Production of bile acid salts binding hydrolysate from Trachinotus ovatus and its molecular weight distribution
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摘要:
以卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)鱼肉为原材料，以酶解产物与胆酸盐的体外结合率为指标，从5种常用食品用蛋白酶中筛选最优蛋白酶。进而采用正交法优化酶解条件，以提高酶解产物的胆酸盐结合率，并采用GPC法分析产物中蛋白肽的分子量分布情况。结果表明，胰蛋白酶酶解产物(100 mg·mL-1)与胆酸钠、甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠等3种胆酸盐的体外结合能力均好于其他4种蛋白酶，结合率分别达到42.1%、33.5%和30.1%，分别相当于降血脂药物考来烯胺散(20 mg·mL-1)的78.3%、74.4%和76.8%；经过正交试验优化的制备卵形鲳鲹蛋白肽的工艺条件为酶解时间2 h，加酶量2 000 U·g-1，料液比1:4（g·mL-1、pH 8、37 ℃）。该条件下酶解产物（20 mg·mL-1）对甘氨胆酸钠体外结合率达到同浓度阳性对照物（考来烯胺散）的48.3%，酶解产物中相对分子量3 kD以下的肽类组分占总蛋白水解物的77.30%。
Abstract:Taking ovate pompano (Trachinotus ovatus) meat as raw material and taking enzymatic hydrolysate and bile salts in vitro binding rate as index, we screened the optimal protease from five kinds of food protease. Then we used orthogonal design to optimize hydrolysis conditions in order to improve the binding rate of bile acid salts and used GPC method to analyze the molecular weight distribution of peptides. The results show that the tryptic hydrolysates had higher binding rate than that of the other protease hydrolysates, and the in vitro binding rate of sodium cholate, sodium glycocholate and sodium taurocholate by enzymatic protein (100 mg·mL-1) was 42.1%, 33.5% and 30.1%, respectively, which was 78.3%, 74.4% and 76.8% equivalent to the positive control cholestyramine (20 mg·mL-1). The maximum percentage of sodium glycocholate hydrate binding rate was obtained under the conditions:hydrolytic time of 2 h, enzyme additives of 2 000 U·g-1, meal-to-water ratio of 1:4 (g·mL-1, at pH 8, 37 ℃). Under the optimal condition, the in vitro binding rate of sodium glycocholate hydrate by enzymatic hydrolysate (20 mg·mL-1) was corresponding to 48.3% of positive control cholestyramine at the same concentration. The relative molecular weight of peptides below 3 kD in enzymolysis products accounted for 77.30%.
