Molecular cloning and expression of cyclin T gene from black tiger shrimp (Penaeus monodon)
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摘要:
真核生物的转录调控多发生在转录的延伸阶段，细胞周期蛋白T(cyclin T)是细胞转录的重要调控因子。文章利用RACE技术获得斑节对虾(Penaeus monodon)cyclin T(Pmcyclin T)cDNA全长，其全长为3 421 bp，其中开放阅读框(ORF)3 135 bp，编码1 044个氨基酸；生物信息学分析显示，该氨基酸序列含有一个周期蛋白家族特有的CYCLIN保守区，并含有N-糖基化位点和磷酸化位点；经BLAST同源性分析显示，细胞周期蛋白T编码的蛋白与柑橘木虱(Diaphorina citri)、切叶蚁(Acromyrmex echinatior)等多种节肢动物有很高的同源性；利用qRT-PCR技术对Pmcyclin T在不同组织及卵巢发育各时期的mRNA水平的表达谱进行了研究。结果表明，细胞周期蛋白T在斑节对虾的心、卵巢等7个组织中均有表达，其中卵巢中表达量显著高于其他组织(P＜0.05)；在卵巢发育各时期中，细胞周期蛋白T在Ⅲ期表达量最高。
Abstract:Cyclin T is a critical factor that stimulates the process of transcription elongation. We obtained the full-length cDNA sequence of cyclin T from black tiger shrimps (Penaeus monodon)(denoted as Pmcyclin T) by RACE PCR. The cDNA of Pmcyclin T was 3 421 bp, encoding a polypeptide of 1 044 amino acids. Bioinformatics analysis shows that the amino acid sequence contained a CYCLIN conserved region of a periodic protein family as well as N-glycosylation sites and phosphorylation sites. The results of Blast and phylogenetic analyses suggest that Pmcyclin T shared very high homology with other kinds of arthropod such as Diaphorina citri, Acromyrmex echinatior and so on. Besides, we measured the mRNA expression of Pmcyclin T in seven tissues by real-time PCR. Expression was highest in the ovary and moderate in the intestine, brain and so on. While at different stages of ovary, Pmcyclin T was highest expressed at Stage Ⅲ, suggesting that Pmcyclin T might play an important role in ovary development of black tiger shrimp.
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Keywords:
- Penaeus monodon /
- cyclin T /
- gene clone /
- express analysis /
- ovary development
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细胞周期蛋白T(cyclin T)是细胞转录的重要调控因子，和细胞周期蛋白依赖性激酶9(cyclin dependent kinase 9，CDK9)等组成正性转录延长因子b(positive transcription elongation factor b，P-TEFb)，参与细胞转录延伸反应的正性调控。cyclin T和CDK9组成的P-TEFb协同CDK8、cyclin C、cyclin K、RNA聚合酶Ⅱ(POLR2A)、负性调控因子(DSIF、NELF)等共同调控细胞转录，保证细胞功能的正常发挥[1-4]。目前已知的cyclin家族成员以A~J进行编号，共有约15种[5]，其中cyclin T作为转录的重要调控因子，在艾滋病、心肌肥大、肿瘤等疾病中有较深入的研究[1]。Cyclins不仅是CDKs的激活亚基，而且是复合体(cyclins/CDKs)与其他基团或者调节因子直接作用时的识别效应器[6]。1995年，人们首先从果蝇中分离纯化出P-TEFb，通过实验进一步确认了其成分主要是cyclin T和CDK9等[4]。近几年的研究表明，cyclin T是胚胎正常发育、细胞生长与分化以及艾滋病病毒(HIV-1)转录复制等过程必不可少的关键因子之一，其功能和作用机理是目前研究的热点。随着细胞周期蛋白研究的不断广泛和深入，cyclin T基因在一些物种中相继被克隆出来，如人(Homo sapiens，AAC39638.1)、小鼠(Mus musculus，AAD17205.1)、果蝇(Drosophila melanogaster，AAC73052.1)、斑马鱼(Danio rerio，XP_ 005167592.1)和印度跳蚁(Harpegnathos saltator，EFN77646.1)等，但该基因在对虾中尚未见报道。
