Reproductive biology of purpleback flying squid (Symplectoteuthis oualaniensis) in the south-central South China Sea in spring and autumn
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摘要:
以2012年9月(秋季)与2013年3月(春季)在南海中南部采集的4 016尾鸢乌贼(Sthenoteuthis oualaniensis)样本为基础,对南海中南部鸢乌贼繁殖生物学特征进行研究分析。结果显示,春、秋两季鸢乌贼雌雄个体比例均为1 : 1;性腺发育为春季Ⅰ、Ⅱ期所占比例较高,秋季Ⅱ、Ⅲ期所占比例较高;性腺成熟度指数(GSI)表现为秋季高于春季,雄性高于雌性的变化规律;在成熟雌性个体中,当胴长 < 141 mm或>150 mm时,GSI均随胴长的增长而升高,其中121~140 mm胴长组GSI最高,高达9.71;春、秋两季鸢乌贼个体绝对繁殖力变动范围分别为63~97 074粒和24~60 378粒,均值分别为8 635粒和10 234粒,秋季鸢乌贼繁殖能力较春季强;鸢乌贼个体绝对繁殖力与胴长、体质量、纯体质量均呈显著正相关关系(P < 0.01)。鸢乌贼成熟卵径范围为400~1 200 μm,均值为(769±261)μm。结果表明,鸢乌贼的卵径小,属异步成熟、分批产卵类型,具有较强的繁殖潜力。
Abstract:We studied the reproductive biology of Sthenoteuthis oualaniensis in the south-central South China Sea using a total of 4 016 specimens collected in September 2012 and March 2013. The sex ratio of S.oualaniensis was about 1 : 1. The proportion of StageⅠand StageⅡ was higher in spring, while that of StageⅡ and StageⅢ was higher in autumn. Gonad somatic index (GSI) was higher in autumn and male. For mature female, when mantle length was less than 141 mm or more than 150 mm, GSI increased with increasing mantle length. The highest GSI was 9.71 when the mantle length was 121~140 mm. The individual absolute fecundity was 63~97 074 eggs and 24~60 378 eggs, the average was 8 635 eggs and 10 234 eggs in spring and autumn, respectively. The fecundity was stronger than that in autumn. The individual absolute fecundity was positively correlated with mantle length, body weight and net body weight very significantly (P < 0.01). The mature egg diameter distribution range was 400~1 200 μm with an average of (769±261) μm. The results indicate that the reproductive strategy characteristics of S.oualaniensis were small eggs, asynchronous mature, batch spawning and high fecundity.
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Keywords:
- Sthenoteuthis oualaniensis /
- fecundity /
- reproductive biology /
- the South China Sea
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广谱抗生素氟甲砜霉素属于第二代氯霉素类动物专用药物,是甲砜霉素的氟化衍生物。氟甲砜霉素不仅体外抗菌活性良好,抑菌效果非常显著,而且使用安全,不会引起人类的再生障碍性贫血。因此,目前氟甲砜霉素已广泛应用于水产养殖业。
在氟甲砜霉素残留检测方面,Nagata等[1]报道了动物肌肉和养殖鱼类肌肉中的氟甲砜霉素残留的HPLC法。虽然该方法灵敏度高,但是耗时多,处理样品过程中化学试剂用量大。Hormazabal等[2]报道了虹鳟组织内氟甲砜霉素的HPLC法,方法亦相当繁琐。在血浆中的药物残留分析方面,Martinsen等[3]报道了大西洋鲑鱼血浆内氟甲砜霉素的液相色谱测定方法。方法耗时,繁琐,进样量为500 μL。van de Riet等[4]应用液相色谱-质谱联用方法对多种鱼类中的氯霉素类药物进行多残留分析,可用于多种水产动物中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素及氟甲砜霉素胺的检测。除HPLC法外,Lavy等[5]曾采用微生物法检测了山羊乳汁和血清中的氟甲砜霉素。
根据前人研究并结合本实验室条件,本研究旨在建立一种准确简便而经济的分析方法,以测定罗非鱼血浆、肌肉和肝脏内氟甲砜霉素残留,以便为水生动物药物动力学和残留研究提供分析手段,进一步为水产养殖合理用药提供依据,并确保水产品食用安全。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
健康奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O.aureus)由广东省罗非鱼良种场提供,平均体重125 g。实验前,在实验室驯养1周。实验水温27℃,所用玻璃水族箱为50 cm×30 cm×30 cm(45 L)。
1.2 药品、试剂及配制方法
氟甲砜霉素标准品,Sigma公司;氯霉素标准品,99.6%,中国生物制品检定所;乙腈,色谱纯,Dikma公司;乙酸乙脂,分析纯;正己烷,分析纯;磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O),为分析纯;氟甲砜霉素水溶性粉,华南农业大学实验兽药厂提供。
标准液配制方法: 准确称取0.050 g干燥恒重的氟甲砜霉素标准品,置于50 mL烧杯中,用适量乙醇溶解后,转移到50 mL容量瓶中,用流动相乙腈-水(27:73,v/v)稀释至刻度,即成1 000 μg·mL-1母液,-20℃避光保存备用。准确称取0.050 g氯霉素标准品,于100 mL烧杯中用流动相溶解,转移到100 mL容量瓶中,配制成500 μg·mL-1溶液,-20℃保存。
磷酸盐缓冲液(pH 7.0)配制: 准确称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.64 g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)27.6 g,分别溶于1 L蒸馏水中配成0.2 mol·L-1的溶液,然后按61:39的比例混合即成。
1.3 药饵配制及给药方法
首先将水溶性粉用蒸馏水溶解,搅拌均匀,配制成5 mg·mL-1的水溶性粉悬浊液。将1 mL注射器输出端切除,抛光,装入0.2~0.3 g空白颗粒饲料(Φ3 mm),然后用定量加液器将配制好的水溶性粉悬浊液加入注射器,每g鱼体重2 μL,相当于剂量10 mg·kg-1鱼体重,使药液充分浸入饲料。小心地将注射器插入食道推动活塞强制灌胃给药,注意观察注射器插入食道的长度,以免将鱼胃捅破。给药后将鱼单独放入一个水盆中观察5 min,将反胃回吐药饵的鱼弃去。
1.4 样品的采集与制备
每尾鱼用2.5 mL静脉注射器(肝素钠抗凝剂处理),尾静脉采血,以3 000 r·min-1离心10 min,分离血浆。将鱼处死,取肝和肌肉(背脊两侧肌肉)。将同一类组织的各样品合并,-20℃保存至分析。
1.5 仪器及色谱条件