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多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一大类稠环芳烃有机化合物，对人体有“三致”作用，早在20世纪70年代就被美国环境保护署列为优先控制污染物[1-2]。化石燃料(煤炭和石油)的泄露和不完全燃烧是环境中PAHs的主要来源[3-6]。由于可以通过地表径流、空气蒸发和雨水沉降等作用在环境中迁移，PAHs已经成为一类普遍的环境污染物[7-8]。PAHs的来源与人类活动密切相关[9-10]。研究表明，人口和工业分布密集的区域环境中PAHs的含量明显高于欠发达地区和不发达地区[3, 11-12]。广东是人口最密集和经济最发达的地区之一，过去30年，广东沿岸港口航运、石油炼化和电力生产等人类活动剧增，促进经济发展的同时给近岸海洋环境PAHs污染带来巨大威胁。PAHs已经成为广东近岸环境中普遍存在的污染物之一[13-15]。一直以来，广东沿岸也是重要的海水养殖基地，水产品养殖产量超过中国海水养殖总产量的六分之一[16]。海水环境PAHs污染给养殖水产品的质量和安全造成潜在风险。
塭池养殖是广东沿岸最主要的养殖方式之一。牡蛎塭养是近年来深入开展海洋资源利用进行滩涂养殖的重要举措。相对于开放式海湾养殖，塭池养殖环境相对封闭，条件可控，塭养的牡蛎成长更快、肥满度更高，更受市场欢迎。然而由于养殖区周边的人类活动越来越密集，塭池养殖环境PAHs污染压力也越来越大。因此，文章以汕尾长沙湾牡蛎塭池为对象，研究牡蛎塭池中PAHs的分布特征，解析塭池沉积物中PAHs的来源，评估PAHs残留对养殖牡蛎质量安全造成的潜在风险，分析周边环境对塭池及塭池养殖牡蛎质量安全的影响。
1. 材料与方法
1.1 样品采集
汕尾市红草镇辰洲村牡蛎塭养区位于长沙湾东北角，与长沙湾通过河汊联通(图 1)。牡蛎塭池沿着河道自西向东分布，塭池通常水深0.5~1.5 m，采用托盘吊养的方式养殖近江牡蛎(Ostrea rivularis)。该研究于2015年8月25日在牡蛎塭养区内随机选择6个塭池(S1，S2，S3，S4，S5，S6)，塭养区外设置3个站位(S7，S8，S9)，采集各站位的沉积物、养殖牡蛎(近江牡蛎，塭养3个月)和水样品。表层沉积物应用抓斗式采泥器采集，放于聚乙烯袋标签密封后置于冰箱冷藏，运抵实验室后进行冷冻干燥处理，冻干后研磨并用80目筛过筛处理，去除贝壳等粗颗粒。养殖牡蛎现场去壳，置于聚乙烯袋中冷冻贮藏。水样用0.70 μm玻璃纤维滤膜(Whatman Grade GF/F，预先450 ℃烘烤4 h)过滤，用C18固相萃取柱富集过滤水中PAHs；滤膜冻干称质量测定悬浮物含量，随后用于测定悬浮物中PAHs质量分数。
1.2 仪器与试剂
气相色谱-串联质谱仪(Agilent 7890A-7000B)配电子轰击式离子(EI)源；色谱柱为Agilent J & W Scientific DB-5ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；均质机(德国IKAT15)；超声清洗机(江苏舒美KQ250E)；旋转蒸发仪(瑞典BUCHI R-215)；涡旋混合器(英国Stuart SA8)；离心机(上海Anke DL-6000B)；氮吹仪(美国OA-SYS N-EVAP-111)，电子天平(±0.01 g，常州万通WT5200)；马弗炉(yamato，FO510C)。
16种多环芳烃标准溶液为萘(NA)、苊烯(ACL)、苊(AC)、芴(FL)、菲(PHE)、蒽(AN)、荧蒽(FA)、芘(Pyr)、苯并[a]蒽(BaA)、(CHR)、苯并[b]荧蒽(BbFA)、苯并[k]荧蒽(BkFA)、苯并[a]芘(BaP)、茚并(1, 2, 3-cd)芘(IP)、二苯并[a, h]蒽(DBahA)、苯并[g, h, i]苝(BghiP)，质量浓度均为2 000 mg·L-1(美国Accustandard公司)。4种内标物溶液为苊-D10(AC-D10)4 000 mg·L-1、菲-D10(PHE-D10)4 000 mg ·L-1、苝-D12(CHR-D12)250 mg·L-1、苝-D12(PER-D12)4 000 mg·L-1(美国Accustandard公司)。正己烷、二氯甲烷(色谱纯，Sigma-Aldrich)。
中性氧化铝(分析纯，广州化学试剂厂，450 ℃灼烧4 h)，弗罗里硅土(分析纯，广州化学试剂厂，450 ℃灼烧4 h)。混合固相萃取柱为3 mL固相萃取空柱管，加入0.5 g弗罗里硅土用聚丙烯胺板压实，再加入0.5 g中性氧化铝。
1.3 样品分析
1.3.1 样品前处理
沉积物和悬浮物样品。PAHs的测定参照卢腾腾[17]的方法进行前处理。应用二氯甲烷/正己烷混合溶液涡旋混合后超声提取10 min，5 000 r·min-1离心5 min，上清液浓缩至3 mL，加入活化铜粉漩涡混合1 min，用碱性氧化铝/弗罗硅土混合固相萃取净化，二氯甲烷/正己烷混合溶液洗脱，定容1mL待测。
水样品用5 mL超纯水淋洗C18固相萃取柱，抽干，二氯甲烷/正己烷混合溶液洗脱，定容1mL待测。牡蛎样品中前处理方法参照卢腾腾[17]和SC/T 3042—2008[18]进行处理。
