nitrogen metabolism of black tiger shrimps (Penaeus monodon), the full-length cDNA sequence of aspartate aminotransferase from P.monodon (PmAST) was obtained by high throughput transcriptome sequencing and rapid amplification of cDNA ends.On this basis, the expression of the PmAST in different tissues under different ambient ammonia stress were detected by fluorescence-quantitative real time PCR.The cDNA length of PmAST was 1 957 bp, including a 5′UTR of 131 bp and a 3′UTR of 584 bp.The length of the open reading frame (ORF) was 1 242 bp encoding a polypeptide of 413 amino acid.The molecular mass of the deduced amino acid (aa) sequence was 45.852 kD with an estimated pI of 8.85, and there was a tailing signal (poly A) with 30 bp length.Like other animals′ ASTs, the structure of PmAST protein included an AAT-I superfamily domain.There were 15 phosphorylation sites and 2 glycosylation sites in this protein.Analysis of the tissue expression pattern of the PmAST shows that PmAST mRNA was expressed in all tested tissues, including ovary, haemolymph, brain, lymph, stomach, muscle, thoracic ganglia, heart, hepatopancreas and gill.The PmAST expression reached the maximum value in hepatopancreas and was the lowest in brain.After ambient ammonia stress experiment, the expression of the PmAST in hepatopancreas and gill was significantly higher than that in the control (P < 0.05), and the expression profiles differed between hepatopancreas and gill.The result shows that the higher the ambient ammonia concentration is, the greater the increase of PmAST expression will be.Therefore, the PmAST takes part in acute ammonia stress.
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Keywords:
- Penaeus monodon /
- AST /
- ambient ammonia stress /
- gene clone /
- tissue expression
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天门冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)又叫谷草转氨酶, 广泛存在于动植物及微生物体内, 在细胞内氨氮(NH3-N)代谢过程中起到非常重要的作用, 是转氨反应的高效催化剂[1]。氨(NH3)的排泄是生物体维持正常生命活动所必需的, 正常情况下, 生物体内的氨主要源于氨基酸分解代谢, 而有机体可以通过排尿素的形式将氨基酸代谢产生的多余的氨氮排出体外[2]。在氨基酸代谢的过程中, AST可辅助将谷氨酸的氨基转移给草酰乙酸从而生成天冬氨酸, 天冬氨酸参与联合脱氨基作用产生氨, 而且它也是尿素形成时氨基的直接供给者[1-2], 因此, AST在氨氮的产生和排泄过程中发挥着重要作用。