斑节对虾(Penaeus monodon)是世界三大对虾养殖品种之一，人工育种过程中广泛采用的剪除单侧眼柄催熟卵巢的技术会导致亲虾死亡率高和产卵质量低等问题[7-11]。对卵巢成熟促进因子(Mature Promoting Factor，MPF，cyclin B/CDC2)的研究揭示了细胞周期蛋白在甲壳动物卵巢发育中具有重要的潜在研究价值[12-13]。此实验通过RACE技术首次在对虾中获得了cyclin T基因的cDNA全长，并利用生物信息学分析了基因的结构，对基因的特征进行了研究；通过实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了cyclin T基因在不同组织和卵巢发育各个时期的mRNA水平的相对表达谱，以为进一步揭示细胞周期蛋白在斑节对虾卵巢发育中的作用机理提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验用斑节对虾均购自于海南三亚，约80~200 g，水泥池中暂养3 d后取卵巢、脑、胸神经、肝胰腺、心、血淋巴和肠等组织。所取各组织保存于液氮中带回实验室。
1.2 cDNA文库的构建与EST序列分析
从3只性成熟的斑节对虾中解剖获得卵巢及眼柄等组织，使用ZAP-cDNA合成试剂盒和ZAP-cDNA GigapackⅢ Gold cloning kit试剂盒(Stratagene，USA)构建斑节对虾cDNA文库并利用T3引物随机测序。对获得的6 782个测序结果进行BLAST分析，结果显示一条3 232 bp的EST序列与蝇蛹金小蜂(Nasonia vitripennis)cyclin T基因高度同源。
1.3 总RNA提取与逆转录
取液氮中保存的卵巢组织按Trizol (Invitrogen，USA)说明书提取斑节对虾总RNA，溶解于DEPC处理水，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，紫外分光光度计检测浓度，以aligo-dT/adaptor(5′-GGCCACGCGACTAGTAC(T)16-3′)为反转录引物在M-MLV反转录酶(Promega，USA)的作用下合成cDNA第一链。
1.4 基因的克隆与测序
对获得的EST序列进行验证后，根据验证的片段设计基因特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)和半巢式PCR(semi-nest PCR)技术扩增斑节对虾cyclin T基因的3′和5′未知序列。3′RACE中第一轮PCR使用引物T3SP1(5′-CAAAAGGACCTGTTTGGAGGCACAT-3′)和接头通用引物AP(GGCCACGCGACTAGTAC)[5]；第二轮PCR使用正向引物T3SP2(5′-GACCGCCTTCGTCCTGAAAAGGAATC-3′)和接头通用引物AP[5]。5′RACE中以T5SP1(5′-CAGGGTCTGTAGCAAAATGTTCTCA-3′)和oligo-dG(5′-GGGGGGGGGGGGGGG-3′)为引物进行第一轮PCR，以T5SP2(5′-CGGTGAAAACGGGTGAACGGATGAT-3′)和oligo-dG为引物进行第二轮PCR[5]，PCR产物送深圳华大基因进行测序。
1.5 序列分析
使用在线软件Clustal W(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)对测序片段进行比对拼接；使用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上的ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和BLAST X程序分析起始密码子和终止密码子。
氨基酸序列的预测利用Predict Protein (EMBL-Heidelberg)；序列同源性比对和相似性搜索用NC BI网站上的BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行；用Bioedit软件进行多序列比对；信号肽预测用SingalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序；蛋白结构域分析用SMART 4.0(http://smart.embl-heidelberg.de/)在线程序和ScanProsite(http://www.expasy.ch/tools/scanprosite/)在线程序；糖基化位点预测采用NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)程序；磷酸化位点预测采用NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)程序；3D结构预测和查看采用phyre2软件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)、Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org)和FirstGlance in Jmol(http://bioinformatics.org/firstglance/)；核苷酸序列同源性和相似性分析用MatGAT 2.01软件；采用MEGA 5.0软件以邻位相连法(neighbor-joining，NJ)构建进化树[5]。
1.6 qRT-PCR相对定量分析Pmcyclin T mRNA的组织和卵巢发育时相表达特征