1.3.2 仪器条件
进样口温度为280 ℃；进样量1 μL，不分流进样；氦气(99.999%)为载气，流速为1.3 mL·min-1；接口温度280 ℃。色谱柱初始温度75 ℃，保持1 min，以10 ℃·min-1升至250 ℃, 以5 ℃·min-1升至250 ℃保持3 min。离子源和四级杆温度分别为230 ℃和150 ℃；电子轰击能70 eV。该方法采用选择离子监测模式(selected ions monitoring，SIM)模式进行，离子监测参数参照SC/T 3042—2008[18]。
1.3.3 质量控制与保证
为确保分析数据的准确性，实验使用内标法和多点校正曲线定量样品中PAHs 16种单体，每批次样品均进行试剂空白，方法空白，样品平行测定，样品加标实验等操作。空白样品加标回收率范围为65.3% ~130%，平行相对标准偏差3.56% ~15.8%。
2. 结果
2.1 塭养区内外悬浮物和环境样品中PAHs含量
牡蛎塭池水体中悬浮物平均含量高于塭养区外，但差异不显著(P>0.05)。塭池内与塭养区外水中PAHs平均含量非常接近。塭养区内水体悬浮物中的PAHs平均含量高于塭养区外，但差异均不显著(P>0.05)(表 1)。
表 1 样品中悬浮物和多环芳烃含量Table 1. Content of suspended solids and PAHs in environmental samples站位
sampling siteρ(悬浮物)/mg·L-1
content of suspended solids多环芳烃含量content of PAHs 水中/ng·L-1
in water悬浮物中/μg·kg-1
in suspended solids沉积物中/μg·kg-1
in sediment牡蛎中/μg·kg-1
in oyster塭养区oyster pond S1 32.0 21.20 98.2 615 12.7 S2 29.0 6.62 214.0 305 17.3 S3 44.7 7.16 164.0 234 17.3 S4 202.0 6.38 355.0 236 15.6 S5 117.0 9.38 263.0 294 17.4 S6 88.0 8.55 92.9 247 12.7 均值 85.6 9.87 198.0 322 15.5 塭养区外outside oyster pond S7 45.0 8.59 130.0 382 - S8 107.0 6.63 207.0 657 - S9 14.0 14.60 95.8 364 - 均值 55.3 9.92 144.0 468 - 牡蛎塭养区沉积物中PAHs质量分数为234~615 μg·kg-1，平均为322 μg·kg-1。塭养区外沉积物中PAHs质量分数为364~657 μg·kg-1，平均为468 μg·kg-1。表层沉积物中PAHs质量分数塭养区低于塭养区外，但是差异不显著(P < 0.05)。与广东沿海其他海湾相比，塭养区内外表层沉积物中PAHs含量低于珠三角近岸的珠江口和大鹏湾海域，高于粤西地区的湛江湾、雷州湾、流沙湾和博贺湾，与粤东地区的柘林湾相近(表 2)。塭养区沉积物中PAHs的含量在广东沿海处于中等污染水平。
表 2 广东沿海沉积物中多环芳烃含量Table 2. PAHs concentrations in surface sediments along coastal waters in Guangdong研究地点(年)
sampling site (year)测定PAHs数量
number of PAHs质量分数/μg·kg-1
concentration均值/μg·kg-1
average参考文献
Reference牡蛎塭养区(2015)oyster ponds 16 234~615 322 该研究 牡蛎塭养水源区(2015)outside oyster ponds 16 364~657 468 该研究 红海湾(2007)Honghai Bay 16 65.14~562.20 225.20 [19] 南澳岛(2010)Nan′ao Island 16 117.0~342.8 210.4 [17] 柘林湾(2004)Zhelin Bay 16 146~929 477 [20] 珠江口(2015)Pearl River 16 126.08~3 828.58 563.52 [21] 大鹏湾(2011)Dapeng Bay 16 216.6~1 314.9 572.7 [17] 湛江湾(2012)Zhanjiang Bay 16 41.96~933.90 315.98 [22] 雷州湾(2012)Louzhou Bay 16 21.72~319.61 103.91 [22] 博贺湾(2010)Bohe Bay 16 226.9~313.0 279.4 [17] 流沙湾(2010)Liusha Bay 16 186.5~300.9 239.8 [17] 2.2 沉积物中PAHs的组成特征及其来源解析