以往研究表明, 在人体以及其他动物体内, AST是肝细胞受损最灵敏的指标, 主要存在于肝细胞线粒体内, 肝脏受到损伤时就会引起血清中AST的浓度偏高, 可以反映肝细胞炎症, 所以测定血清中AST的含量可用以帮助诊断肝脏疾病[3-5]。近年来, 随着AST在水生动物氨氮代谢过程中作用研究的逐渐深入, AST活性经常用作反映胁迫(药物、氨氮等)对机体毒害作用的指标[6-8]。MCKENNA等[9]研究表明AST在鼠脑的氨氮代谢过程中发挥着重要作用。MCCUTCHEON和von DOHLEN[10]研究发现, 在连接桔粉蚧壳虫(Planococcus citri Risso)与其共生菌之间的氨基酸代谢过程中, AST基因起到了关键作用。SCARAFFIA等[11]研究发现, 在用氯化铵(NH4Cl)饲喂埃及按蚊(Aedes aegypti)后, 其脂肪体中的AST活力明显增强。目前甲壳动物中关于AST的报道很少, 李少飞等[1]对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的AST进行克隆和功能分析, 结果表明该基因cDNA序列全长1 910 bp, 在氨氮解毒代谢过程中发挥了重要作用。在斑节对虾(Penaeus monodon)中, 尚未见AST基因的相关报道。
氨氮是水产养殖环境中普遍存在的一种有毒物质, 是一种重要的水质指标, 其含量高低也是引发病害的一个重要因素[12-13]。多数水生动物对氨氮的毒性都比较敏感, 已有研究表明, 氨氮对甲壳动物机体的免疫、蜕壳、生长发育、组织损伤、渗透调节、代谢等都有重要影响[14-18]。但目前对斑节对虾氨氮胁迫的应答和氨氮的代谢功能的研究尚不够深入, 对于其氨氮解毒代谢途径中起到调控作用的关键酶及其基因的研究仍较为缺乏[19]。该研究通过RACE技术克隆得到了斑节对虾AST基因(PmAST)的cDNA序列全长, 分析了其组织表达情况, 首次使用安全浓度(SC)与半致死浓度(LC50)2种氨氮浓度来对斑节对虾进行胁迫实验, 并对其在氨氮胁迫过程中在斑节对虾肝胰腺与鳃组织内各时间点的表达变化规律进行了分析, 以期为斑节对虾氨氮胁迫应答以及体内氨氮代谢分子调控机理的解析提供基础数据, 并为斑节对虾养殖健康发展提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用的斑节对虾养殖于中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地。选取体长14~16 cm、体质量为35~40 g的雌性亚成虾用于肝胰腺、脑神经、肌肉、胃、肠、鳃、淋巴、胸神经、血淋巴和卵巢组织的取样, 选取体长6~7 cm、体质量3~4 g的幼虾用于氨氮胁迫实验。取样前分别于27~30 ℃充气的水泥池中暂养3 d, 所取组织均用RNA Later(Ambion)保存。
1.2 总RNA的提取及cDNA第一链的合成
总RNA的提取按照Trizol Reagent(Invitrogen)的操作说明书进行操作, 提取斑节对虾上述各组织以及氨氮胁迫各时间点样品的总RNA。提取的RNA用NanoDrop 2 000/2 000c分光光度计测定纯度及浓度, 通过琼脂糖凝胶电泳确定其完整度。
用于做RACE的样品为肝胰腺组织与肌肉组织的混合样, 按照PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit的操作说明书进行反转录。各取500 ng RNA依照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real-time)(TaKaRa)的使用说明进行反转录, 用于荧光定量检测, 所得cDNA用β-actin引物检测后稀释10倍, -80 ℃保存备用。
1.3 斑节对虾AST基因的cDNA克隆及序列分析
根据笔者实验室转录组测序所得的AST序列片段用Primer 5.0软件设计特异性引物, 利用RACE技术获得PmAST基因的cDNA全长。所用引物见表 1。
表 1 斑节对虾AST基因克隆与表达分析所用引物序列Table 1. Oligonucleotide primers used in the experiment引物名称
primer引物序列(5′→3′)
primer sequence用途
functionTZ-F AATACGCTTCGCTCCGC 已知片段验证 TZ-R TTGCCTGCTTTGTTTACCAT TZS1 CCATCAGAGACTGGAGTCACATCA 3′RACE TZS2 TTCTGTGTACCTGACAAAGGATGG TZA1 CACCAACGCCAAGATTC 5′RACE TZA2 TGTCACGCTTGAATGCC β-actin-F AGTAGCCGCCCTGGTTGTAGA 内参基因 β-actin-R TTCTCCATGTCGTCCCAGT TZD-F AGCCCAGTTATTGCCGATG 荧光定量 PCR TZD-R GAAGGTGGAGCCAATACGGA 利用Emboss软件(http://emboss.bioinformatics.nl/)预测氨基酸序列; 用ProtParam软件(http://web.expasy.org/protparam/)对推导出的蛋白序列进行蛋白理化特性预测; 通过SMART 4.0(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?GENOMIC=1)进行蛋白结构域分析; 