日本日立LC-6200高效液相色谱仪,包括紫外检测器,智能泵,反应泵,微处理机,积分仪等;KL512型氮吹仪(配备数控恒温水浴装置);活动砂心过滤装置(包括0.45 μm微孔滤膜);FJ-200高速分散均质机;QL-901涡旋混合器;-20℃低温冰箱;TGL-16 C离心机,74B-4000型电动离心沉淀器;往返振荡器等。
流动相乙腈-水(27:73,v/v),经0.45 μm滤膜过滤后,置于棕色试剂瓶中,超声波脱气10 min,备用;流速1.0 mL·min-1;Waters SpherisorbⓇ ODS2色谱柱(4.6×150 mm,粒度5 μm),柱温25℃;紫外检测波长223 nm。
1.6 样品处理
1.6.1 血浆样品处理方法
精确量取1 mL血浆样品于25 mL试管(具塞)中,加入10 μL氯霉素(500 μg·mL-1)作为内标和1 mL的磷酸缓冲液(pH 7.0),用旋涡混合器涡动混匀1 min。然后加入4 mL乙酸乙酯,用摇床水平机械振荡20 min,静置10 min后吸取上层乙酸乙酯于10 mL离心管中。加入4 mL乙酸乙酯,同样方法重复提取一次,合并乙酸乙酯提取液。60℃水浴氮气蒸干,加入1 mL流动相,再加入0.5 mL正己烷,涡动2 min溶解残留物。16 000 r·min-1离心20 min,弃去正己烷层,过滤,20 μL进样检测。
1.6.2 组织样品处理方法
称取1 g组织(肌、肝预先剪碎)于20 mL玻璃管中,加入10 μL氯霉素(500 μg·mL-1),加入1 mL的磷酸缓冲液(pH 7.0),加入4 mL乙酸乙酯,16 000 r·min-1匀浆10 s,转入10 mL离心管中,于旋涡振荡器上振荡1 min,4 000 r·min-1离心20 min,吸取全部上清液于10 mL具塞离心管中;再用4 mL乙酸乙酯于20 mL玻璃离心管中清洗残留,提取液转移转入10 mL离心管中,再震荡离心合并上清液;其余同“血浆样品处理方法”。
1.7 标准曲线制备
配制系列标准液(含5 μg·mL-1的氯霉素),浓度为16~0.03 μg·mL-1(n=8)。进样量20 μL,依色谱条件,HPLC测定,以氟甲砜霉素的峰高与氯霉素内标的峰高之比值H,对相应的氟甲砜霉素浓度Ci作线性回归,求标准曲线回归方程以及回归系数。
1.8 工作曲线制备
准确量取1 mL血浆或称取1 g组织(肌、肝)于10 mL玻璃管中,加入浓度为800~1.56 μg·mL-1的标准液系列(n=8),使样品中的药物浓度为16~0.03 μ·mL-1,其余同“样品处理”。进样量20 μL,HPLC测定,以氟甲砜霉素的峰高与氯霉素内标的峰高之比值H,对相应的氟甲砜霉素浓度Ci作线性回归,求工作曲线回归方程以及回归系数。
1.9 回收率
求绝对回收率,按下式计算:
绝对回收率=预处理后的加标样品药物峰高/溶于流动相的药物峰高100%。
准确量取1 mL血浆或称取1g组织(肌、肝),分别加入浓度为6.25, 50和400 μg·mL-1的氟甲砜霉素标准液20 μL,其浓度分别为0.125,1和8 μg·mL-1,其余同“样品处理”。HPLC测定氟甲砜霉素浓度,每个浓度平行测定5次,同批测定0.125、1和8 μg·mL-1标准液中的药物峰高,计算绝对回收率。
1.10 精密度
准确量取1 mL血浆或称取1 g组织(肌、肝),分别加入浓度为6.25、50和400 μg·mL-1的氟甲砜霉素标准液20 μL(见表 1),其浓度分别为0.125,1和8 μg·mL-1,其余同“样品处理”。同一批内平行测定5次,记录氟甲砜霉素和氯霉素峰高,计算峰高比值及批内精密度即各变异系数(RSD)。批间精密度: 测定2个批次,各浓度样品平行测定3次,计算批间精密度(RSD)。
表 1 血浆、肌肉和肝脏样品工作曲线Table 1. The calibration curves for florfenicol in plasma, muscle and liver samples样品
sample线性范围/μg·mL-1
concentration range标准曲线回归方程
calibration equation相关系数
R血浆 plasma 0.03~16 C血=2.729 H-0.06 0.9998 肌肉 muscle 0.03~16 C肌=2.939 H-0.1121 0.9995 肝脏 liver 0.03~16 C肝=2.8336 H-0.1326 0.9986 1.11 药物稳定性