9个采样点中除5环的IP和DBahA及6环的BghiP检出率分别为88.9%、22.2%和55.6%外，其他化合物检出率均为100%。其中3环化合物是沉积物中PAHs的主要成分，随后依次是4环、2环、5环和6环化合物，其质量分数分别为64.8% ~79.9%、14.2%~21.2%、0.4%~14.9%、1.21% ~3.59%和0~1.09%(图 2)。塭养区内外沉积物中PAHs组成基本相似。
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图 2 牡蛎塭池区各站位表层沉积物中多环芳烃的组成Figure 2. Composition of PAHs in surficial sediments from sampling sites in oyster ponds由于异构体间热稳定性存在差异，不同来源的PAHs会显现特异的指纹特征[23]。因此，PAHs异构体的比例常被用来表征PAHs的来源。目前，178 m/z、202 m/z、228 m/z等质量数的PAHs异构体比例被广泛用于解析环境中PAHs的来源。蒽/(菲+蒽)的比值大于0.1时指示PAHs源于燃烧排放，小于0.1则示意PAHs来源于石油释放；荧蒽/(荧蒽+芘)比值小于0.4示意PAHs源于石油排放污染，0.4~0.5则指示PAHs源于石油和精炼产品的燃烧释放，大于0.5意味着来自草木、煤炭的燃烧；苯并蒽/(苯并蒽+)比值小于0.2源于石油排放污染，0.2~0.35为混合来源，大于0.35源自燃烧源[24]。为从多角度解析沉积物中PAHs来源，文章兼用以上3种异构体比值法分析塭池区内、外沉积物中PAHs的来源。结果显示，3种异构体比值法均显示塭池区内、外表层沉积物中PAHs的污染主要源自化石燃料的燃烧释放(图 3)。
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图 3 塭池表层沉积物中蒽/(蒽+菲)，苯并蒽/(苯并蒽+)和荧蒽/(荧蒽+芘)异构体比值Figure 3. Plot of AN/(AN+PHE), BaA/(BaA+CHR) and FA/(FA+PY) isomeric ratios3. 讨论
3.1 塭池区内外沉积物PAHs含量差异分析
研究结果显示牡蛎塭池表层沉积物PAHs含量低于塭池外。塭池养殖水来自区外海水，理论上塭养区内外表层沉积物中PAHs含量应相同。但是，塭池养殖的模式决定了塭池内外PAHs含量存在差异。塭池水的更换根据养殖生产的需要不定期执行。因此，相对于开放海湾，塭池养殖水与外界海水的交换受人为因素影响较大。
塭池水深一般控制在0.5~1.5 m，有利于增强光合作用，促进水中浮游植物和藻类的生长[25-26]。水中浮游植物和藻类的增多，不但为牡蛎提供了饵料，同时也使塭池水中悬浮物含量增高，所以塭池中悬浮物含量高于塭养区外。PAHs疏水性较强，易于吸附在悬浮颗粒物中[27]，因此悬浮物的增多提高了养殖水对PAHs的吸附量，导致了塭池悬浮物中PAHs含量高于塭养区外。为使水相和沉积相中PAHs分配达到平衡，塭池沉积相向水相释放较多的PAHs，致使塭池沉积物中PAHs含量降低。另外，牡蛎是滤食性贝类，吸附于悬浮物的PAHs被牡蛎富集(表 1)，进一步降低了塭池沉积环境中PAHs的负荷量。所以塭池沉积物中∑PAHs低于塭养区外。
3.2 塭池区表层沉积物PAHs来源分析
人类活动产生的PAHs主要源于煤炭燃烧、石油炼化和草木燃烧等[3-6]。珠江三角洲、粤东和粤西等广东沿海地区PAHs主要来源与之相近[21-22, 28]。这与广东地区经济的发展密切相关。改革开放以来，珠三角地区由于工业的迅猛发展，对电力需求持续增长，电力消耗由2000年的995.29×108度增长至2014年的3 803.37×108度[23]。广东地区原煤消费量由1990年的2 084.99×104 t增至2014年的112 030.06×104 t[29]。近年来珠三角地区的产业升级，汕尾毗邻珠三角开始承接珠三角地区的转移产业，电力消耗由2000年的9.95×108度增至2014年的43.8×108度[29]。为满足电力消耗不断增长的需求，汕尾地区在红海湾分别于2004年和2009年相继建立了2座火力发电厂，距离牡蛎塭池区30 km。来源解析显示，塭池沉积物PAHs主要源于煤炭燃烧，与塭池周边环境释放源基本吻合，说明牡蛎塭池环境中PAHs污染主要受周边电力工业的影响。
3.3 塭池表层沉积物中PAHs生态风险评价