信号肽预测用SingalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)程序; 糖基化位点预测利用(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/); 磷酸化位点预测用NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/); 用NCBI中的BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索用于AST同源性和相似性分析与系统树构建的氨基酸序列; 多重序列比对采用Clustal X程序; 利用Clustal X程序和MEGA 6.0软件, 构建NJ系统进化树; 利用GOR方法(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)进行二级结构预测, 三维结构预测采用SWISS-MODEL软件。
1.4 斑节对虾PmAST基因的表达分析
1.4.1 斑节对虾PmAST基因组织表达分析
取3尾体长14~16 cm雌虾进行肝胰腺、脑神经、眼柄神经、肌肉、胃、肠、鳃、淋巴、胸神经和卵巢组织的取样(每个样品约10 mg), 同种组织样品混合均匀, 所取组织均用RNA Later(Ambion)保存, 用于斑节对虾PmAST基因组织表达分析。
根据斑节对虾AST基因的全长序列设计荧光定量PCR引物TZD-F和TZD-R, 选β-actin为内参基因(表 1)。以斑节对虾的不同组织(卵巢、脑组织、淋巴、肝胰腺、胃、肠、鳃、肌肉、血淋巴、胸神经)以及氨氮胁迫各时间的cDNA为模板进行荧光定量RT-PCR扩增。反应体系为10 μL, 包括5 μL SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa), 0.2 μL引物(10 μmol · L-1), 1.5 μL模板, 双蒸水补足10 μL, 并以蒸馏水代替模板设置阴性对照, 每个样品设3个重复, 反应程序为95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性20 s, 60 ℃退火5 s, 45个循环; 65 ℃延伸15 s; 溶解温度从55 ℃升至97 ℃; 37 ℃冷却5 min。实验数据采用相对CT法(2-ΔΔCT法)进行PmAST mRNA的表达量计算。
1.4.2 斑节对虾PmAST基因氨氮胁迫后的表达分析
氨氮胁迫实验于中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地进行, 选取标粗池中6~7 cm的幼虾为实验材料。正式实验开始之前先进行预实验, 以确定该实验所使用的氨氮胁迫浓度。该预实验共设计6个氨氮浓度梯度, 分别是0 mg ·L-1、40 mg · L-1、80 mg · L-1、100 mg · L-1、120 mg · L-1和140 mg · L-1。每个浓度梯度1个泡沫箱, 每个泡沫箱放20 L海水, 30尾虾。预实验所用的虾都是在混合家系的水泥池中捞取, 挑选大小均匀的180尾幼虾随机分布于6个泡沫箱中。96 h实验期间每隔2 h统计1次每个梯度的死亡数量, 捞取死虾。预实验期间不投喂任何饵料。96 h实验结束后, 通过直线内插法[20]算出LC50为90 mg · L-1, 并通过公式求出其SC[21]为9 mg · L-1。
正式实验共设计3组, 分别是高浓度胁迫组, 胁迫浓度为LC50(90 mg · L-1); 低浓度胁迫组, 胁迫浓度为SC(9 mg · L-1); 对照组, 使用养殖用的海水。每组都设3个平行, 每个平行1个泡沫箱。通过向实验用水中添加NH4Cl(分析纯)的方式来控制氨氮浓度, 每12 h换1次实验用水, 每次全部换掉, 与预实验相同, 每个泡沫箱加入20 L海水, 放30尾虾, 温度为(29.0±1.5)℃, pH为7.0±0.5, 盐度为30±0.5。每隔2 h统计1次每个泡沫箱的死亡数据, 捞取死虾; 分别于胁迫时间第6、第12、第24、第48、第72和第96小时共6个时间点进行取样, 每次取样在每个泡沫箱中各选取2尾活力较好的个体, 也就是每个实验组6尾, 取其肝胰腺与鳃组织分别混合均匀保存于RNA Later(Ambion)中。
按照前述方法分别提取氨氮胁迫后各个时间点斑节对虾肝胰腺和鳃的总RNA, 按照上述方法逆转录合成cDNA。取各个稀释后的cDNA样品为模板, β-actin为内参进行定量表达检测。反应体系、反应程序、数据处理方法同1.4.1。
1.5 统计学分析
运用SPSS 18.0软件进行相对独立的单因素方差分析(ANOVA), 并进行Duncan′s多重比较分析各组织间的差异显著性(P < 0.05)。结果表示为“平均值±标准差(X ±SD)”。
2. 结果
2.1 AST基因cDNA的克隆及序列分析
通过克隆得到的斑节对虾AST基因cDNA全长1 957 bp, 命名为PmAST(GenBank登录号KP984794)。其开放阅读框(ORF)长度1 242 bp, 3′非编码区(UTR)为584 bp, 含有30个碱基的poly(A)尾, 5′非编码区(UTR)为131 bp。ORF可编码413个氨基酸, 预测分子量为45.852 kD, 理论等电点为8.85。该序列包含15个磷酸化位点(其中丝氨酸位点10个, 苏氨酸位点2个, 酪氨酸位点3个), 2个N-糖基化位点, 并且与其他甲壳动物AST相似, 具有典型的AAT-like超家族结构域, 在氨基酸276位存在1个Lys催化残基, 在129~285位存在10个磷酸吡哆醛(PLP)结合位点, 在132~324位存在8个多肽结合位点(图 1)。