提取健康斑节对虾不同组织(脑、胸神经、肝胰腺、心、卵巢、血淋巴和肠)和不同发育时期卵巢[11]的总RNA，使用引物reT-F(5′-TTTAGATGCCGCAGTGTTAGAA-3′)和reT-R (5′-TTTGGCTCAGGAGGTTTACG-3′)扩增目的基因，rEF-F(5′-AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT-3′)和rEF-R(5′-CGTGGTGCATCTCCACAGACT-3′)扩增EF-1α基因作为内参[5]，实验数据采用相对ΔCT法(2-ΔΔCT 法)分析Pmcyclin T基因在斑节对虾各组织和卵巢不同发育时期的相对表达量，分别以脑中的表达量和卵巢发育Ⅱ期表达量为对照样本。运用统计学软件SPSS 19.0进行相对独立的单因素方差分析，结果以“平均值±标准误”(X±SE)表示，P < 0.05为差异显著[5]。
2. 结果与分析
2.1 Pmcyclin T基因cDNA序列信息
通过5′和3′RACE技术获得的序列经拼接得到Pmcyclin T cDNA全序列(图 1)。全长3 421 bp，包括3 135 bp的开放阅读框(ORF)，14 bp的5′非编码区(UTR)和271 bp的3′UTR，3′UTR含有1个多聚腺苷酸化信号和30 poly(A)+(图 1)。预测Pmcyclin T具有1 044个氨基酸，理论相对分子量约为116.8 kD，理论等电点(pI)为9.45。BLAST同源性分析及SMART分析显示，Pmcyclin T氨基酸序列包含1个保守的CYCLIN同源结构域(40~139 aa，图 1)；利用SignalP 3.0在线软件未检测到Pmcyclin T含有信号肽序列；对糖基化位点(N-Glycosylation sites)和磷酸化位点(Phosphorylation sites)分析显示Pmcyclin T含有6个糖基化位点，有103个潜在的磷酸化位点[包括6个酪氨酸(Tyr)位点，79个丝氨酸(Ser)位点，18个苏氨酸(Thr)位点]。选择哺乳类，鸟类，两栖类，爬行类，鱼类，和节肢动物类等物种的cyclin T氨基酸序列进行多重比对，结果显示Pmcyclin T与柑橘木虱(Diaphorina citri)、爪蟾(Xenopus laevis)、密西西比鳄(Alligator mississippiensis)和斑马鱼等物种的cyclin T相似，一致性分别是75%，68%，72%和57%，保守结构域在不同物种中较为保守(图 2)。系统进化树显示，斑节对虾cyclin T氨基酸序列首先与柑橘木虱、蝇蛹金小蜂、印度跳蚁等聚为一支，后与斑马鱼、原鸡(Gallus gallus)、爪蟾、小鼠和人等聚为一支(图 3)。Pmcyclin T三级结构(图 4)呈细长型，包含2个重复，每个重复为5个α螺旋结构，2个重复之外是N端和C端短螺旋结构。斑节对虾不同cyclins以及不同物种cyclin T在蛋白质三级结构(图 4)较为保守，区别在于折叠和螺旋的长短有所不同。
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图 1 Pmcyclin T的全长cDNA和氨基酸序列特征展示图Pmcyclin T cDNA全长为3 421 bp，包含3 135 bp的开放阅读框，编码1 044个氨基酸(Genbank注册号为KP676143)；预测的CYCLIN结构域(40~139 aa)和PEST基序(568~606 aa，953~974 aa)在图中用标签和阴影标示Fig. 1 A schematic diagram of full-length cDNA of Pmcyclin TThe full-length of Pmcyclin T contains an ORF of 3 135 bp encoding 1 044 amino acids (accession No. KP676143). The predicted CYCLIN BOX domain (positions 40~139 aa) and PEST motifs (positions 568~606 aa, 953~974 aa) in the deduced Pmcyclin T protein were indicated by label and shading.![]()
图 2 Pmcyclin T基因与其他物种cyclin T基因氨基酸序列保守结构域的多重比对保守cyclin结构域为方框内氨基酸序列；*.一致性；.或者：.相似性Fig. 2 Multiple sequence alignment of Pmcyclin T with cyclin T from other animalsThe nucleotide sequences in the boxes are conserved domains.Identical and similar sites were shown with sparks (*) and dots(. or : ), respectively.![]()
图 3 基于cyclin T氨基酸序列利用MEGA 5.0软件构建的NJ系统进化树Fig. 3 NJ phylogenetic tree using MEGA 5.0 software based on cell cyclin T amino acid sequence![]()