将浓度分别为8和1 μg·mL-1的工作标准液保存在0~5℃冰箱中,在48 d内对其进行4次测定。0.125 μg·mL-1的标准液在2 d内2次测定。
将添加浓度为1 μg·mL-1的罗非鱼血浆、肌肉和肝脏样品提取液放置在实验台上,分别于第2天和第11天测定。记录峰高值,计算实测浓度,比较药物的浓度变化情况。
2. 结果
2.1 氟甲砜霉素的色谱行为
在上述色谱条件下,基线走动平稳,血浆、肌肉和肝脏样品中虽有杂质峰出现,但无干扰峰,并且与药物分离良好(见图 1)。
2.2 标准曲线和灵敏度
基线峰高(噪音)最大值为0.0193 mAU,按信噪比(S/N)为2计算,得出仪器检出限为0.0146 μg·mL-1。标准曲线为Ci=2.797H-0.0339,相关系数R=0.9999,线性范围为0.03~16 μg·mL-1。根据线性范围,确定本方法的检出限为0.03 μg·mL-1。
2.3 样品工作曲线(药物HPLC定量标准曲线)
各样品工作曲线测定结果见表 1,线性范围为0.03~16 μg·mL-1,相关系数范围为0.9986~0.9998,线性关系满足分析要求。
2.4 回收率
各样品在3个浓度水平的平均回收率结果见表 2,其中血浆的平均回收率为92.86%~96.13%,肌肉的平均回收率为91.70%~96.09%,肝脏的的平均回收率为89.16%~89.52%,结果能够满足分析要求。
表 2 不同组织样品在3个浓度水平的平均回收率(平均值±标准差%)Table 2. The recovery of florfenicol in the plasma, muscle and liver samples of tilapia浓度/μg·mL-1
concentration血浆
plasma肌肉
muscle肝脏
liver0.125 94.79±2.81 91.70±5.41 89.52±4.32 1 96.13±2.35 96.09±1.91 89.17±3.97 8 92.86±1.22 92.72±2.59 89.16±3.71 2.5 精密度
各样品在3个浓度水平的批内精密度和批间结果分别见表 3和表 4,批内和批间精密度最大均不超过7.7%,符合分析要求。
表 3 不同组织样品中药物在3个浓度水平的批内精密度(RSD%)Table 3. The intra-batch precision of a liquid chromatographic method to determine florfenicol in the plasma, muscle and liver samples of tilapia浓度/μg·mL-1
concentration血浆
plasma肌肉
muscle肝脏
liver0.125 3.75 6.45 5.61 1 2.21 3.07 6.55 8 2.37 2.65 4.71 表 4 不同组织样品中药物在3个浓度水平的批间精密度(RSD %)Table 4. The inter-batch precision of florfenicol in the plasma, muscle and liver samples of tilapia浓度/μg·mL-1
concentration血浆
plasma肌肉
muscle肝脏
liver0.125 6.27 6.26 2.92 1 2.11 4.39 7.71 8 2.39 4.46 3.72 2.6 药品稳定性
对于标准液,在评价期内,以第1天测定结果为标准,其他各次测定结果与之相比较,计算出药物的浓度变化,结果在0.5%~1.9%之间。对于血浆、肌肉和肝脏样品,药物浓度的变化率分别为1.4%、0.8%和5.8%。
表 5 工作标准液中氟甲砜霉素的稳定性Table 5. Stability of florfenicol in the working standard solutions(0~5℃)浓度/μg·mL-1
concentration变化率/% change percent 第2天 第46天 第48天 8 1.3 1.2 1.2 1 1.0 1.9 0.5 0.125 1.5 表 6 罗非鱼样品中氟甲砜霉素的稳定性Table 6. Stability of florfenicol in the plasma, muscle and liver samples fortified at nominal concentrations of 1 μg·mL-1 florfenicol样品