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图 1 斑节对虾AST基因的核酸和氨基酸序列两边每行标注的序号是指核苷酸和氨基酸的位置; 起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)用下划线标出; poly(A)尾巴用斜体字标出; 字体加粗标注为多肽结合位点; 灰色阴影标注为糖基化位点; 方框所示为谷AAT-like超家族结构域; 圆框中为磷酸吡哆醛结合位点; 三角框中为Lys催化残基。Figure 1. Nucleotid and amino acid sequences of PmASTThe serial numbers on both sides of each row refer to the location of nucleotides and amino acids; start codon (ATG) and termination codon (TAA) are underlined; "*" indicates stop codon; the poly (a) signals are in italics; eight poly peptide sites are highlighted in bold; shadow area indicates two glycosylation sites; the completed AAT-I superfamily domains are shown in the box; ten PLP binding sites are represented by round frames; the catalytic residue is marked by a triangle.2.2 同源性分析
利用GOR法对PmAST蛋白质二级结构预测后发现, 整条氨基酸序列的二级结构由α螺旋、延伸链以及无规则卷曲构成, 其中α螺旋占27.36%, 延伸链占25.67%, 无规则卷曲比例最大(46.97%)。SWISS-MODEL结果显示, PmAST的三维结构由α螺旋以及连接的无规则卷曲构成, 蛋白结构呈不规则的四边形状。并且PmAST的三维结构与小鼠线粒体AST的三维结构较相近, 同源性达到69.48%(图 2)。
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图 2 斑节对虾AST蛋白与小鼠AST蛋白三维结构空间示意图Figure 2. Three-dimensional ribbon structures of PmAST protein and M.musculus AST斑节对虾AST基因编码的氨基酸序列经BLAST比对分析发现与其他生物的AST基因具有较高的同源性。从NCBI上检索其他物种的AST氨基酸序列并利用Clustal X软件对其氨基酸序列进行多重序列比对分析。结果表明, 不同物种间的AST序列较为保守, 其中PmAST与中国明对虾相似度最高(96%), 与其他节肢动物的同源性为:桔粉介壳虫73%, 菜叶蜂(Athalia rosae)71%, 内华达古白蚁(Zootermopsis nevadensis)70%。其与脊椎动物AST的同源性也很高, 与斑马鱼(Danio rerio)、小家鼠(Mus musculus)和猕猴(Macaca mulatta)的同源性都为69%, 与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)和非洲鸵鸟(Struthio camelus australis)的同源性都为67%, 与非洲爪蟾(Xenopus laevis)的同源性为65%, 与智人(Homo sapiens)的同源性较低(47%)(图 3)。
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图 3 PmAST的氨基酸序列与其他物种AST的氨基酸多重序列比对Figure 3. Multiple alignment of predicted amino acid sequence of PmAST with other eukaryote AST amino acid sequences利用MEGA 6.0软件, 采用NJ法构建了PmAST及其他物种的AST基因的系统进化树(图 4)。从系统树可以看出, 节肢动物的AST聚类亲缘关系较近, 无脊椎动物与脊椎动物的AST明显地被区分开来。其中斑节对虾的PmAST基因先与中国明对虾的AST聚为一支后又与其他节肢动物的AST聚在一起。
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图 4 利用MEGA 6.0软件构建的基于PmAST基因所编码氨基酸序列的NJ系统进化树Figure 4. NJ phylogenetic tree based on PmAST amino acid sequences by MEGA 6.02.3 PmAST基因的组织表达分析