图 4 使用phyre和FirstGlance in Jmol在线预测蛋白质3D结构a. Pmcyclin T的三级结构；b. 已知斑节对虾cyclins的三级结构，PmCycA是cyclin A(Genbank注册号ACH72071.1)，PmCycE为cyclin E(Genbank注册号AGW23550.1)，PmCycB为Pmcyclin B(Genbank注册号ABM54576.1)，PmCycH为cyclin H(Genbank注册号AGP03382.1)；c. 其他物种cyclin T的三级结构Fig. 4 Tertiary structure of protein speculated by onlian software phyre and FirstGlance in Jmola. tertiary structure of Pmcyclin T; b. tertiary structure of cyclins of P.monodon that can be obtained from GenBank. PmCycT is cylin T; PmCycA is P.monodon cyclin A (GenBank accession No. ACH72071.1);PmCycE is P.monodon cyclin E (GenBank accession No. AGW23550.1);PmCycB is P.monodon cyclin B (GenBank accession No. ABM54576.1);PmCycH is P.monodon cyclin H (GenBank accession No. AGP03382.1);c. tertiary structure of cyclins2.2 Pmcyclin T的组织差异分析
利用qRT- PCR技术对Pmcyclin T在斑节对虾中组织差异表达进行检测和分析(图 5)，可知Pmcyclin T在不同组织有不同程度的表达。Pmcyclin T在卵巢中的表达量最高，肠、血淋巴、心、肝胰腺和胸神经之间差异不显著，在脑中的表达量显著低于卵巢和肠中的。
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2.3 卵巢发育各时期Pmcyclin T的表达
利用qRT-PCR技术对斑节对虾卵巢发育各个时期Pmcyclin T的表达量进行检测(图 6)，Pmcyclin T在卵巢发育的第Ⅲ期相对表达量显著高于其他时期，在Ⅳ期及Ⅴ期中几乎没有表达。
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图 6 Pmcyclin T卵巢发育时相表达Ⅰ.卵原细胞期；Ⅱ.核染色质期；Ⅲ.周边核仁期；Ⅳ.卵黄囊期；Ⅴ.成熟期Fig. 6 Relative expression level of Pmcyclin T at different developmental stages of ovaryⅠ. ovogonium stage; Ⅱ. chromatin nucleolus stage; Ⅲ. perinucleolus stage; Ⅳ. yolky stage; Ⅴ. cortical rod stage3. 讨论
cyclin T是细胞转录调控中的重要因子，对于细胞中的转录调控和艾滋病、肿瘤发生等有重要意义[14-16]。越来越多的研究表明，真核生物的转录调控多发生在RNA聚合酶Ⅱ的延伸阶段[17]，cyclin T作为活化亚基与CDK9组成P-TEFb复合体[18]。P-TEFb是目前已知的唯一正性通用转录延伸因子，可以磷酸化RNA聚合酶Ⅱ的C端结构域(CTD)和负性延伸因子(NELF)以及DRB敏感诱导因子(DSIF)，使停止的延伸反应得以进行[19-20]。在细胞内使用RNA干扰(RNAi)技术敲除cyclin T能够抑制HIV-1基因的表达和复制而不会使细胞凋亡[21-22]。有研究表明，人外周血单核细胞在分化为巨噬细胞时，cyclin T1的表达水平显著增加，分化过程后期，其水平降低。研究发现利用PMA和PHA对T淋巴细胞激活，cyclin T的蛋白水平也会显著增加[23-25]。除此之外，在模式生物秀丽新小杆线虫(Caenorhabditi elegans)胚胎中使用RNAi研究发现，P-TEFb与早期胚胎发育相关的众多基因的表达调控有密切关系[26]。对cyclin T的分析将有助于阐述卵母细胞和卵巢发育机制，以及真核细胞转录调控机制。
文章利用RACE技术从斑节对虾中克隆获得了全长为3 421 bp的cyclin T cDNA全序列，其中ORF片段3 135 bp，编码1 044个氨基酸。该氨基酸序列含有周期蛋白家族特有的CYCLIN保守区(40~139 aa)，并具有N-糖基化位点及潜在磷酸化位点，说明目的基因是CYCLIN家族成员。多序列连配发现这些特征区域都位于保守区域内。同源性比对发现Pmcyclin T基因预测的氨基酸序列与柑橘木虱、切叶蚁等多种节肢动物具有高度同源性(E-value分别为1e-131、4e-130)，E小于0.005则说明序列间具有高度的同源性，是同源序列[22]。系统树研究发现Pmcyclin T与节肢动物聚为一支，说明Pmcyclin T为cyclin T家族成员之一，并与节肢动物的cyclin T具有相同或者相似的功能。其三级结构为细长型，包含2个典型的5个α螺旋的重复，重复两端是N端和C端的位于外侧的螺旋，而已知的斑节对虾cyclins基因的三级结构都具备这些典型的特点，比较人类中不同cyclins时也发现了这一特点[6]，说明同一物种的cyclins在结构特征上具有一定的保守性。该研究对不同物种的cyclin T的三级结构进行比较，也发现了这一典型特点(图 4)。从三级结构与一级结构的相似性及保守性上可以看出cyclin T结构域在不同物种中具有的保守性，从而揭示了cyclins功能的重要性以及不同cyclins之间可能具有相对紧密的关系。
P-TEFb在细胞活化、增殖、分化过程中起到关键的作用。cyclin T经SKP2作用泛素化途径降解直接影响P-TEFb整体的降解速度和生物学功能的发挥[27]。在对人类细胞发育的研究时发现，P-TEFb复合体中cyclin T的蛋白水平在整个细胞周期进程中几乎没有变化，CDK9在整个细胞周期中也是持续表达[28]。