PAHs的疏水性使之趋向吸附于沉积物中。然而，由于沉积相-水相之间存在分配平衡和物质交换，沉积相吸附的PAHs会重新释放到水相中被养殖生物富集，使塭池沉积物成为水体PAHs的二次污染源，给塭养牡蛎质量安全造成潜在风险。因此，评价塭池沉积物中PAHs的生态风险对养殖牡蛎的质量安全具有十分重要的意义。为评价PAHs残留对生物的毒副作用，LONG等[30]提出效应区间低、中值法以评价海洋和河口沉积物中PAHs残留对生物的潜在毒性效应。目前该方法已经被广泛应用[31-32]。根据沉积物PAHs浓度区间对生物产生的不良效应发生率，LONG等[30]给出了PAHs 12种单体的效应区间低值(effect range low，ERL，毒副效应发生率小于10%)和效应区间中值(effect range median，ERM，毒副效应发生率大于50%)(表 3)。沉积物中PAHs含量小于ERL时对生物无明显毒副作用，大于ERL小于ERM时对生物有一定毒副作用，大于ERM时对生物有明显毒副作用。
表 3 塭养区沉积物中多环芳烃生态风险评价Table 3. Ecological risk assessment of PAHs in sediment from marine pond culture zone化合物
compound效应区间低值
ERL效应区间中值
ERM质量分数/μg·kg-1
content萘NA 160 2 100 9.21~43.7 苊烯ACL 44 640 1.54~6.09 苊AC 16 500 2.85~13.4 芴FL 19 540 43.1~129 菲PHE 240 1 500 88.5~231 蒽AN 85.3 1 100 34.8~98.8 荧蒽FA 600 5 100 19.0~49.1 芘PY 665 2 600 12.6~34.2 苯并[a]蒽BaA 261 1 600 3.29~13.7 CHR 384 2 800 3.37~13.5 苯并[b]荧蒽BbFA - - 1.04~5.64 苯并[k]荧蒽BkFA - - 0.896~4.10 苯并[a]芘BaP 430 1 600 0.827~4.63 茚酚[1, 2, 3-cd]芘IP - - ND~0.807 二苯并[a, h]蒽DBahA 63.4 260 ND~0.249 苯并[g, h, i]苝BghiP - - ND~0.838 ∑PAHs 4 022 44 792 234~615 注：ND.未检出
Note:ND.not detected与效应区间浓度值比较(表 3)，塭池沉积物总多环芳烃含量低于ERL，对生物无明显毒副作用，但是芴和蒽等含量介于ERL和ERM之间，对生物存在一定的毒副作用。塭池沉积物PAHs主要来源于周边燃煤排放，这种排放有持续性、长期性的特征。塭池环境中PAHs污染不仅对养殖生物的生长造成影响，还对人体健康产生威胁[33-34]。
美国环保署(USEPA)以各成分相对BaP的潜在致癌效力计算鱼体可食用部分中PAHs残留的毒性当量浓度(potency equivalent concentration，PEC)，评估PAHs残留的最大可接受风险水平[33, 35]。文章所采集牡蛎体中PAHs质量分数范围为12.7~17.4 μg·kg-1(均值15.5 μg·kg-1)。应用该方法进行计算，塭养牡蛎PEC质量分数为0.086~0.164 μg·kg-1，低于USEPA提出的鱼体可食用组织中PAHs的风险安全阈值(0.67 μg·kg-1)。因此，该阶段食用塭养牡蛎对人体潜在的健康风险低。通常近江牡蛎塭池养殖周期约2年。文章所采集的近江牡蛎养殖时长仅3个月，处于养殖初始阶段。由于牡蛎对PAHs富集能力强[36-37]，牡蛎塭池中PAHs生态风险和质量安全风险需要引起高度重视。
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图 1 3种胆酸盐溶液紫外可见光谱及标准曲线
Figure 1. UV absorption spectrum and standard curve of three bile salts
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图 2 5种蛋白酶酶解液与阳性对照体外结合3种胆酸盐能力比较
5种酶解物质量浓度为100 mg·mL-1，阳性对照考来烯胺散质量浓度为20 mg·mL-1；图中各柱形图上小写英文字母不同者表示差异显著，P<0.05。
Figure 2. In vitro binding ability of three bile salts between five hydrolysates and positive control group
The concentrations of five hydrolysates were 100 mg·mL-1and positive control group was 20 mg·mL-1. Different letters on histogram in the same group indicate significant difference (P<0.05).