选择β-actin作为参照, 利用实时荧光定量PCR技术对AST基因在斑节对虾各组织中以及在氨氮胁迫过程中肝胰脏与鳃组织中的表达进行检测。PmAST在各组织的表达情况见图 5。PmAST在斑节对虾的肝胰腺、鳃组织、淋巴、胃、胸神经、卵巢、肌肉、脑组织、心脏以及血淋巴中均有表达, 且各组织中表达量存在显著差异(P < 0.05), 其中在肝胰腺中表达量最高, 其次是鳃组织和肌肉, 而在胃与脑组织中的表达量最低。
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图 5 斑节对虾AST基因在各组织表达情况HE.肝胰脏; G.鳃; M.肌肉; H.心脏; TG.胸神经; O:卵巢; HA.血淋巴L.淋巴; S.胃; B.脑; 图中数值为平均值±标准差(X ±SD), 小写字母不同表示差异性显著(P < 0.05)。Figure 5. Expression of P.monodon AST in different tissuesHE.hepatopancreas; G.gill; M.muscle; H.heart; TG.thoracic ganglia; O.ovary; HA.haemolymph; L.lymph; S.stomach; B.brain; values (X ±SD) with different letters are significantly different from one another (P < 0.05).2.4 PmAST基因不同浓度氨氮胁迫下表达分析
通过荧光定量PCR检测, 在不同浓度氨氮胁迫过程中斑节对虾AST基因在肝胰腺中的表达的变化趋势见图 6-A。结果表明, 低浓度组与高浓度组在氨氮胁迫过程中的表达量都有不同程度的上调并显著高于对照组(P < 0.05)。低浓度组在实验开始时表达被抑制, 在第6小时显著低于对照组(P < 0.05), 第6小时后开始上调并在第12小时到达峰值, 相对表达量是对照组的2.01倍, 显著高于对照组(P < 0.05), 之后逐步下降并趋于正常值。而高浓度组反应比较迅速, 在实验开始第6小时就表达上调达到第1个峰值, 相对表达量是对照组的1.46倍, 显著高于对照组(P < 0.05), 之后出现表达下调并显著低于对照组(P < 0.05), 第72小时再一次表达上调并到达第2个峰值, 相对表达量是对照组的2.15倍。
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图 6 斑节对虾肝胰腺和腮中PmAST基因在氨氮胁迫过程中表达变化情况图中数值为“平均值±标准差(X ±SD)”, 同一时间内小写字母不同表示实验组与对照组差异性显著(P < 0.05)。Figure 6. Expression profiles of PmAST gene in P.monodon hepatopancreas and gill during ambient ammonia stressValues (X ±SD) with different lowercase letters at the same time are significantly different with the control (P < 0.05).在不同浓度氨氮胁迫过程中斑节对虾AST基因在鳃组织中表达的变化趋势见图 6-B。高浓度组与低浓度组的变化趋势有所差异。在低浓度组中, AST基因的表达量在实验开始第6小时后明显被抑制并显著低于对照组(P < 0.05), 之后开始表达上调并在第24小时达到峰值且显著高于对照组(P < 0.05), 相对表达量是对照组的2.04倍, 随后开始下降并趋于平稳。而在高浓度组中, AST基因的表达水平在实验开始第6小时明显上调并显著高于对照组(P < 0.05), 达到第一个峰值, 相对表达量是对照组的2.95倍, 第12~第48小时期间有所恢复, 第48小时后再次表达上调并在第72小时达到第2个峰值, 显著高于对照组(P < 0.05), 最后在第96小时表达明显被抑制, 显著低于对照组(P < 0.05)。
3. 讨论
AST在甲壳动物氨基酸分解代谢以及体内氨氮的产生与排泄方面起着重要作用。该研究首次成功克隆了斑节对虾AST基因, 该基因全长1 957 bp, ORF长度1 242 bp, 可编码413个氨基酸。经多重序列比对发现, 该氨基酸序列十分保守, 属于典型的天冬氨酸超家族。该家族还包括谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、苯丙氨酸转氨酶(L-phenylalanine transaminase, PAT)和酪氨酸转氨酶(L-tyrosine transaminase, TAT)等, 主要特点是大部分成员都包含AAT-like结构域, 该结构域功能中心高度保守, 其中包括很多PLP结合位点和1个Lys催化残基[22-23]。而PmAST在氨基酸276位存在1个Lys催化残基, 在129~285位存在10个PLP结合位点。PmAST与其他物种的AST氨基酸序列比对发现, 该序列与其他物种的AST序列均具有较高的同源性, 说明AST在中间是保守的, 其中PmAST与中国明对虾的AST同源性最高(96%), 其次为桔粉介壳虫(73%)。上述结果表明该序列是斑节对虾AST基因。