sample浓度/μg·mL-1 concentration 变化率/%
change percent第2天 第11天 血浆 1.006 1.020 1.4 肌肉 1.049 1.107 5.8 肝脏 1.056 1.064 0.8 3. 讨论
水产动物体内药物含量的分析测定方法有微生物测定法、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法、薄层色谱法、分光光度法、比色法和同位素法等。目前,HPLC法应用最多。如Tyrpenou等[6],Meinertz等[7]和Samuelsen等[8]学者分别在研究盐酸沙拉沙星,OTC和Romet30在金头鲷、银大麻哈鱼和大西洋鲑体内的分布和消除规律或药物动力学时,均采用了HPLC法。
本研究建立的HPLC法具有进样量(20μL)少,所需样品量(1g)少,试剂消耗少和样品预处理简便的特点,结果是满意的。
(1) 内标法定量准确。在HPLC法分析过程中,由于样品和内标是混合在一起注入色谱柱的,因此只要混合溶液中被测组分与内标的量的比值恒定,进样量的变化不会影响定量结果。用外标法虽然操作简便,但是要求满足的条件较高,要求进样量(每次应一致)准确及实验条件恒定。而内标法抵消了上样体积,乃至流动相、检测器等条件的影响,因此比外标法精确。
(2) 方法灵敏度较高,相关系数较高,线性范围较宽。本方法的检出限为0.03 μg·mL-1。标准曲线相关系数R为0.9999,各样品工作曲线相关系数在0.9986~0.9998之间,线性范围均为0.03~16 μg·mL-1。标准曲线以及各样品工作曲线相关系数较高。线性范围较宽,其高低浓度相差达2个数量级,表明该方法具有较宽的测定范围。
色谱法一般要求相关系数大于0.99,药物动力学实验方法要求线性范围为10-2。本方法标准曲线和各样品工作曲线的相关系数在0.9986~0.9999之间,线性范围为0.03~16 μg·mL-1,完全满足分析要求。
(3) 方法回收率高。Vue等[12]对多种淡水鱼血浆研究发现,药物的回收率为84%~104%。在鸡、猪、牛和五条鰤鱼肌肉中,氟甲砜霉素的回收率为74.5%~81.5%[1]。Hormazabol等[2]的结果为,肌肉和肝脏药物的回收率分别为99%~105%和100%~107%。van de Riet等[4]应用液相色谱-质谱连用多残留检测多种鱼类中的氯霉素类残留,鲑组织中氟甲砜霉素胺与氟甲砜霉素回收率分别为71%和107%。
本实验各样品在3个浓度水平的平均回收率为(89.16±3.71)%~(96.13±2.35)%,说明方法准确度良好。与血浆和肌肉相比,肝脏中的回收率相对稍低,原因在于作为代谢器官,肝脏中的成分比较复杂,药物的回收率受杂质峰的影响比较大。这与王群等[9]的报道结果一致。
(4) 精密度良好。Vue等[12]多种淡水鱼血浆氟甲砜霉素精密度1.4%~8.1%。鸡血浆氟甲砜霉素含量为0.125、1和8 μg·mL-1,日内变异系数分别为5.1%、2.1%和3.5%;日间变异系数分别为6.2%、4.1%和3.4%[10]。鲤血浆中诺氟沙星的绝对回收率85.96%,日内和日间精密度均小于10%[11]。
药物动力学实验要求精密度在10%以内(检测限为μg·mL-1水平时)。本实验的批内和批间精密度均在8%以下,为2.11%~7.71%,说明方法可靠性较高,完全满足分析要求。
(5) 药物稳定性良好。在一定的保存时间内,对配制好的标准液进行测定,其结果变化不大。在本次实验期内,药物在标准液中浓度变化范围为0.5%~1.9%。Vue等[1]报道,14 d内,工作标准液(浓度为0.1、1和10 μg·mL-1)中药物的浓度变化不大于1.9%。与本研究结果一致。
本实验罗非鱼血浆、背肌和肝脏样品中药物浓度在10 d后均稍有升高,其范围在0.8%~5.8%之间。Vue等[1]在研究中发现,7 d内,添加浓度为1 μg·mL-1的血浆样品药物的回收率升高幅度小于8%,其原因是样品存放时间长,血浆内的(一些)未知化合物会发生分解,产生杂峰干扰。并且指出,利用HPLC法分析血浆样品,最好在提取后12 h以内进样分析。结果与本实验一致。
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