利用qRT-PCR技术发现Pmcyclin T在所检测的斑节对虾各组织(脑、胸神经、肝胰腺、心、卵巢、血淋巴和肠)中均有表达，除在卵巢中相对表达量显著高于其他组织外，其余组织中的表达无显著差异，说明该基因可能在卵巢中具有重要作用。在对人类的cyclin T研究中发现了类似的结果，其在人类的各种组织中的表达也是保守的。可见，P-TEFb作为基础转录调控因子，在生物体的发育中起着至关重要的作用。在对虾卵巢中的相对高表达说明Pmcyclin T在卵巢发育相关基因转录调控中可能具有重要的作用。Pmcyclin T在卵巢发育的各个时期表达量有所不同，说明Pmcyclin T可能与卵巢发育的时期转换有关[29]。Pmcyclin T在卵巢发育Ⅲ期(卵巢从未成熟到成熟的关键时期)相对表达量最高，说明Pmcyclin T和卵巢的成熟有密切的关系。Cyclin T在其他虾蟹卵巢中的研究尚未见报道，其他cyclins在虾蟹中的研究多见于cyclin B，其在不同物种中的表达有差异，但大多在卵巢启动发育到成熟之间表达量最高或呈逐渐上升的趋势[30-31]。
从研究结果可以推断Pmcyclin T可能参与了斑节对虾卵巢的发育调控，但其在斑节对虾卵母细胞中的细胞定位以及在胚胎发育中的作用还有待于进一步研究。
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图 1 Pmcyclin T的全长cDNA和氨基酸序列特征展示图
Pmcyclin T cDNA全长为3 421 bp，包含3 135 bp的开放阅读框，编码1 044个氨基酸(Genbank注册号为KP676143)；预测的CYCLIN结构域(40~139 aa)和PEST基序(568~606 aa，953~974 aa)在图中用标签和阴影标示
Figure 1. A schematic diagram of full-length cDNA of Pmcyclin T
The full-length of Pmcyclin T contains an ORF of 3 135 bp encoding 1 044 amino acids (accession No. KP676143). The predicted CYCLIN BOX domain (positions 40~139 aa) and PEST motifs (positions 568~606 aa, 953~974 aa) in the deduced Pmcyclin T protein were indicated by label and shading.
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图 2 Pmcyclin T基因与其他物种cyclin T基因氨基酸序列保守结构域的多重比对
保守cyclin结构域为方框内氨基酸序列；*.一致性；.或者：.相似性
Figure 2. Multiple sequence alignment of Pmcyclin T with cyclin T from other animals
The nucleotide sequences in the boxes are conserved domains.Identical and similar sites were shown with sparks (*) and dots(. or : ), respectively.
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图 3 基于cyclin T氨基酸序列利用MEGA 5.0软件构建的NJ系统进化树
Figure 3. NJ phylogenetic tree using MEGA 5.0 software based on cell cyclin T amino acid sequence
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图 4 使用phyre和FirstGlance in Jmol在线预测蛋白质3D结构
a. Pmcyclin T的三级结构；b. 已知斑节对虾cyclins的三级结构，PmCycA是cyclin A(Genbank注册号ACH72071.1)，PmCycE为cyclin E(Genbank注册号AGW23550.1)，PmCycB为Pmcyclin B(Genbank注册号ABM54576.1)，PmCycH为cyclin H(Genbank注册号AGP03382.1)；c. 其他物种cyclin T的三级结构
Figure 4. Tertiary structure of protein speculated by onlian software phyre and FirstGlance in Jmol
a. tertiary structure of Pmcyclin T; b. tertiary structure of cyclins of P.monodon that can be obtained from GenBank. PmCycT is cylin T; PmCycA is P.monodon cyclin A (GenBank accession No. ACH72071.1);PmCycE is P.monodon cyclin E (GenBank accession No. AGW23550.1);PmCycB is P.monodon cyclin B (GenBank accession No. ABM54576.1);PmCycH is P.monodon cyclin H (GenBank accession No. AGP03382.1);c. tertiary structure of cyclins
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