PmAST基因在斑节对虾各组织中广泛表达, 但各组织间的表达量差异较大。PmAST基因在斑节对虾肝胰腺中表达量最高, 其次为鳃组织和肌肉, 而在胃与脑组织中表达量最低, 这一趋势与中国明对虾AST基因组织表达分析的结果[1]相类似, 可以推测PmAST的这种组织特异性与AST参与氨基酸分解以及氨氮代谢有关。肝胰腺是甲壳动物的主要解毒代谢器官, 而AST又是肝细胞受损最灵敏的指标, 已有研究表明AST活性高低反映出对虾体内氨基酸代谢情况, 同时也可以反映出肝胰腺功能[24-25]。除此之外, AST在甲壳动物体内氨氮产生以及排泄过程中发挥着重要作用, 而肝胰腺与鳃是甲壳动物的主要氨氮解毒代谢场所与氨氮排泄器官[15], 所以PmAST在肝胰腺与鳃组织中的表达量都很高。
通常情况下, 氨态氮是甲壳动物体内氮的主要代谢产物, 体内大部分的氮是以氨态氮的形式经由鳃排出体外[26], 当外界环境改变, 对虾受到氨氮胁迫时, 其排泄方式就会有所改变, 尿素和亚硝酸盐的排泄明显增加[27]。而AST可催化谷氨酸与草酰乙酸反应生成天冬氨酸, 天冬氨酸是尿素形成时氨基的直接来源[2]。已有研究表明, 斑节对虾在氨氮胁迫条件下, 尿素和谷氨酰胺在各组织中的含量明显升高, 特别是肝胰脏中, 说明斑节对虾在氨氮胁迫下可以通过增加尿素排泄等方式来缓解氨氮毒性[28]。为了研究AST在斑节对虾氨氮解毒代谢中的作用, 该研究分别使用高浓度组与低浓度组对斑节对虾进行氨氮胁迫实验, 分析了在不同浓度氨氮胁迫过程中斑节对虾AST基因在肝胰腺与鳃组织中表达变化趋势。
结果表明2个浓度组的PmAST在鳃组织以及肝胰腺中均表现出不同程度的表达上调, 并呈现出不同的趋势。肝胰腺是甲壳动物的主要氨氮解毒代谢器官, 其中含有大量的酶与蛋白质, 而且水生动物摄入饲料蛋白后被吸收的氨基酸有80%进入肝脏代谢[29]。该实验结果表明肝胰腺中PmAST基因对于高浓度氨氮的刺激反应十分迅速, 高浓度组在实验开始第6小时后表达量就迅速上调, 显著高于对照组(P < 0.05), 之后又呈现下降趋势并在第48小时达到最低点, 显著低于对照组(P < 0.05), 第48小时后又再次迅速上升并于第72小时达到峰值, 显著高于对照组(P < 0.05)。而低浓度组的趋势有所不同, 在实验开始后PmAST表达有轻微下调, 之后在第12小时表达上调并达到峰值, 显著高于对照组(P < 0.05), 之后便逐渐下降并恢复正常值。这表明高浓度氨氮胁迫比低浓度氨氮胁迫给斑节对虾带来的影响更大, 机体的调控应答过程也更为复杂。低浓度也就是安全浓度所带来的影响可以通过机体自身调节消除, PmAST表达上调一次随后又恢复了正常值; 而高浓度组也就是半致死浓度对于斑节对虾的生理影响较为严重, 需要机体进行2次调节, 而PmAST在实验过程中的2次显著上调也说明PmAST基因在氨氮解毒代谢过程中发挥了重要作用。
鳃是大多数水生甲壳动物氨氮排泄器官[30]。在氨氮胁迫过程中, PmAST在鳃组织中的表达规律与在肝胰腺中相似, 高浓度组在第6小时迅速达到峰值并显著高于对照组与低浓度组(P < 0.05), 之后在第72小时再次表达上调达到第2个峰值, 而在第96小时又急速下降并显著低于对照组(P < 0.05);低浓度组则在实验开始后逐步表达上调, 在第48小时达到峰值并显著高于对照组(P < 0.05), 之后就开始下降最终恢复正常值。这表明PmAST在鳃组织中的表达模式与在肝胰腺中的类似, 在氨氮代谢过程中发挥重要作用, 鳃是甲壳动物的主要氨氮排泄组织, 当甲壳动物体内氨氮浓度过高时, 机体会通过降低鳃组织对氨的通透性, 增加对NH4+的排出来进行调节[16]。而高浓度组在第96小时突然大幅度表达下调, 推测是由于随着实验的进行, 长时间的高浓度氨氮胁迫损伤了斑节对虾鳃组织, 已有研究表明, 甲壳动物的鳃组织在氨氮胁迫下会受到氧化损伤, 鳃上皮细胞结构受到破坏, 并且随着氨氮浓度的升高这种损伤也相应加重[31]。这点也与中国明对虾的氨氮胁迫结果相类似, 中国明对虾的FcAST基因在4 mg · L-1与16 mg · L-12组氨氮浓度胁迫下的肝胰腺与鳃组织中均表现出不同程度的表达上调与抑制, 并且16 mg ·L-1浓度组上调幅度大于4 mg · L-1浓度组[14]。
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图 1 斑节对虾AST基因的核酸和氨基酸序列
两边每行标注的序号是指核苷酸和氨基酸的位置; 起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)用下划线标出; poly(A)尾巴用斜体字标出; 字体加粗标注为多肽结合位点; 灰色阴影标注为糖基化位点; 方框所示为谷AAT-like超家族结构域; 圆框中为磷酸吡哆醛结合位点; 三角框中为Lys催化残基。
Figure 1. Nucleotid and amino acid sequences of PmAST