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图 3 酶解时间对与甘氨胆酸钠结合率的影响
Figure 3. Effect of different time on binding rate of sodium glycocholate
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图 4 加酶量对与甘氨胆酸钠结合率的影响
Figure 4. Effect of different enzyme concentrations on binding rate of sodium glycocholate
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图 5 料液比对与甘氨胆酸钠结合率的影响
Figure 5. Effect of different meal-to-water ratios on binding rate of sodium glycocholate
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图 6 卵形鲳鲹酶解产物分子量分布图
Figure 6. Molecular weight distribution of enzymatic hydrolysate of T.ovatus
表 1 5种酶的水解条件
Table 1 Hydrolysis conditions of five kinds of proteases
酶
proteasepH 温度/℃
temperature酶用量/U·g -1
enzyme dosaget/h 料液比/g·mL-1
meal-to-water ratio胰蛋白酶trypsin 8.0 37 木瓜蛋白酶papain 6.0 55 菠萝蛋白酶bromelain 6.0 55 2.000 5 1:4 碱性蛋白酶alcalase 7.0 50 中性蛋白酶neutrase 8.0 50 
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表 2 胰蛋白酶酶解条件优化结果及分析
Table 2 Result of optimizing conditions of enzymolysis by trypsin
试验号
No.因素 甘氨胆酸钠结合率/%
binding rate of sodium glycocholateA：酶解时间/h
reaction timeB：加酶量/U·g-1 enzyme dosage C：料液比/g·mL -1
meal-to-water ratio1 1(2) 1(1 000) 1(1:2) 13.67±0.88 2 1 2(2 000) 2(1:4) 21.73±0.82 3 1 3(5 000) 3(1:6) 11.13±0.87 4 2(3) 1 2 15.78±1.69 5 2 2 3 19.40±0.44 6 2 3 1 8.08±1.15 7 3(4) 1 3 12.07±0.91 8 3 2 1 16.79±0.58 9 3 3 2 13.60±0.98 k1 15.51 13.84 12.85 k2 14.42 19.31 17.03 k3 14.15 10.93 14.20 R 1.36 8.37 4.19 因素主次factor ranking 加酶量(U·g-1) >料液比(g·mL -1) >酶解时间(h) 优化optimization A1 B2 C2 T=132.23
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表 3 方差分析表
Table 3 Analysis of variance
变异来源
source离差平方和
SS自由度
DF均方差
MSF P 显著性
significance levelA 3.10 2 1.55 0.79 0.56 B 108.48 2 54.24 27.81 0.04 * C 27.39 2 13.70 7.02 0.13 误差error 3.90 20 1.95 总变异total variation 142.87 27 注：*. P<0.05为差异显著
Note: *.P<0.05 indicates significant difference.
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表 4 卵形鲳鲹酶解产物不同肽段相对分子质量的分布情况
Table 4 Different peptide fragments′ relative molecular distribution of enzymatic hydrolysate of T.ovatus
分子量范围/kD molecular weight >10 5~10 3~5 <3 积分峰面积百分比/% integral peak area 4.11 8.77 9.82 77.30
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