The serial numbers on both sides of each row refer to the location of nucleotides and amino acids; start codon (ATG) and termination codon (TAA) are underlined; "*" indicates stop codon; the poly (a) signals are in italics; eight poly peptide sites are highlighted in bold; shadow area indicates two glycosylation sites; the completed AAT-I superfamily domains are shown in the box; ten PLP binding sites are represented by round frames; the catalytic residue is marked by a triangle.
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图 2 斑节对虾AST蛋白与小鼠AST蛋白三维结构空间示意图
Figure 2. Three-dimensional ribbon structures of PmAST protein and M.musculus AST
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图 3 PmAST的氨基酸序列与其他物种AST的氨基酸多重序列比对
Figure 3. Multiple alignment of predicted amino acid sequence of PmAST with other eukaryote AST amino acid sequences
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图 4 利用MEGA 6.0软件构建的基于PmAST基因所编码氨基酸序列的NJ系统进化树
Figure 4. NJ phylogenetic tree based on PmAST amino acid sequences by MEGA 6.0
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图 5 斑节对虾AST基因在各组织表达情况
HE.肝胰脏; G.鳃; M.肌肉; H.心脏; TG.胸神经; O:卵巢; HA.血淋巴L.淋巴; S.胃; B.脑; 图中数值为平均值±标准差(X ±SD), 小写字母不同表示差异性显著(P < 0.05)。
Figure 5. Expression of P.monodon AST in different tissues
HE.hepatopancreas; G.gill; M.muscle; H.heart; TG.thoracic ganglia; O.ovary; HA.haemolymph; L.lymph; S.stomach; B.brain; values (X ±SD) with different letters are significantly different from one another (P < 0.05).
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图 6 斑节对虾肝胰腺和腮中PmAST基因在氨氮胁迫过程中表达变化情况
图中数值为“平均值±标准差(X ±SD)”, 同一时间内小写字母不同表示实验组与对照组差异性显著(P < 0.05)。
Figure 6. Expression profiles of PmAST gene in P.monodon hepatopancreas and gill during ambient ammonia stress
Values (X ±SD) with different lowercase letters at the same time are significantly different with the control (P < 0.05).
表 1 斑节对虾AST基因克隆与表达分析所用引物序列
Table 1 Oligonucleotide primers used in the experiment
引物名称
primer引物序列(5′→3′)
primer sequence用途
functionTZ-F AATACGCTTCGCTCCGC 已知片段验证 TZ-R TTGCCTGCTTTGTTTACCAT TZS1 CCATCAGAGACTGGAGTCACATCA 3′RACE TZS2 TTCTGTGTACCTGACAAAGGATGG TZA1 CACCAACGCCAAGATTC 5′RACE TZA2 TGTCACGCTTGAATGCC β-actin-F AGTAGCCGCCCTGGTTGTAGA 内参基因 β-actin-R TTCTCCATGTCGTCCCAGT TZD-F AGCCCAGTTATTGCCGATG 荧光定量 PCR TZD-R GAAGGTGGAGCCAATACGGA 
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